Консорциум штаммов бактерий LеUсоNоSтос oeNoS ,используемый для кислотопонижения виноградного сусла и виноматериалов Советский патент 1988 года по МПК C12N1/20 C12P39/00 C12G1/02 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и касается ассоциативной культуры, состоящей из штаммов молочнокислых бактерий вида Leuconosto olnos, которая может быть использована в винодельческой промьшшеннос- ти

Цель изобретения - получение нового консорциума молочнокислых бактерий вида Leuconostoc olnos, облада- кнцего более высокой активностью биологического кислотопонижения в сусле и виноматериале разных сортов и различного состава и способного

утилизировать яблочную кислоту при низком значении рН, высоком содержании винной кислоты, сернистого ангидрида и гфи низких температурах

Консорциум бактерий Leuconostoc olnos BKliM В-3365 (Таировская-1) содержит следующие штаммы молочнокислых бактерий: Т-А , Т-118; Т-120 Т-2С и Т-96 в соотношении .20:20:20: :20;20%„

Штаммы, входящие в консорциум, выделены из белых сортов виномате- риалов: Т-А Т-2С и Т-96 - из ви- номатериала сорта Алиготе 22 января

1982г.. Т-120 и Т-118 - из винома- териапа сорта Ркацители 30 ноября

1983г.

й 1деление бактерий проводили по следующей схеме:

высев 1% исследуемого виноматериа- ла в среду МРС+вино (1:1) + леворин + + спой вазелинового масла в 1 см;

пересев через 48 ч на твердую питательную среду МРС, инкубация при t 28°C;

выделение молочнокислых бактерий из отдельных колоний.

Штаммы характеризуются следующими морфолого-культуральНыми и физиолого- биохимическими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

Все штаммы, входящие в консорциум (Т-А,г, Т-118, Т-120, Т-2С и Т-96) грамположительные неподвижные кокки размером 0,7-1,0 мкм, факультативные анаэробы. На агаризованной среде МРС при t 28 C на вторые сутки дают слабый рост в виде белых гладких полупрозрачных колоний диаметром 0,1

1 мм. В жидкой среде МРС + вино (1;1) образуют беловатую муть с выраженным осадком, который при взбалтывании поднимается вверх в виде шелковистых волн. Не образуют слизи.

O 5

0 5

0

5

0

j

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм Т-А при разложении глюкозы образует газ, не образует аммиак из аргинина. Сбраживает глюкозу, арабинозу, мальтозу, сахарозу, цел- лобиозу; не сбраживает ксилозу, лактозу, меллибиозу, рафинозу, манннт, сорбит, глицерин. Не восстанавливает нитраты и нитриты, не разжижает же- латин. Не усваивает цитрат, усваивает малат, не разлагает тартрат. Катал азоотрицательный. Штамм Т-118 при разложении глюкозы образует газ, не образует аммиак из аргинина. Сбраживает арабинозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, меллибиозу, сорбит; не сбраживает лактозу, галактозу, рафинозу, мальтозу, целлобиозу. Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин. Не усваивает цитрат И тартрат. Усваивает малат, Каталазоотрицательный,

Штамм образует при разложении глюкозы газ, не образует аммиак из аргинина. Сбраживает глюкозу, арабинозу, маннозу, мальтозу, целлобиозу, не сбраживает галактозу, лактозу, рафинозу, сахарозу, маннит, сорбит. Не восстанавливает нитраты в нитрить, не разжижает желатин, не разлагает глицерин. Не усваивает цитрат и тартрат, разлагает малат, Каталозоотрицательный.

Штамм Т-120 при разложении глюкозы образует газ, не образует аммиак из аргинина. Сбраживает глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннозу, галактозу, целлобиозу, не сбраживает лактозу, рафинозу, маннит, сорбит. Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, не разлагает глицерин. Не усваивает цитрат и тартрат. Усваивает малат, Катапазоотри- цательный.

Штамм Т-96 при разложении глюкозы образует газ, Не образует аммиак из аргинина. Сбраживает глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, не сбраживает галактозу, маннозу, целлобиозу, рафинозу, маннит. Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, не разлагает глицерин. Не усваивает цитрат и тартрат, разлагает малат. Каталазоотрицательный,

Некоторые штаммы молочнокислых бактерий могут накапливать в винах нежелательный биогенный амин - гис15

20

тамин, который значительно ухудшает вкусовые качества этих вин.

Все штаммы молочнокислых бактерий, входящие в состав ассоциативной

культуры Таировская-1, не образуют гистамин из гистидина,

Консорциум штаммов сохраняют в жидкой среде, состояш;ей из МРС и ви- .номатериала 1:1, при с пере-ю севом один раз в 3 мес. При этом культура сохраняет высокую биохимическую активность.

