Способ получения рестриктазы SFa NI,способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 @ -GCATCN @ ,3 @ -CGTAGN @ Советский патент 1988 года по МПК C12N9/14 C12N15/00 C12N9/14 C12R1/46 

Изобретение относится к микробиологии и касается способов получения ферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз.

Целью изобретения является повышение удельной активновти и выхода целевого продукта. Для осуществления способа подбирают концентрацию неорганического фосфа та. Экспериментальные данные представлены в табл. 1 .

Как виднЬ из табл. 1, оптимальная концентрация составляет 68 г/л и значительно (в 34 раза) превьшает концентрацию . в известном способе .

Оптимальную фазу роста, при которой следует прекратить культивирование и начинать сбор урожая, подбира- ют, исходя из экспериментальных данных, приведенных в табл. 2.

Наибольший удельньм выход рестри- ктазы наблюдается при оптической плотности 2,4-2,8 о.е.

Биомассу осаждают центрифугированием и подвергают разрушению на ультразвуковом дезинтеграторе MSE. Клеточные обломки осаждают повторным центрифугированием. Хроматографичес- кую очистку проводят, используя фос- фоцеллюлозу Р-11, дальнейшую очистку ведут на DEAE-целлюлозе. Концентрирование осуществляют хроматографией на Р-11 целлюлозе.

Пример 1 (по известному способу) . Получение рестриктазы SfaN I из Streptococcus faecalis ND 547.

Клетки высевают на чашки с пита- тельной средой,следующего состава, т;риптон (Difco) 10; дрожжевой экстракт-(Difсо) 5; глюкоза 5; ( 2 (рН 7,2); агар 15, инкубируют при . Выросшие клетки вносят бактериологической петлей в 100 мл жидкой питательной среды такого же состава (без агара) и культивируют при . Затем инокулят вносят в 2 л свежей питательной среды и культивируют до оптической плотности 1,5 о.е. при длине волны нм. Биомассу осаждают центрифугированием на центрифуге , J - 21, ротор J А - . 10,8 тыс. об/мин 15 мин. Выход биомассы 6,6 г.

Биомассу суспендируют в 48 мл 10 мМ трис-НС (рН 7,5), содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанола, и разрушают в ультразвуковом дезинтеграторе MSE

s

Q 5 Q

5

три раза по 40 с на частоте 20 кГц, амплитуда 12 мкм. Клеточные остатки осаждают при 16- тыс. об/мин в течение 30 мин. Осветленный супернатант наносят на колонку с BiO Gel А 0,5М. Фракции, содержащие эндонуклеазные активности, собирают и концентрируют диализом против 100% глицерина и далее диализируют против буфера 1, содержащего 10 мМ К-Р (рН 7,4), 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 6,1 мМ ЭДТА и 10% глицерина. Пробы наносят на колонку с DEAE-целлюлозой. Элюцию ведут в линейном градиенте 0-0,5 М КС1 в буфере 1, Эндонуклеазу диализуют и очищают в колонке с фосфоцеллюлозой (0,5х х15 см). Элюцию ведут линейным градиентом 0-1,011 КС1 (140 мл) в буфере 1. Эндонуклеазные пробы собирают и используют в экспериментах. Выход рестриктазы 150 е.а./г биомассы. Активность фермента 600 е.а./мл.

П р и м е р 2 (по предлагаемому способу). Получение Sfa N I.

Культивирование ведут как в примере 1, только в составе питательной среды вместо дрожжевого экст1 акта фирмы Difco используют дрожжевой экстракт НПО Биолар, а концентрация составляет 68 г/л. Культивирование ведут до оптической плотности 2,4. Выход биомассы 11,2 г.

