Способ получения эндонуклеазы рестрикции Н @ а I Советский патент 1990 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/21 

Изобретение относится-к технической биохимии и биотехнологии, в частности к производству ферментов из микробных клеток, и может быть использовано для различных молекулярно- биояогических и генноинженерных работ .

1елью изобретения янчяется упрощение процесса и повышения качества целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Биомассу Haemophilu;; haemolyticus (ВКГГМ В-4070) разрушают с помощью ультразвука, затем к кле14)чному гомо- генатудобавляют концентрированную;

смесь полиэтиленгликоля и декстрана в калийфосфатном буфере рН 7,6, до конечной концентрации в смеси поли- этиленгликоля 7,0%, декстрана 2,0% и NaCl до концентрации 38 - 45 мМ. После тщательного перемещ11вания смесь центрифугируют при 5 - 10000 g в течение 10 - 20 мин, верхнюю полиэти- ленгликолевую фазу, содержащую целевой продукт, собирают, разбавляют буфером и наносят на колонку с фосфо- целлюлозои Р11. Проводят элюц}1ю. белков линейным градиентом концентрации NaCl от 0,2 до 1,0 М в буфере. Фрак- 1ЩИ, содержащие энцонуклеазу Шла I, собирают и концентрируют диализом

О5

ОО 4

;о

против 50%-ного раствора глицерина в буфере. Выход фермента из 10 г клеток 40 - 60 тыс.ед.акт. Хранится препарат при температуре минус (20+2) С в течение 12 мес без снижения активности. Свободен от значительных примесей неспецифических нуклеаз: обработка ДИК фага Д не менее чем 15- кратным избытком фермента в течение длительного времени (17 - 20 ч) при 37°С не изменяет спе11}{фической картины гидролиза .

Пример 1. Все операции по очистке Фермента проводят при (414) С AKTUiiH- CTb рестриктазы Hha 1 тестируют методом гидролиза ДНК фага в типичных условиях с последую1 и1м разделением полученных фрагментов электрофорезом в 1,8%-ной агарозе. За единицу активности принимают мини- мпльиое количество фермента, необходимое для полного специфического гидролиза 1 мкг ДНК фага Д в течение 1 ч при (37±1)°С.

10 г замороженной биомассы Наето- philus haemolyticus ВКПМ В-4070 суспендируют в 20 МП 10 мМ калийфосфат- ного буфера рН 7,6, содержащего 7 i 2-меркаптоэтанол, О, 1 кФ1 ЭДТА (буфер А), добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1% и обрабатывают ультразвуком при 20 кГц и амплитуде (17±2) мкм в течение 45 с 10 раз с интервалом 45 с для охлаждения смеси. К клеточному гомогенату при постоянном перемешивании на магнитной мешалке приливают 30 мл смеси содержащей 21% полиэтиленгликоля и 67, декстран, 3,45 мп 1 м раствора NaCl (до конечной концентрации 38 ь и 26,55 мл деионизованной воды. Смес продолжают перемешивать в течение 15 мин, затем .центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Верхнюю фазу отбирают, разбавляют в 2,5 раза буфером А и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р11 (1,5x30) см, уравновешенную буфером А. Колонку промывают 50 МП 0,2 М NaCl в буфере А, фермент элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0,2 до 1,0 II в буфере А. Общий объем градиента 200 МП. Скорость нанесения на колонку, промывки и элюции 20 мл/ч. Собирают фракции по 5 мп и анализируют на активность рестриктазы Hha I отбирают аликвоты для испытания 5 мкл. Фракции, содержащие