Состав среды МРС:

Пептон10 г

Дрожжевой

автолизат50 мл

Мясная вода100 мл

Твин-801 мл

Глюкоза20 г

Уксуснокислый

натрий5 г

Лимоннокислый

аммоний трехэаме

щенный () 2 г

Фосфорнокислый

калий двузамещенный

(KjHP04-3HiO) 2 г

Сернокислый

магний

(MgS04-7HiO)0,2 г

Сернокислый маргаН

нец

(nSOv4H-lO)0,05 г

Дистиллированная

водаДо I л

Консор1щум штаммов ВКПМ В-3365 получен при совместном культивировании на среде МЕС + вино (1:J) молочнокислых бактерий - штамьвл Т-А , Т-120, Т-П8, Т-2С я Т-96, Питательную среду инокулировали указанными штаммами одновременно в равных соотношениях (1:1:1:1:1), -Бактерии выращивали при в течение 30 сут при еженедельном пересеве о

3g

40

45

25

30

Отбор лучших штаммов из 120 вьщеленных культур молочнокислых бактерий в сравнении с производственными аналогами проводили с учетом требований, предъявляемых к микроорганизмам, используе1« 1М для проведения кислотопонижения виноградного сусла и столовых виноматериалов, Щтаммл должны обладать высокой кислотоус- тойчивостью, сульфитостойкосТью, холоде стойко стью,

5

0

Способность бактерий утилизировать яблочную кислоту, при различном содержании титруемых кислот, винной кислоты и рН определяли на виномате- риале сорта Алиготе в пяти вариантах при содержании сернистого ангидрида свободного 8, 10 и 11 мг/л, общего 60, 70 и 75 мг/л (табл.1).

Разводку молочнокислых бактерий вносили в количестве 5% в виноматери- ал, разлитый в колбы по 50 мл. Кисло- топонижакщую способность молочнокислых бактерий проверяли по следующим показателям: содержание титруемых кислот, рН, качественное определение яблочной и молочной кислот методом бумажной хроматографии.

Утилизацию яблочной кислоты бактериями констатировали снижением титруемой кислотности, исчезновением яблочной кислоты, повьш1ением рН, учитывали также скорость яблочно-молочного брожения (ЯМБ).

Свойства наиболее активных штаммов указаны в табЛо2,

Из данных табл.2 видно, что штам- мы Т-118, Т-120, Т-96, Т-А„ способны утилизировать яблочную, кислоту в виноматериале при рН 2,8. Штаммы Т-А., и Т-2С утилизируют яблочную кислоту при содержании свободного сернистого ангидрида 11,0 мг/л, Пос- ле получения консорциума из данных

g штаммов повторно проверяли кислото- понижакяцую способность каждого штамма, входящего в ассоциацию, и ассоциативной культуры (табл.3).

Проверку проводили на виноматериа0 ле сорта Апиготе, Как видно из табл.З, ассоциативная культура способна утилизировать яблочную кислоту в вино- материале с титруемой кислотностью 13,3 г/л, содержанием винной кислоты

5 7 г/л, сернистого ангидрида свободного 11 мг/л и общего 75 мг/л; рН 2,80 в течение 14 сут, активные штам5

0

0

5

мы Т-А, и Т-120 за 30 сут. Штаммы Т-2С, Т-96 и Т-118 только частично проводят яблочно-молочное брожение в экстремальных условиях

Кислотопонижающую способность консорциума проверяли в высококислотном виноматериале сорта Алиготе с разли ными сочетаниями яблочной и винной кислот (табл.4).

Данные табло4 свидетельствуют о том, что если титруемая кислотность

представлена в основном винной кислотой, то ассоциативная культура спо- |собна утилизировать яблочную кислоту :в виноматериале при содержании тит- кислот 13 г/л (количество jвинной крелоты 7,4 г/л). При содержании в виноматериале больших количеств яблочной кислоты (количество винной кислоты 3,4 г/л) культура проводит процесс яблочно-молочного брожения при титруемой кислотности 15 г/л.

Консорциум и входящие в его состав штаммы проверяли на кислотопонижающую способность при 10, 18 и 25 Се 15 материал является более стабильным.

13866566

кислот (на 0,1 г/л больше контрольного варианта). В опытном виноматериале хорошо идут восстановительные проце ссы. Окислительно-восстановительный потенциал снизился с 409-до 364 мВ против 384 мВ в контрольном образце, уменьшилось количество альдегидов, увеличилось содержание ре Ю дуктонов.

