Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS для получения моноклональных антител к щелочной фосфатазе из кишечника теленка Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 

со со

О1

О)

О) 00

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления антигенов в непрямом методе иммуноферментного анализа.с

Цель изобретения - новьй штамм гибридных культивируемьр 1-Л5Шиных клеток Mus muscTilus, продуцирующий моно- клональные йнтитела к щелочной фосфа- тазе (ЩФ) из кишечника теленка, fo

Штамм получен путем слияния клеток селезенки мышей BAL В/с, предварительно иммунизированных препаратом ЩФ, с клетками миеломы X63-Ag8.653 и последующего клонирования получен- 15 ных гибридов на селективной среде ГАТ.

Штамм клеток МАМ-2108 депонирован в Специализированной коллекции .перевиваемых соматических клеток позво- 20 ночных института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) бЗД.

Культуральная характеристика. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 или модификация Дульбекко 25 среды Игла (ДМЕМ) с.10%-ной телячьей эмбриональной сывороткой, 4 мМ 1г-глу

тамина, ,100 ед. гентамицина в 1 мл.

Культивирование проводят при 37°С

с 5%-ной углекислотой в атмосфере ЗО

или без углекислоты.

Посевная доза 510 - 10 в 1 мл.

Частота пассажирования - через 4 дня, Кратность рассева 1:4.

Штамм может культивироваться в ас- ,,j цитной форме,

Сведения о клонировании. Штамм четырежды клонирован методом конечных разведений. Позитивных клонов не менее 95%.40

Сведения о контаминантах линии. Бактерии и грибы не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование. Криозащитная среда - эмбриональная телячья сыво- 45 ротка с добавлением 10%-ного диметил- сульфоксида. Вьтаиваемость при размораживании 75-90%.

Морфологическая характеристика. 1 Модальное число хромосом 72, с обла- ел стью варьирования от 68 до 76. В ка- риотипе 2 маркерные (метацентричес- кие) хромосомы.

Полезный продукт. Секреция моно- клональных антител на 4 день культи- , , вирования. Получаемое антитело относится к 1 gG, подклассу и связьшает ЩФ из кишечника теленка не инактиви- руя активный центр.

с

o

5

0

5

О

,,j

0

45

ел

,

Использование штамма МАМ-2108 иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковые флаконы пло- площадью 25 см по 5x10 клеток, в 5 мл среды ДМЕМ с 10%-ной эмбрирналь- ной телячьей сыворотки, 2 мм глутами- на, 100 ед/мл пенициллина и 100.мкг/мл пенициллина. Клетки культивируют 4 дня при в атмосфере, содержащей 5% СО. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 об./мин при 4°С. К полученному супернатанту добавляют ЩФ из кишечника теленка до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полученную смесь используют в качестве ШФАЩФ-реагента для иммуноферментного анализа.

Пластиковые планшеты для микротитрования покрывают очищенным в иммуно- аффинной хроматографии альфа-фетопро- теином человека (АФПЧ) (инкубация - 12 ч при , концентрация АФПЧ I мкг/мл ЗФФР, до 50 мкл/лунку). За тем лунки 5 раз отмывают ЗФФР, свободные валентности полистирола инак- тивируют бычьим сывороточным альбумином (0,5% на ЗФФР, 1 ч, З7 с), отмывают и инкубируют последовательно, с аналогичньпу1и отмывками, с монокло- нальными антителами к АФПЧ (контроль - ростовая среда) в различных разведениях, с кроличьей антисывороткой к иммуноглобулинам мьшш и с ЩФАЩФ-реагентом, Время инкубации 1 ч. После этого лунки отмывают 5 раз и заполняют субстратом-хромогеном (р- нитрофенилфосфат в концентрации 1 мг/мп, на трис-НС1-буфере, рН 9,2 и 0,01 MgCl). Положительная реакция- проявляется пронзительно-желтым окрашиванием, которое оценивают в относительных единицах оптической плотности на приборе МИНИРИДЕР (фирма Дайнатэк, Швейцария). Позитивная реакция сохраняется до разведения моноклональных антител к АФПЧ 1:1200, что соответствует концентра-, ции антител 20 нг/мл.

Пример 2. Криостатные срезы почки человека, фиксированные 10%-ным раствором формалина, инкубируют при комнатной температуре с моноклональным антителом 9В9 против ангиотензин-превращающего фермента (10 мкг/мл) в ЗФФР и затем последовательно с козьей антисывороткой к иммуноглобулинам крысы (КАМ)(1:40)

и ЩФАШФ-реагентом из примера . Время каждой инкубации 30 мин, между отмывками (по 10 мин) срезы слегка встряхивают (в ЗФФР), После послед- ней отмывки активность ЩФ, входящей в состав ЩФАЩФ-реагента, выявляют инкубацией срезов в течение 30 мин- в 0,1 М трис-НС1-буфере, рН 8,7, содержащем 0,5 мг/мп нафтола AS-MX, 1 мг/мл прочного синего ВВ и 1 мм левамизола, подавлякнцего активность эндогенной щелочной фосфатазы. Затем срезы отмьшают в дистиллированной воде ,и заключают в гз ми-сироп Апати

При микроскопии препаратов новлено, что синий продукт фосфатаз- ной реакции, соответствующий искомому ферменту, локализуется на апикальной поверхности клеток проксимальных канальцев почки. При зтом в контрольных срезах (обработка КАМ и ЩФАЩФ-реагентом) фосфатазная активность отсутствует.

Таким образом, проведенные испытания показали, что моноклональное антитело, продуцируемое новой гибри- домой, может быть применено для получения реагента, используемого в им муноферментном анализе. Возможность тиражирования штамма в виде асцитов обеспечивает получение целевого продукта в достаточном количестве.

формула

и

зобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musciilus ВСКК(П) 63Д для получения моноклональных антител к щелочной фосфатазе из кшпеч- ника теленка.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть цспользо- вано для выявления антигенов в имму- ноферментиом анализе. Целью изобретения является новый штамм гибридных культивируемых мьшиных клеток, проду- цирукяций моноклональные антитела к щелочной фосфатазе, Секретируемое клетками штамма моноклональное антитело связьшается с щелочной фосфата- зой. не нарушая ее ферментативной активности, и может быть использовано для получения реагента, пригодного в иммуноферментном анализе. Штамм хорошо культивируется и легко может быть переведен в асцитную форму. i (Л