ВЕКТОР PIL 207, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ РЕГУЛИРУЕМУЮ ЭКСПРЕССИЮ В ESCHERICHIA COLI И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ Советский патент 1994 года по МПК C12N15/70 

Изобретение относится к микробиологии, микробиологической промышленности и биотехнологии и представляют собой векторную плазмидную ДНК и способ ее конструирования.

Целью изобретения является создание плазмидного вектора с большим числом сайтов рестрикции, удобных для введения генов под контроль регулируемых промоторов фага лямбда.

Описан способ конструирования вектора, позволяющих создание плазмиды plL207, в которой присутствуют только необходимые элементы для регулируемой экспрессии чужеродных генов и сайты рестрикции, удобные для введения генов под контроль ранних промоторов фага лямбда P_L или P_R.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

П р и м е р. Клетки бактерий Е. coli K802, содержащие плазмиду рВR 322 и Е. coli BKM В-1449Д с плазмидой pILL 435 выращивают в 10 мл мясопептонного бульона при 29^оС до титра 1х10⁸. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4^оС), ресуспендируют в 0,1 мл лизирующего раствора (лизоцин 2 мг/мл, трис-НСl, рН 8,0-25 мМ, ЭДТА 10 мМ, глюкоза 50 мМ), выдерживают 5 мин при 0^оС. Далее прибавляют 0,2 мл раствора, содержащего 0,2 н NaOH, 1% додецилсульфата натрия, смесь перемешивают, выдерживают 5 мин во льду и добавляют 0,15 мл раствора 3М ацетата калия (рН 4,8), осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости раствора и оставляют на 1 ч во льду. Образовавшийся осадок убирают из смеси центрифугированием (15000 g, 5 мин, 4^оС) и к полученным супернатантам добавляют 2,5 объема этилового спирта, выдерживают 2 ч при -20^оС, осадок плазмидной ДНК собирают центрифугированием, промывают его 70% -ным этиловым спиртом и суспендируют в 0,2 мл буфера (трис-НСl 10 мМ, рН 8,0, ЭДТА 1 мМ).

Полученные препараты ДНК используют для конструирования плазмиды рIL 207. ДНК плазмид рВR 322 и pILL 435 смешивают в соотношении 1: 5 (2 и 10 мкг) в 0,1 мл раствора и смесь ДНК (12 мкг) гидролизуют одновременно эндонуклеазами SalCl и BamH1 (5 ед. активности каждого фермента) в растворе, содержащем 50 мМ трис-НСl, рН 7,6, 10 мМ Mg Сl₂, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мл NaCl, при 37^оС в течение 1 ч. Реакцию останавливают прогреванием смеси (10 мин, 65^оС). Соединение фрагментов ДНК проводят при помощи ДНК - лигазы фага Т4 (5 ед. активности) в присутствии АТФ (конечная концентрация 0,5 мМ) при 10^оС в течение 8 ч.

Смесью гибридных молекул ДНК трансформируют компетентные клетки Е. coli с термочувствительной мутацией в гене ДНК-лигазы. С этой целью клетки E. coli ligts 7 выращивают при 29^оС в 10 мл бульона LB (бактотриптон 10 т/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л) с интенсивной аэрацией до титра 3х10⁸. После охлаждения во льду клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, 0^оС), суспендируют в 0,5 мл 0,1 М СаCl, и используют для трансформации.

Смесь соединенных фрагментов ДНК (0,1 мл) инкубируют с 0,2 мл суспензии компетентных клеток 1 ч при 0^оС, а затем 10 мин при комнатной температуре (18-20^оС). После десятикратного разбавления бульоном LB клетки подращивают 2 ч с интенсивной аэрацией при 29^оС и высеивают на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие при 29^оС трансформанты проверяют на наличие иммунитета к фагу лямбда. Из клеток клонов, резистентных к ампициллину, иммунных к фагу лямбда и неспособных поддерживать рост при 43^оС, выделяют плазмидную ДНК, а затем проводят рестрикционный анализ. Плазмида, содержащая два BamH1-SalGI фрагмента размером 4,5 и 4,1 т. п. н. , а также два участка узнавания для рестриктазы Bgl 11, названа pIL 207. Эту плазмиду используют в качестве вектора, обеспечивающего регулируемую экспрессию клонированных генов. (56) Солонин А. С. и др. Новые плазмиды - векторы, содержащие регуляторную область фага λ . ДАН СССР, 245, 722-725, 1979.

Изобретение относится к микробиологии, микробиологической промышленности и биотехнологии и может быть использовано в работе по генетической инженерии. Целью изобретения является создание плазмидного вектора с большим числом сайтов дестрикции, удобных для введений генов под контроль регулируемых промоторов фага лямбда. Предложен способ конструирования вектора, позволяющий получить плазмиду pIL 207, в которой присутствуют только необходимые элементы для регулируемой экспрессии чужеродных генов и сайты рестрикции, удобные для введения генов под контроль ранних промоторов фага лямбда P_L и P_R. Для конструирования векторной плазмиды pIL 207 была проведена замена меньшего BamHI- SaIGI - фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 на Bam HI - SaI GI - фрагмент ДНК плазмиды pILL 435, содержащий область иммунитета фага лямбда. Наличие фрагмента плазмиды pILL 435, содержащего ранние промоторы фага λ и гены - регуляторы: CI с термочувствительной мутацией и cro с супрессируемой амбер мутацией делает последний в векторе pIL 207 эффективным при регулируемой экспрессии чужеродных генов. 2 с. п. ф-лы.

1. Вектор p1L 207, обеспечивающий регулируемую экспрессию чужеродных генов в Escherichia coli, содержащий:
Bam HI - Bgl 11 - фрагмент ДНК фага λ размером 1,2 т. п. н. с промотором P_L и геном N;
2 Bgl II - фрагмента ДНК фага λ размером 2,4 т. п. н. и 0,65 т. п. н с генами rex A, rex B, c^r 857, cro am 6 и промотором P_R;
Bam HI - Sal G1 фрагмент плазмиды РВР 322 размером 4,1 т. п. н. ;
уникальные сайты рестрикции Bam HI, Eco Rl, Eco RV; C1a I, Hpa I, Sal G I, Pvu II, Nru I, Sph I - места возможного клонирования чужеродных генов, сайты рестрикции Bam HI и Sph I удалены от промоторов P_L и P_R соответственно на 1,0 и 0,2 т. п. н. ;
ori - репликации плазмиды pMBI, селективные маркеры Ap^r, imm^λ,
хозяин E. coli; емкость вектора - до 40 т. п. н. 2. Способ конструирования вектора p1L 207, заключающийся в том, что ДНК p1LL 435 и pBR 322 одновременно подвергают гидролизу эндонуклеазами SaL GI и Bam HI, фрагменты ДНК соединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4, компетентные клетки E. coli с термочувствительной мутацией в гене, кодирующем ДНК-лигазу, трансформируют полученной смесью ДНК и выращивают при температуре 28 - 30^oС, отбирают ампициллинрезистентные клоны, не способные к росту при 42^oС и не поддерживающие развитие фага λ, из которых выделяют векторнуют ДНК, проводят рестрикционный анализ для идентификации целевого вектора.