Содержание азотистых веществ ниже Также в опытном виноматериале, где яблочно-молочное брожение прошло

полностью. Следовательно, этот виноИсследование проводили на стерильном виноматериале сорта Ркацители следующего химического состава; со.- цержание титруемых кислот 10,8 г/л, винной кислоты г/л, рН 3,2 со- цержание сернистого ангидрида свободного 10 мг/л и общего 60 мг/л (табл.5).

20

менее склонен к помутнениям и пере- окисленности. Этот образец виномате- риала был мягким, гармоничным, полным во вкусе, имел ярко вьфаженный сортовой аромат и получил высокую дегустационную оценку 8,3 балла. Контрольный образец виноматериала получил оценку 7,9 баллов за счет грубой зеленой кислотности, негармоничности во вкусе о

Как видно из табло5, полученный консорциум штаммов утилизирует яблочную киспоту при t 25°с в течение 5 сут, при t 8°С в течение 12 сут, при t 10°С в течение 121 сут. Штаммы Т-Ац, Т-96 и Т-2С рроводят процесс яблочно-молочного , |брожения за 7 сут, при t 18 С за 114 сут, при t 10°С в течение 21 сут. Штаммы Т-120 и Т-118 кис- лотопонижение проводят при 25°С в течение 10 сут, при t 18 С за 21 сут, при t 10°С в течение 25 суто

В табл.6 представлена сравнительная характеристика белого столового Вина сорта Апиготе, приготовленного полупроизводственных условиях с биологическим кислотопонижением с Помощью культуры Таировская-1. Раз25

30

35

40

менее склонен к помутнениям и пер окисленности. Этот образец винома риала был мягким, гармоничным, по ным во вкусе, имел ярко вьфаженны сортовой аромат и получил высокую дегустационную оценку 8,3 балла. Контрольный образец виноматериала получил оценку 7,9 баллов за счет грубой зеленой кислотности, негар ничности во вкусе о

Сравнительная характеристика к сорциумов штаммов Таировская-1 и К-48Ф представлена в табл,7. ,

Пример 1. Консорциум штам выращивают в виноградном сусле со та Каберне, разбавленном 1:1 . Полученную 2-суточную разводку ба терий в количестве 3-5% задают в емкость V - 160 дал. Виноматериал имеет следующие кондиции: содержа титруемых кислот 10 г/л, винной к ты 4 г/л, рН 3,1, содержание се нистого ангидрида свободного 15 м и общего 75 мг/л По истечении 5 кислотность исследуемого виномате ала снижается до 5,6 г/л, рН повьш ется до 3,5, по данным хроматогра ческих исследований полное исчезн

родку бактерий готовили в лаборатор- д ™ яблочной кислоты. Вино после Ных условиях на виноградном сусле,кислотопонижения является мягким,

гармоничным

| азбавленном водой в соотношении ,1:1, и вносили в емкость с виномате- риалом V 160 л.

Данные таблоб свидетельствуют о troM, что культура способна проводить .tфoцecc яблочно-молочного брожения В виноматериале с высокой исходной (титруемой кислотностью (13,2 г/л) 1ц высоким содержанием винной кислоты (7,0 г/л). Титруемая кислотность .йри этом снизилась с 13,2 до 7,8 г/л iipH небольшом накоплении летучих

во вкусе и имеет дег тационную оценку 8,2 балла по сра нию с контрольным образцом, котор имеет оценку 7,9 балла.

50Пример2. Бактериальную р

водку культуры накапливают в кул тиваторах, заполненных на 2/3 объ пастеризованным суслом, задают 5 10% разводки. .Культивирование мол

55 кислых бактерий проводят при пост ной температуре и периодическом перемешивании для равн(;-Мер го распределения бактериальной ма

0

5

0

5

0

менее склонен к помутнениям и пере- окисленности. Этот образец виномате- риала был мягким, гармоничным, полным во вкусе, имел ярко вьфаженный сортовой аромат и получил высокую дегустационную оценку 8,3 балла. Контрольный образец виноматериала получил оценку 7,9 баллов за счет грубой зеленой кислотности, негармоничности во вкусе о

Сравнительная характеристика консорциумов штаммов Таировская-1 и К-48Ф представлена в табл,7. ,

Пример 1. Консорциум штаммов выращивают в виноградном сусле сорта Каберне, разбавленном 1:1 . Полученную 2-суточную разводку бактерий в количестве 3-5% задают в емкость V - 160 дал. Виноматериал i имеет следующие кондиции: содержание титруемых кислот 10 г/л, винной кислоты 4 г/л, рН 3,1, содержание сернистого ангидрида свободного 15 мг/л и общего 75 мг/л По истечении 5 сут кислотность исследуемого виноматериала снижается до 5,6 г/л, рН повьшга- ется до 3,5, по данным хроматографи- ческих исследований полное исчезновегармоничным

во вкусе и имеет дегустационную оценку 8,2 балла по сравнению с контрольным образцом, который имеет оценку 7,9 балла.