Выделение и очистка Sfa N I. Выделение фермента проводят при . Биомассу ресуспендируют в буфере А (0,05 М трис-HCl, рН 7,5; 5, ЭДТА, 0,1 М 2-меркаптоэтанол, 0,2% NP-40) в соотношении 6 г биомассы на , 20 мл буфера. Разрушают ультразвуком в ультразвуковом дезинте- rjpaTOpe MSE три раза по 40 с на частоте 20 кГц, амплитуда 12 мкм. Осаждают клеточные остатки при 16 тыс. об/мин в течение 30 мин. Осветленный супернатант наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11, предварительно уравновешенную буфером В (0,02 М КН5,Р04, рН 7,5; 5,4 10 - М ЭДТА, О,1 М 2-меркаптоэтанол), колонку промьгоают этим же буфером, объем которого равняется двум объемам смолы. Сорбированньй на фосфоцеллюлозе белок смывают 1 М NaCl в буфере, собранный белок диализуют 3 ч против 3 л буфера и,наносят на колонку с DEAE-целлюлозой. Элюцию проводят 40 мл буфера В с линейным градиентом NaCl (О - 1 М), собирают фракции по 2 мл.

10

15

20

31442546

Фермент элюируют при 0,4-0,6 М NaCl. Фракции, содержащие ферментативную активность, собирают, диализуют 3 ч против 3 л буфера В и концентрируют с помощью хроматографии на Р-11 целлюлозе объемом 3-5 см . Элюцию проводят градиентом NaCl в буфере В, 40 мл О - 1 М. Фермент смывают с колонки при 0,65 М NaCl. Фракции по 2 мл, содержащие I, собирают, диализуют 20 ч против буфера С (0,02 М К-фосфат, рН 7,5; 0,02 М КС1, 5,4х ЭДТА, 0,1 М 2-меркаптоэтанол, 50% глицерин).

Определение активности фермента проводят следующим образом.

К 30 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг ДНК фага С1857 (0,02 М трис-HCl, рН 7,5; 0,01 М MgCl, 0,15 М NaCl), добавляют 1 мкл из соответствующих фракций при очистке фермента. Инкубацию ведут 60 мин при 37 С. Продукты гидролиза анализируют электрофорезом в 1,7%-ной агарозе в трис-ацетатном буфере, рН 0,05 (0,5 М трис-HCl, 0,2 М ацетат натрия, 0,02 М ЭДТА). Гель окрашивают бромистьм эти- дием (5 мг/л), фотографируют в ультрафиолете через красный светофильтр (К-8 ). За единицу активности приниг мают количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК фага С1857 за 1 ч при 37°С.

Выход рестриктазы на 1 г биомассы составляет 600 е.а. Активность фермента 4000 е.а./мл.

Результаты сравнения известного и предлагаемого способов представлены в табл. 3.

П р и М е р 3. Фермент получают по примеру 2, но культивирование ведут до оптической плотности 2,8 при длине волны «Л 600 нм. Выход биомассы 13г. Выход фермента 610 е.а./1 г биомассы, а его активность 4000 е.а./мл (табл,3) .

П р и М е р 4. Фермент получают по примеру 2, но культивирование ведут

25

30

40

П р им ер 6. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-фазы выход фермента 580 е.а./г.

Пример. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы 1 г/л. Отмечается увеличение темпов роста, но выход фермента снижается до 500 е.а./г.

П р и М е р 8. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого зкстракта 10 г/л. Резко ингиби- рует рост культуры, фермент не удается тестировать.

П р и М е р 9. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого зкстракта 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-периода, выход фермента 300 е.а./г.

Концентрацию триптона подбирают, исходя из экспериментальных данных, представленных в табл. 4.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход биомассы с 1 л культу- ральной жидкости в 1,5-2,0 раза, увеличить выход фермента на 1 г биомассы в 4 раза и повысить его активность в 6-7 раз (табл.3).

Ф о рмула изобретения

Способ получения рестриктазы 35 Sfa N I, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидрв 5 -GCATCN5- , З -CGTAGN, включающий

культивирование продуцента штамма Streptococcus faecalis при 3-7 С в

питательной среде, содержащей триптон .в концентрации 10 г/л, глюкозу и дрожжевой экстракт в концентрации по 5 г/л, двузамещенньй фосфат калия и воду, центрифугирование биомассы, 45 разрушение клеток ультразвуком и хро- матографическую очистку, включая , ДЭАЭ-целлюлозу и фосфоцеллюлозу, о т- личающийся тем, что, с целью повьш1ения удельной активности

до. оптической плотности 1,0 при длине gQ выхода целевого продукта, в качест0

5

0

5

0

П р им ер 6. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-фазы, выход фермента 580 е.а./г.

