Способ выделения неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей Советский патент 1979 года по МПК C07G7/03 C12D13/10 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ

ПИРОФОСФАТАЗЫ ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ

Изобретение относится к ферментной промышленности, а именно к способу выделения неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей. Известен.способ вьщеления неооганической пирофосфатазы из пекарских -дрожжей, предусматривающий плазмолиз дрожжевых клеток в толуоле, экстракцию водой, фракциош1рование сульфатом аммония, обессоливание и фракционирование спиртом 1. Выход фермента составляет 12%, активност 645 Е. Наиболее близким к предлагаемому являет ся способ выделения неорганической пирофосф тазы из пекарских дрожжей, предусматривающи плазмолиз дрожжевых клеток, фракционирование сульфатом аммония, обессолива1ше и хроматографирование на полисахаридном носителе 2. Способ позволяет получить неорганическую фосфатазус активностью726-790 F, выход фермента составляет 24%. Целью изобретения является повышение вмхода фермента, а также упрощение процесса выделения. Цель достигается тем, что препарат, полученньв1 после плазмолиза дрожжевых клеток в толуоле, экстракдш белков водой, фракцконирова1шя сульфатом аммония и обессолив ания, хроматографируют на полисахаридном носителе, содержащем в качестве боковой цепи алкиламин. Использование такого носителя основано на специфическом свойстве неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей - ее гидрофобнЬсти. Для повышения удельной активности полученного фермента его подвергают дополнительной очистке гельфильтрацией на ультрагеле А с А 44. Пример. 140 г пекарских дрожжей подвергают плазмолизу в толуоле в течение 4 ч при 40-45° С, прибавляют 100 мл воды и оставляют на ночь при 4°С. Водный слой отделяют и центрифугируют. К надосадочной жидкости прибавляют сульфат аммо1шя до насыщения 0,5, центрифугируют, осадок отбрасывают, к

надосадочной жвдкосга.прибавляют сульфат аммония до насыщения 0,7. Пол){енльш после центрифугирования осадок обессоливают диализом против 0,025 М трисового буфера, рН 7,2. Обессоленный белок в 1000 мл трисового буфера рН 7,2 наносят на колонку с 60 мл гексаметилендиаминсефарозы (диаметр колонки 1,5 см). Добавле1ше к элюирующему буферу хлористого натрия приводит к десорбции фермента с колонки. Десорбированную неорганическую пирофосфатазу .подвергают гельфильтрации на колонке с ультрагелем А с А 44.

Удельная активность полученного препарата 710 Е, выход - 50%.

П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно примеру I, используя в качестве полисахаридного носителя ультрагеля А с А 44. Хроматогра.фирование проводят в колонке диаметром 1 см с 8 мл ультрагеля в 1 мл 0,025 М трисового буфера, рН 7,2.

Удельная активность полученного препарата 774 А, выход - 70%. ,

Данный способ позволяет получить неорганическую пирофосфатазу из пекарских дрожжей

С ВЫСОКИМ выходом и упростить процесс выделения фермента за счет уменьшения количества стадий.

Формула изобретения

Способ выделения неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей, предусматривающий плазмолиз дрожжевых клеток, фракционирование сульфатом аммония, обессоливание и хроматографирование на полисахаридном носителе, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и упрощения процесса, хроматографирование проводят на полисахаридном носителе с алкиламином в качестве боковой цепи с последующей гельфильтрацией на ультрагеле А с А 44.

Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе

2.Cooperman B.S., Chin N. J., Bruckmann R. Bunick J.J., Mekenna J.B., Biochemistry, 1973, 12 1965.