Способ определения субпопуляции Т-лимфоцитов Советский патент 1988 года по МПК G01N33/49 

00 со 4

ОО

сх

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию биологичес- |ких материалов человека и животных иммунологическими методами, и может быть использовано в клинической иммунологии и других областях медицины в научно-исследовательских, диагностических и лечебных целях.

Целью изобретения является повьше- Q ние точности способа ва счет опреде- ления субпопуляции предшественников Т-клеток.

Способ осуществляется следующим образом.15

Бьша изучена динамика экспрессии рецепторов к аутоэритроцитам в про- цессе 18-часовой инкубации лимфоцитов в присутствии Т-активина. Для этого выделяли МК периферической крови здо- 20 ровых доноров путем центрифугирования гепаринизированной венозной крови (5 мл, содержащей 500 ЕД гепарина) в градиенте плотности фиколлаверографи- на (3 мл, плотность 1,077) при 25 3000 об/мин. Вьщеление МК в концентрации 5 мл/мл инкубировали в пеницил- линовых флаконах в среде РРМ1-1640 (среда 199), дополненной 20%-ной ин- активированной прогреванием сыворотки ЗО человека IV группы в присутствии Т- активина (1 ЕД/мл) в течение 18 ч при 37 С. Количество ауто-РОК определяли после 1,5-, 3; 6; 18 ч инкубации, исходя из заранее определенных интервалов времени, при которых определялись наиболее-существенные изменения в количественном содержании ауто-РОК. Тест ауторозеткообразова- ния проводили Следущим образом: Q 0,03 мл лимфоцитов (5 млн/мл) смешивали с равным объемом фетальной телячьей сыворотки, инкубировали смесь при 4°С в течение 30 мин и затем добавляли 0,03 мл 1%-ной взвеси ауто- логичных эритроцитов. Далее клеточную смесь центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и инкубировали в течение ночи при 4°С, после чего производили подсчет ауто-РОК. Результаты вышеописанных экспериментов показывают, что 5 содержание ауто-РОК в процессе 18-часовой инкубации с Т-активином существенно снижается. Однако снижению предшествует статистически значимьп подъем, определяемый в 6-часовых культурах.

В следующей серии экспериментов динамику экспрессии рецепторов к

35

45

0 5 О Q

5

5

аутологичным эритроцитам в процессе 18-часовой инкубации с Т-активином исследовали в популяции лимфоцитов, обогащенных Е-розеткообразующими клетками (Т-лимфоцитами). Для этого 0,5 мл МК периферической крови (10 млн/мл) смешивали с 0,1 мл 20%- ной взвеси ЭБ в присутствии 15%-ной инактивированной и адсорбированной ЭБ сыворотки донорев IV группы. Клеточную смесь инкубировали 15 мин при З7 с, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и вновь инкубировали в течение 1 ч при . Осадок осторожно ресуспендировали и центрифугировали в течение 20 мин при 1000 об/мин в градиенте плотности фиколла-верогра- фина (1,077). Находящиеся в осадке с Т-клетками эритроциты барана после удаления надосадочной жидкости лизи- ровапи гипоосмолярным шоком. После этого оставшиеся Т-клетки троекратно отмы.вали средой 199 и доводили до концентрации 5 млн/мл.

Сепарирование Т-клетки инкубировали с Т-активином (1 ЕД/мл) в течение 18 ч при 37°С вышеуказанным способом. Процентное содержание ауто-РОК определяли сразу в популяции свежевыделенных Т-клеток и через 1,5, 3J 6J и 18 ч инкубации. Из результатов видно, что 18-часовая инкубация Т-клеток с Т-активином сопровождается значимым снижением содержания ауто- РОК без достоверно значимого 6-часового прироста. Сопоставляя результаты, можно предположить, что прирост ауто-РОК происходит за счет лимфоцитов, не содержащих Т-клеток, т.е. лишенных Е-рецепторов. Действительно, 18-часовая инкубация с Т-активином субпопуляции МК, лишенных Е-РОК (не Т-клетки).сопровождается приростом ауто-РОК, фиксируемым в интервале от 3 до 6 ч. Отсюда следует, что максимальный прирост ауто-РОК в этом случае наблюдается в 3-часовых культурах и составляет в среднем 5,9 + 2,7%.

