Рекомбинантная плазмидная ДНК pIFN- @ тRр, кодирующая синтез человеческого иммунного интерферона Советский патент 1990 года по МПК A61K38/21 

Од оэ

Нзобрете5 ие относится к генетической иижеиернн и биотехнологии, конкретно к. способам получеиия практически важных белков методом микро- , биологического синтеза,

Целью H3o5pGfg KK является увели- , чение выхода иммунного питерферона.

Увеличение выхода интерферона обеспечивается наличием в плазьшде )д сиитетич еского участка связывания рибосом последовательности, расположенной мржду ним и инициирующим кодоном гена интерферона, которые имеют следующую структуру:15

инициирующий .кодон

участок I связывания рибосом II

промотор, ..GGAGG ,GCTCTAG|ATG ... ген

Изобретение иллюстрируется следу- 20 ющими примерами,

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pIFN-j-trp 1. Последовательность, кодирующую ген иммунного интерферона, получают путем 25 обратной транскрипции м-РНК, выделенной из индуцированных стафилококковым энтеротоксином лимфоцитов периферичес- кой . крови и селезенок человека.

Для осуществления зкспрессии зре- ЗО лого интерферона в клетках E.coli в полученной, последовательности удаляют с помощью эндонуклеазы рестрик- .ции EcoRII участок, кодирующий сигнальный пептиден заменяют его на син- „ тетический участок, содержащий коды недостающих аминокислот, инициирующий кодон АТС рибосомсвязывающий участок и прилегающую к нему последовательность.40

Для этой цели 5 мкг выделенного PstI фрагмента, содержащего ген незрелого иммунного интерферона, обрабатывают 5 ед. рестриктазы Е coR II в растворе, содержащем 10 Mti трис-HCl 45 (рН 7,5), 10 мМ MgCl 10 мМОТТ. Больший фрагмент выделяют элюцией из 1%-ной низкоплавкой агарозы после электрофореза в трис-ацетатном буфере.

К 1 1-п«г полученного фрагмента добавляют 0,1 мкг синтетических олиго- дезоксирибонуклеотидов, полученных путем химического синтеза, 2 мкг вьще- ленного электроэлюцией большого . EcoRI-Pstl фрагмента pBR 322 с трип- тофановым промотором и лигируют в присутствии .10 ед ДНК-лигазы фага ТА в растворе, содержащем 0,5 мМ АТР HJ

буфер, состав которого был npnnejjeH

BbHDC .

Лигаяной смесью трансформируют компетентные Клетки E.coli К12, которые высепают на чашки, содержащие LB-arap с тетрациклином. Из полученных клоЯов выделяют плазмиды и структура встроенных генов подтверждается рестриктным анализом н спквенсом.

Полученную генно-инженерную конструкцию анализируют по эфф ктивности синтеза иммунного интерферона после трансформации клеток Е.colt по антивирусному действию интерферона на культуре клеток.

Для этих целей полученные клоны наращивают в 3 мл 1,В-срелы в течение ночи 6 присутствии 15 мкг/мл тетрациклина и затем высевают в 100 мл среды Н9, содержащей казаминовые кислоты и /3 индолилакриловул кислоту (50 мкг/нл) и доращивают до плотности OD д 1. Пол.ученную биомассу . центрифугируют и лизйруют,отбирают аликвоты в них определяют активность ий- ;т ерферона,как было опидано вьше.

Для определения уровня синтеза интерферона биомассу центрифугируют и лизируют в присутствии SDS, отбирают аликвоты,. наносят на SDS-содержащи полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу. Гель прокрашивают Ку- масси R - 250 и сканируют. По результатам сканирования интерферон составляет 35% от суммарного белка бактерий П р и м е р 2. Конструирование рекомбинантной плаэмиды pIFN-ytrp2. Все операции выполняют как в примере 1, но вместо синтетических последовательностей, Используют синтетическую последовательность GGAGG CCTGTAG. Для отщепления сигнального пептида в описанной в примере 1 реакционной смеси импользуют вместо эндонуклеазы EcoRII рестриктазу Ava II в том же количестве. Дальнейшие операции идентичны примеру 1.

По результатам сканирования прокрашенных Кумасси R-250 гелей выход интерферона составляет 35% от суммар- ного белка бактерий.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет увеличить эффективность синтеза иммунного интерферона человека бактериальными клетками по сравнению с прототипом.

Положительный эффект достигается за счет использования химически

синтезированного участка связмпания рибосом и прилегающего к нему участка .ДНК, отличающихся по своей структуре от соотйетствующих участков, испольэо- ванных в прототипе.

Преимущество предлагаемого изобретения по сравнения с прототипом заключается в увеличении выхода интерферона в ,8 раза при синтезе его |Q бактериальными клетками.

Формула и

эобретення

Рекомбинантная плаэмидная ДНК plFN-vtrp, кодирующая синтез человеческого иммунного интерферона, размером 4,3 тыс. п о., содержащая ,

Pstl-EcoRl большой фрагмент векторной плазмиды pBR 322 длиной 3609 п.о.}

ген зрелого иммунного интерферона человека; фрагмент триптофанового промотора длиной 216 п. синте

0

TH4ecKsiH участок соязыванкя рибосом и последовательность, расположенная между 2iHM и ии ициирукщнм кодоном гена интерферона, со следукялей струк турой;

,1

инициирующий

. yiiacTOK I связывание рибосом I кодон

промотор...GGAGG JCCTCTAGJATG...ген;

-в качестве генетического маркера -

устойчивости к тетрациклину, ,

(

-участки расщепления уннкальнь {И

эндонуклеазами рестрикции расположенные на следующих расстояниях в п.о. ст 4Е coRI сай.та; Ват HI - 375; Sal I - 651, Pvu 11 - 2066, Pat I - 3609, EcoRI - 4079;

-участки узнавания другими Э1що- нулеазами рестрикции, расположенньш на следующих расстояниях в п.о. ot dEcoRI - сайтаJ Accl - 651 h 2246.

Изобретение относится к гене- тической инженерии и бнотехнологии, конкретно к способам получения практически важных белков методом микро-; биологического синтеза. Целью изобретения является увеличение выхода иммунного интерферона. Увеличение выхода интерферона обеспечивается наличием в плазмиде синтетического участка связывания рибосом и последовательности, расположенной между ним и индуцирующим кодоном гена интерферона, которые имеют следующую структуру: § I участок I связывания рибсгсом I промотор. . .GGAGG I ССТСТА( иницкируюцюд кодон А гё...ген Г