0

5

0

5

0

5

0

5

целевой продукт, которые злюируются в диапазоне концентра1Ц1Й NaCl 0,52 - 0,62 М, об1,елии:.-1от (V 25 мп), переносят в диализный мешок и диализу- ют против 300 - 350 мп 50%-ного раствора Глицерина в буфере А. Время диализа 14 - 17 ч. Выход фермента с операции 60000 ед.акт. Концентрация фермента 15 тыс .ед .акт ./мп . Полученный препарат э}щонуклеазы рестрикции Hha I хранят при (-20)°С в течение 12 мес без снижения активности. Содержание примесей неспецифических нуклеаз в нрепарате оценивают двумя методами: обработкой ДНК фага избытками фермента в течение длительного времени и ме годом рестрик1щя-лиги- рование-повторная рестрикция. Установлено, что при обработке 1 мкг ДНК фага Д 15 ед.акт. препарата рестриктазы Hha I (15-кратным избытком) в течение 20 ч при не изменяется четкая специфическая картина гидролиза. Фрагменты, получаемые при обработке. 1 мкг ДНК фага 3 ед.акт. препарата Hha Т в течение 17 ч при , линируются ДНК-лигазой Т4 не менее чем на 90% и полностью cneiiji- сЬически гидролизуются при обработке препаратом Hha I.

Пример 2. Эндонукпеазу рестрикции Hha I вьщеляют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за искпючением того, что к клеточному гомогенату приливают 4,5 мл 0,9 М NaCl (до конечной концентрации 45 мМ) и 25,5мл деионизованной воды. Выход препарата фермента из 10 г 48- тыс. ед.акт.

Четкая специфическая картина гидролиза наблюдается при обработке 1 мкг ДНК фага 15 ед.акт. препарата в течение 17 ч при 37 С.

Фрагменты, полученные при обработке 1 мкг ДНК (Ъага 6 ед.акт. препарата в течение 17 ч при 37°С лигируют- ся ДИК-лигазой Т4 на 90% и полностью специфически гидролизуются при обработке препаратом рестриктазы Hha I.

Пример 3. Эндонукпеазу рестрикции Hha I вьделяют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 4,5 мп 1 М NaCl (до конечной концентрации 50 М) и 25,5 мп деионизованной воды. Вьгход препарата фермента из 10 г клеток 48 тыс.ед.акт. с концентрацией 9,5 тыс.ед.акт./мп.

516

При обработке 1 мкг ДИК фага

10 - 13 ед.акт. препарата в течение 17 ч при четкой картины рестрикции не наблюдается, полосы фрагментов размыты, что указывает на наличие заметных примесей эндонуклеаз.

Пример 4. Эндонуклеазу рест- рики11И Hha I вьиеляют из, 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 3,5 мл 0,9 М NaCl (до конечной концентрации 35 мМ) и 26,5 мл деионизованной воды. Выход препарата фермента из 10 г клеток 30 тыс.ед.акт. с концентрацией 8000 ед/мл. Примеси неспе151фических эндонуклеаз, зкзо- нукпеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаются.

06

Формула изобретения Способ получения знпонуклеазы рестрикции Hha I, предусматривающий разрушение биомассы продуцента Нае- mophilus haemolyticus ультразвуком, фракционирование полученного клеточного гомогената, хроматографию на фосфоцеллипозе Р11 и диализ, о т личающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения качества целевого фермента, в качестве продуцента используют пггамм Haenophilus haemolyticus ВКПМ ВА070, фракционирование клеточного гомогената проводят при рН 7,6. двухфазной системе, содержащей полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран D присутствии 38 - А5 мМ NaCl.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к производству ферментов из микробных клеток, а именно к способам получения эндонуклеазы рестрикции HHA 1 из биомассы HAEMOPHILUS HAEMOLUTICUS, и может быть использовано в генной инженерии. С целью упрощения процесса и повышения качества целевого фермента исходную биомассу HACMOPHILUS HAEMOLUTICUS ВКПМ В-4070 разрушают ультразвуком. Полученный клеточный гомогенат фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран в присутствии 38-45 мМ NACL при PH 7,6, верхнюю полиэтиленгликолевую фазу, содержащую целевой фермент, наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р11, а элюцию белков проводят линейным градиентом концентрации NACL от 0,2 до 1,0 М в буфере. Выход рестриктазы HHA 1 составляет 4-6 тыс. ед. акт/г биомассы с концентрацией 25 тыс. ед. акт/мл. В готовом продукте примесей нуклеаз не обнаруживается при обработке ДНК 15-кратным избытком фермента в течение 20 ч.