Пример. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы 1 г/л. Отмечается увеличение темпов роста, но выход фермента снижается до 500 е.а./г.

П р и М е р 8. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого зкстракта 10 г/л. Резко ингиби- рует рост культуры, фермент не удается тестировать.

П р и М е р 9. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого зкстракта 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-периода, выход фермента 300 е.а./г.

Концентрацию триптона подбирают, исходя из экспериментальных данных, представленных в табл. 4.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход биомассы с 1 л культу- ральной жидкости в 1,5-2,0 раза, увеличить выход фермента на 1 г биомассы в 4 раза и повысить его активность в 6-7 раз (табл.3).

Ф о рмула изобретения

Способ получения рестриктазы 35 Sfa N I, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидрв 5 -GCATCN5- , З -CGTAGN, включающий

культивирование продуцента штамма Streptococcus faecalis при 3-7 С в

40

питательной среде, содержащей триптон .в концентрации 10 г/л, глюкозу и дрожжевой экстракт в концентрации по 5 г/л, двузамещенньй фосфат калия и воду, центрифугирование биомассы, 45 разрушение клеток ультразвуком и хро- матографическую очистку, включая , ДЭАЭ-целлюлозу и фосфоцеллюлозу, о т- личающийся тем, что, с целью повьш1ения удельной активности

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения ферментов нуклеинового обмена. Цель изобретения - повьппение удельного выхода и удельной активности рестриктазы SfaHI. Штамм Streptococcus faecalis В-2293, продуцент рестриктазы Sfa N I, выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: триптон 10, глюкоза 5, дрожжевой зкстракт 5, 68 до достижения , оптической плотности 2,4-2,8 о.е. i при Л 600 нм. Биомассу осаждают центрифугированием и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе, клеточные обломки осаждают повторным центрифу- гированием. Очищают хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-11, а затем на DEAE-целлюлозе, концентрируют хрома- тографией на целлюлозе Р-11. 4 табл. (Л 4а N9 S Од

волны Д 600 нм. Выход рестриктазы 100 е.а./г биомассы.

П р и М е р 5. Фермент получают по примеру 2, но концентрация

ве продуцента используют штамм Streptococcus faecalis ВКПМ В-2293, культивирование ведут на среде, содержащей двузамещенньй фосфат калия в кокв культуральной жидкости 27 г/л. Вы- 55 центрации 68 г/л, до достижения оптиход биомассы 12,8 г, выход рестриктазы 200 е.а./г.

ве продуцента используют штамм Streptococcus faecalis ВКПМ В-2293, культивирование ведут на среде, содержащей двузамещенньй фосфат калия в кокческой плотности 2,4-2,8 о.е. мм.

при

14425466

Т а б л и ц а 1

Выход фермента на 1 г биомассы, .е.а.-.

150

200

300 610

81

Таблица 2

плот- Выход фермента, им, е.а./г

100

100

600

610

100

100

Культуральная характеристика

Сильное закисле- ние среды при ОП, о.е.

Активньй рост до 011, о.е.

Активньй рост

Наблюдается угнетение роста, стационарная фаза при 4 о.е.

Культура не растет

Параметры

Выход биомассы с -1 л культураль- ной жидкости, г

Выход фермента, е.а./л

Выход фермента

на 1 г биомассы,

а.а.

Активность фермента, е.а./мп 600 4000

Таблица4

Концентра- Выход фер- Дополнительная ция трип- мента на характеристика тона, г/л 1 г,е.а.

5 500 Увеличение лаг- -фазы роста

10 600 Стабильное ; .культивирование

15 600 Удорожание процесса культивирования

Составитель Н.Ходаров Редактор Н.Гунько Техред М.Дидык Корректор М.Демчик

Заказ 6355/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, -1-35, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

14425468

ТаблицаЗ

Показатели по способу

извест- предла- ному I гаемому

6,5

4000

610