С целью выяснения, чем обусловлен прирост ауто-РОК в культурах МК-диф- ференцировкой незрелых, предшественников ауто-РОК или реэкспрессией рецепторов на клетках, уже утративших дан- ньй маркер, исследовали динамику экспрессии рецепторов к ауто-эритроци- там в субпопуляции МК, лишенных .ауто- РОК. Для удаления ауто-РОК из популяции МК 0,3 л МК (5 млн/мл) смешивали с равным объемом фетапьной телячьей сыворотки и инкубировали 30 мин при 4 С. К клеточной взвеси добавляли 0,3 мл 10%-ной взвеси аутологич- ных эритроцитов, обработанных предварительно нейроминидазой. Для этого 10%-ную взвесь троекратно отмытых в среде 199 аутологичных эритроцитов инкубировали в течение 45 мин при

с нейроминидазой в разведении 1:2000. Далее клеточную смесь лимфоцитов фетальной телячьей сыворотки и обработанных нейроминидазой аутологичных эритроцитов центрифугирова- ли 5 мин при 1000 об/мин и помещали в водяную баню при 4 С на 2 ч, после чего осадок осторожно ресуспендиро- вали и центрифугировали в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 в течение 10 мин при . Лимфоциты интерфазы, не содержащие ауто-РОК собирали пастеровской пипеткой и троекратно отмывали средой 199. Полученные таким образом лимфоциты инкуби- ровали в течение 18 ч с Т-активином, определяя количество ауто-РОК в те же временные интервалы. Видно, что удаление ауто-РОК не отменяет увеличение содержания ауто-РОК. Фиксируе- мое в этом случае изменение времени прироста обусловлено изменением суб- популяционного состава инкубируемой смеси, являющегося следствием сепарации лимфоцитов.

Таким образом, удаление клеток, уже экспрессирующих рецепторы к ауто логичным эритроцитам, не сказьгоается на исследуемом приросте ауто-РОК.

Чтобы окончательно убедиться в том, что прирост ауто-РОК обусловлен исключительно дифференцировкой ранних предшественников ауто-РОК в ауто розеткообразующие клетки, МК инкуби- ровали в течение 6 ч с Т-активином. .Затем удаляли все ауто-РОК и продолжали инкубацию оставшихся клеток с Т-активином в течение 18 ч. Предше-

5 0 5 Q

5

0

5

ствующая элюминации ауто-РОК 6-часовая инкубация МК с Т-активином преследовала цель стимулировать Диффе- ренцировку пре-ауто-РОК в ауто-РОК. В этом случае последующая инкубация оставшихся лимфоцитов с Т-активином не должна выэьгоать подъем содержания ауто-РОК. Следовательно, можно утверждать, что выявленный в процессе 6-часовой инкубации прирост ауто-РОК обусловлен дифференц1фовкой незрелых (Е-негативных) предшественников ауто- РОК в, ауторозеткообразующие клетки.

Пример. Мононуклеары периферической крови выделяют вышеописанным методом. Процентное содержание ауто-РОК определяют в непосредственно свежевыделенных МК и в культурах МК, инкубированных в течение 6 ч с Т-активином. Способы определения содержания ауто-РОК и инкубации лимфоцитов также описаны выше. О количественном содержании предшественников тимусзависимых лимфоцитов судят по приросту ауто-РОК за 6 ч инкубации.

Приведенные результаты демонстрируют, что выявленный среди несепарированных МК прирост ауто-РОК статистически значим. Содержание незрелых тимусзависимых предшественников составляет около 6,5%. Следовательно, налицо повышение точности предложенного метода по сравнению с известным методом (3,5%).

Формула изобретения

Способ определения субпопуляции Т лимфоцитов в периферической крови путем их инкубации в присутствии Т-активина с последующим определением прироста розеткообразующих Т-клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет определения субпопуляции предшественников Т-клеток, инкубацию проводят в течение 6 + 0,25 ч и определяют прирост ауторозеткообразующих клеток.

Изобретение относится к медицине, точнее к исследованию биологических материалов человека и животных иммунологическими методами. Предназначено для клинической иммунологии в научно-исследовательских, диагностических и лечебных целях и в других областях медицины. Цель изобретения - повышение точности способа определения субпопуляции предшественников Т-клеток. Для этого в течение 6 + + 0,25 ч инкубируют Т-лимфоциты крови в присутствии Т-активина. Затем определяют прирост розеткообразующих Т-клеток (ауто-РОК). Прирост ауто-РОК обусловлен дифференцировкой ранних предшественников ауто-РОК в ауторо- зеткообразующие клетки. О количественном содержании предшественников тимусзависимых лимфоцитов судят по приросту ауто-РОК за 6 ч инкубации. о (Л

Редактор Г.Волкова

Составитель П.Бонарцев

Техред М.МоргенталКорректор О.Кундрик

Заказ 2215/41

Тираж 847

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное