Питательная среда для культивирования бактерий кLевSIеLLа рNеUмоNIае ВКПМ в-1823 - продуцента рестриктазы Крп I Советский патент 1988 года по МПК C12N1/20 C12N9/16 

t

Ф

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении из биомассы рестрикционной эндонуклеазы для биотехнических работ и биохимии.

Цель изобретения - повьппение выхода биомассы.

Приготавливают питательную среду из расчета на I л следующим образом. Пептон и дрожжевой экстракт взвешивают и растворяют в 200 мл воды, кипятят 15-20 мин, охлаждают,доводят рН до 7,0-7,2 и осадок отделяют на центрифуге при 6000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают ;в мерный сосуд, добавляют соли, глю- |козу, воду до метки. Проверяют рН ;среды, при необходимости доводят до :7,0-7,2 и стерилизуют при давлении В 1 атм в течение 30 мин.

Результаты культивирования клеток в средах 1-4 представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, через 5 ч.клетки растут следующим об- разом. В средах 2 и 3 с меньшей концентрацией компонентов рост хуже из- эа начинающегося голодания клеток, и среде 4 с большей концентрацией компонентов рост не улучшается по отНошению к росту клеток на среде 1. Следовательно, выбранная концентрация компонентов среды 1 является оптимальной.

; Пример. Для сравнения выхо- Да сырой биомассы проводят параллель- культивирование K.pneumoniae СОК8) ВКПМ В-1823 в предлагаемой среде и контрольной среде (известное). Предлагаемая среда, г/л: глюкоза 6,5; nienTOH 17; дрожжевой экстракт 13; IfejHPO,. 8,7; NH4C1 4,0; MgS04-7H,0 0,02, вода дистиллированная до 1 л. Среда (контроль), г/л: глюкоза 1; NaCl 10,0; дрожжевой экстракт (Difсо) 5; бакто-пептон (Difeo) 10, вода дистиллированная до 1 л, рН сред 7,0. Выращивание проводят в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл в 200 мл среды при З7 с с качанием 200250 об/мин. Оптическую плотность суспензии клеток выражают в оптических единицах (о.е.) и замеряют на приборе фотоэлектрокалориметр КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете толщиной 3,05 мм. Пробы отбирают одновременно

Результаты представлены в табл.2.

По результатам табл. 2 видно, что .рост клеток на предлагаемой среде в

два раза лучше, чем на известной. Кроме того, эксперименты показали прямую корреляционную зависимость между ростом клеток и накоплением фермента, поэтому клетки осаждают из культуральной жидкости к концу логарифмической фазы роста. Выход сырой биомассы на предлагаемой среде в 3-5 раз выше, чем на известной. Следовательно, и общий выход фермента вьте. Концентрация рестрикционной эндонуклеазы Kpnl в грузом клеточном экстракте после разрушения клеток ультра звуком составляет r lO-18-lO усл.ед, на 1 г .сырой биомассы. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК фага при 37 С за 15 мин. Рестрикционные эндонуклеазы, получаемые из биомассы являются ценными препаратами, исполь зу-емыми для научных исследований, к ним предъявляются высокие требования по активности и чистоте.

Таким образом, питательная среда включает компоненты, используемые в микробиологической промьшгленности, Совокупность компонентов в предлагаемой среде, подобранной по результата двухэтапного дробно-факторного эксперимента на ЭВМ, позволяет получать клетки K.pneumoniae ОК8 в количестве л 20-30 г с 1 л среды.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования бактерий Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-1826 - продуцента рестриктазы Kpnl, содержащая глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт, минеральньй источник натрия и хлора и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повьщ1ения выхода биомассы, она дополнительно содержит сернокислый семиводный магний, в качестве источника натрия - двуза- мещенный фосфорнокислый натрий, а источника хлора - хлористый аммоний, при следующем соотношении компонентов мас,%:

Глюкоза Пептон Дрожжевой экстракт Хлористый аммоний

0,60-0,65 1,6-1,7

1,2-1,3 0,37-0,40

0,85-0,87

0,015-0,020 Остальное

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении из биомассы рестрикцион- ной эндонуклеазы Kpnl Для работ в биотехнологии и биохимии. Целью изобретения является повьшение выхода биомассы. Компоненты питательной среды подобраны экспериментально в два этапа с помощью ЭВМ по программе дробно- факторного планирования для ДФЭ-2 Предложены концентрации компонентов среды, мас.%: глюкоза 0,6-0,65; пептон 1,6-1,7; дрожжевой экстракт 1,2-. 1,3; двузамещенньй фосфорно-кислый натрий 0,85-0,87; аммоний хлористый 0,37-0,40; магний сернокислый сейи- водный 0,02; вода дистиллированная - остальное. Питательная среда обеспечивает высокий выход сырой биомассы (л-ЗО г/л) и фермента (.т-Ю-Ю ед. на 1 г сырой биомассы). 2 табл. S (Л

Т а б л и ц а 1

Результаты культивирования K.pneu- moniae ОК8

Сре- Оптическая плотность, оптические еди- да ницы, при времени культивирования, ч

10,28 0,7 2il 2,7 3,7

20,27 0,7 1,9 2,3 2,8

30,26 0,7 1,6 1,7 2,5

40,27 0,7 2,1 2,7 3,2

Т а б л и ц а 2

Концентрация клеток K.pneimoniae ОК8 на предлагаемой среде и известной

Время Оптическая плот-;Выход сырой биороста, ность куль гуры массы, г

ч (o.ei) в средет

j-предла- контпредла- конт-гаемая роль гаемая роль

21,11,1

4,53,11,943

84,62,964

248,04,020-306-7

,f

Составитель И. Привалова Редактор Н. Киштулинец Техред А.Кравчук Корректор С. Шекмар

Заказ 2826/18Тираж 520Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4