Штамм бактерий SтRертососсUS FaecaLIS - продуцент рестриктазы SFa N @ Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12N9/14 

Ё

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частнос- ,ти к обнаружению микроорганизма,способного синтезировать сайт-специфическую рестриктазу и расщепляющую последовательность нуклеотидов GCATC

;нв/п,.

Целью изобретения является выявление штамма Streptococcus faecal is ВКГО1 В-4426 (555), продуцирующего рестриктазу Sfa N 1 с повышенным выходом

Штамм Streptococcus faecal is 555 В-4426 - продуцент рестргастазы SfaN 1, узнающей и расцепляющей последовательность нуклеотидов GCATC , выделен в результате селекционной работы с музейными культурами.

Штамм характеризуется следующими свойствами

Морфологические. Клетки - в виде слегка овальных мелких грамположи- тельных неподвижных кокков, располагающихся поодиночке, попарно или в. виде коротких цепочек На плотной питательной среде формируют мелкие диаметром до 1 мм, слегка выпуклые, круглые с ровным краем, блестящие, полу- прозрачные пастообразной консистенции колониио При росте в питательном бульоне - равномерное помутнение.

Физиологические и биохимические. В первые сутки вырастает при температуре 45°С, на вторые - при 10°С, Растет при рН 9,6 и в молоке в присутствии 0,1% метиленового синего, вызывая его редукцию. Растет на питательном агаре в присутствии теллури- та калия, который при этом восстанавливается „ На средах Гисса вызываЈ

СП N5

СО 09

ет ферментацию бе газообразования мелибиозы, маннозы, галактозы, глю- козы, лактозы, сахарозы, мальтозы, арабинозы, маннита. Не ферментирует рамноэу, рафинозу, трегалозу, крахмал, инозит, дульцито Ферментирует в аэробных и не ферментирует в анаэробных условиях глицерин Проба с малонатом отрицательная. Индол, серо- водород не образует Дает отрицательные реакции с метиловым красным и на ацетон, оксидазу, каталазу и уреазу„ Нитраты не редуцирует. Желатин не гидролизует, не обладает лизин- и орнитиндекарбоксилазой, проба на аргининдигидролазу положительна „

Отношение к антибиотикам,, Клетки устойчивы к пенициллину,, ампициллину мономицину, канамицину, оксициллину, ристомицшгу, сульфатиазолу, метицил- лину} чувствительны к стрептомицину, неомицину, олеандромицину, эритромицину, новобиоцину, гентамицину и ри- фампицину.

Цтамм хранится в лиофильно-высу- шенном состоянии и на полужидкой питательной среде под слоем вазелинового маслао

Для культивирования клеток приме- няется питательная среда следующего состава, г/л: гидролизат казеина 20, глюкоза 10, дрожжевой экстракт 5, натрий хлористый 5, рН среды 7,2„

Культивирование проводят при температуре 30 С с хорошей аэрацией до поздней логарифмической фазы роста„ Выход влажных клеток составляет 2,4- 3,0 г/л питательной среды

Выход фермента составляет 2000 ед акт./г сырой биомассы, что более чем в 3 раза выше, чем известного

Полученная рестриктаза Sfa N 1 характеризуется следующими свойствами

узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов GCATC

VM,;

оптимальное значение. рН для действия рестриктазы 7,2;

оптимальная температура действия 37°Cj

оптимальная концентрация ионов Nad - 150 иН, MgCl - 5-15 шМ„

Фермент стабилен в течение не менее 6 мес. при температуре -20°С, свбоден от примесей неспецифических экэо- и эндонуклеаз, фосфатаз.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами .

5

0

0

0

0

5

Пример 1„ Клетки выращивают в пробирке на скошенном питательном агаре с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта при температуре 30°С в течение 16-18 ч. Этот объем иноку- лята равномерно вносят в 4 колбы с объемом 200 мл той же питательной среды. Культивирование в жидкой питательной среде проводят на термостатированной качалке о Полученную культу- ральную жидкость центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 30 мин0 Выход влажных клеток составил 2,4-3,0 г/л питательной среды.

Пример 2. ТО г биомассы Streptococcus faecalis 555 суспендируют в 30 мл 0,02 П трис-HCl буфера, рН 7,5, содержащего М/3-мер- каптоэтанол и 0,1% тритон Х-100,и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием,, Надосадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А 0,5т (Bio-Rad) объемом 500 мл, уравнове- иенную 0,02 М калийфосфатным буфером, содержащим И ft -меркаптоэтанол, 5-10-4М ЭДТА, 0,8 И NaCl и 0,1% тритон Х-ЮО (буфер А) „ Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч0 Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на активность фермента„ Диализ фермента проводят против 2 л 0,02 М калийфосфатного буфера, рН 7,5 содержащего М -меркаптоэтанола и 5 (буфер В), меняя буфер дважды Диализат наносят на колонку объемом 30 мл с бензил-ДЕАЕ целлюлозой (Sigma, CL1A), уравновешенную буфером В0 Колонку промывают буфером В, адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента Nad (0,0-1,0 М) в буфере В. Фракции, элюируемые при 0,45-0,55 И Nad, содержащие рестрик- тазу, объединяют и диализуют против 2 л буфера В, меняя его дважды,, Фермент после диализа наносят на колонку с оосфоцеллюлозой (Р-11 Whatman) объемом 10 мл, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буферомо Элюцию фермента проводят 200 мл градиента Nad (0,0-1,0 М) в буфере В„ Фракции, содержащие реет- риктазу,элюируемые при 0,43-0,55 М iiaCl, объединяют и диализуют против 2 л буфера В0 Затем проводят рехро- матографию фермента на фосфоцеллюло- зе Р-11 объемом 2 мл для концентрирования фермента,, Элюцию проводят 40 мл

5 16452936

градиента NaCl (0,0-1,0 М) „ ФракцииПолученный штамм обладает следуюэлюируемые при 0,5-0,55 М NaCl, объе-циии преимуществами по сравнении с

диняют и диалиэуют против буфера В,известным:

содержащего 0,1 М NaCl и 50%-ный5 - обеспечивает повыпенкый выход

глицерин рестриктазы Sfa N 1;

Ферментный препарат хранится при растет на более доступных деше-20вС„ Выход фермента 2000 ед„акт„/гвых питательных средах отечественного

биомассы, активность 20000 ед„/мл0производства.

За единицу активности принимают10

минимальное количество фермента, не-Формула изобретения

обходимое для полного расщепленияУтаим бактерий Streptococcus

1 мкг ДЖ фага fl C1 857 в течениеfaecalis ВКПМ D-4426 - продуцент

часа при температуре 37°С„рестриктазы Sfa N 1.