Пример2. Бактериальную разводку культуры накапливают в культиваторах, заполненных на 2/3 объема пастеризованным суслом, задают 5 - 10% разводки. .Культивирование молочнокислых бактерий проводят при постоянной температуре и периодическом перемешивании для равн(;-Мерно- го распределения бактериальной массы.

По достижении во всем объеме культиватора титра бактерий, равного Ю - 10 кг/МП, разводку используют для биологического кислотопонижения, рас- качивая в емкости V 1250 дал с высококислотным суслом и виноматериа- лом в количестве 5% к объему Процесс яблочно-молочного брожения ведут при 1 2-20 С, Результаты представлены в табл.8.

Виноматериалы, в которых прошло яблочно-молочное брожение при задаче консорциума молочнокислых бактерий Таировскаят, имели выраженный сортовой аромат, были мягкими во вкусе и получили высокую дегустационную оценку.

Формула изобретения

-

Консорциум штаммов бактерий

Leuconostcc olnos ВКПМ В-3365, ис

кислотопонижения вино- и виноматериалов.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается ассоциативной культуры, состоящей из штаммов молочнокислых бактерий вида Leuconostoc olnos, которая может быть использована в винодельческой прО1« 1шпеннос- ти. Целью изобретения является получение нового консорциума штаммов бактерий Leuconostoc olnos ВКШ В-3365 (Таировская 1), обладающего более высокой активностью биологического кислотопонижения в сусле и виномате- риале разных сортов и различного состава и способного, в свою очередь, утилизировать яблочную кислоту при низком значении рН, высоком содержании винной кислоть1, сернистого ангидрида и при низких температурах. Новый консорциум содержит следующие штаммы бактерий: Т-А12, Т-118, Т-120, Т-2С и Т-96 в соотношении 20:20:20: :20:20%. Данные штаммы получены в результате селекции производственных микроорганизмов и выделены из сухих бельк виноматериалов сорта Алиготе и Ркацители,, Консорциум способен проводить процесс яблочно-молочного брожения в виноматериале сорта Алиготе при содержании титруемых кислот 13,3 г/л, винной кислоты 7,8 г/л, сернистого ангидрида 10,0 мг/л свободного и 70,0 мг/л общего, при рН 2,75 в течение 14 сут. Содержание титруем 1х кислот в процессе биологического кислотопонижения снижается с 11,6 до 6,3 г/л. Ни- номатериалы, в которых прошло яблочно-молочное брожение, при задаче консорциума молочно-кислых бактерий Таировская-1 имеют вьфаженный сортовой аромат, мягкие по вкусу и получили дегустационную оценку 8,1-8,3 балла. 8 табл. I (Л со 00 О) О) 01 О5

8,0/60,0

11,0/75,0

8,0/6Q,0

11,0/75,0

8,0/60,0

7,8 4.5 4.5 4,5 7,8

13,3

8,6

13,3

Консорт цнук

11/75

Таблица 2

2,8 3,2 3,2 3.2 2,8

3,33

3,33

30

14

7

14

30

т а б л

10,4 2,8

3,1

+++ ++

4++ Ч-1-+

+++

. ++

30 30 30 30 30

14

Таблицей

Исходное сусло

3,4 489«3,Л 7,2 0,5 + +

ияоматернаш исходяьй 2,9

после хяе- лотопо- шшемия с по-- нощью культуры Taic POBCXMI 3,3

40913,2 7,0 0,2 ++ ++

364

7,8 6,5 0,3 +++

онатериап

исходный 19,8 80,0 10,8 186

после кис- лотОпо- яижеяня с по- ноцью культуры Тшг- ройскм-1 15,2 75,0 9,5 170

Таблицаб

368 185

336 174.

+ 274 UO

Продолжение, табл.

191 в6,0 11,2

12

180 80 11,5

П

2 2 Я к

Я Я

л

8 Я 2 8

s

s

И S 28

о

IS

г Ч - о о ю

J I n

I II I

.1 111

I I I i

4D

m

« m m

к

Iff «ч (Ч n

« «n

« « (4 «ч

« Н «о М

/

ю 4 о «о

«

ь. о « «

-

% N (Я О о о

:: «0 «в в

rt в о

л f

« in в