Питательная среда для культивирования бактерий PRoVIDeNcIa SтUаRтII - продуцента рестриктазы РSт 1 Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно касается состава питательных сред для культивирования бактерий Providencia stuartii - продуцента рестриктаты Pst 1.

Целью изобретения является повьппе- ние выхода рестриктпзы Pst 1.

Питательная среда для культини- рования бактерий Providencia stuartii - продуцента рестрмктлчю Pst I Включает в качестве игточникси) углерода глюкозу и лактозу, л в качестве питательной OCHOBI I рыГчи-п гидролизат при следующем исичении компонентов, г/л:

Рыбный гидролизат 45,0-50,0 Глюкоза1 , 5-J , 5

Лакточл2,S-3, 5

Вода. 1 л

Питательная среда of.e см чип лет ин те н с ифик а цию и а ко п л Г; и i i р е с т n .v. т а з 3150

ной активности, за счет чего повышается выход целевого продукта.

Пример. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбньй гидролизат 50,0

Глюкоза2,5

Лактоза3,5

ВодаДо 1 л

Оживление штамма Providencia stu artii 17 ВКПМ В-4076 осуществляют на сухом питательном агаре (сухой питательный агар 35,0 г/л, вода 1,0 л) в чашках Петри. Инкубируют в термокамере при 37 С в течение 18 ч.

С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы данного состава, рН 7,4.

Выращивают посевной материал при в течение 18 ч на качалке.

Ферментацию культуры проводят на питател ной среде данного состав при следующих условиях: рН 7,4| 37 С; перег:1ешивании 200 об/мин; подаче воздуха - 2 объема воздуха на 1 объем питательной среды; выращивании до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы: 8,0 г/л культу- ральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 80000 ед./г биомассы, 640000 ед./л культуральной жидкости.

В предлагаемом изобретении для определения активности использован метод электрофореза в геле. Актив- ность определяли в грубом экстракте биомассы бактерий Providencia stuar tii 17 ВКПМ В-4076 и в конце выделения (после хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой).

За единицу активности рестриктазы Pst l принимают минимальное количество фермента, которое требуется для полного расщепления I мкг ДНК фага Jv в течение 1 ч при 37 С.

Выделение фермента проводят следующим образом.

50 г биомассы бактерий суспендируют в 100 мл 10 мМ трнс-НС1, буфера, рН 7,2, содержащем 10 мМ 2-мер- каптоэтанола, 1 мМ азид натрия, 1 м трилона Б (буфер А) и доводят этим же буфером до объема 150 мл. К суспензии добавляют I,5 мл 10%-ного

тритона Х-100 и 150 мг лизоцима. Лизис проводят I ч при постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лизат добавляют к смеси, состоящем из 37,0 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного водного раствора пол этиленгликоля (ПЭГ) и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге High speed (20000 fq, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным объемом буфера А, добавляют тритон Х-100 (0,1%) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1%-й тритон Х-100 (буфер Б). Фермент элюируют 0-1,0 М линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Pst 1, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55%-й глицерин.

Получают очищенный фермент Pst I в виде прозрачной бесцветной жидкости,

Рестриктаза Pst 1 расщепляет ДНК (фаза А в 18 сайтах).

Содержание нуклеаз - после выделения отсутствуют.

Хранят рестриктазу Pst 1 при -10°С в течение 1 г.

Пример2. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат 7,5

Глюкоза2,0

Лактоза3,0

ВодаДо 1 л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводя подобно примеру 1.

Выход биомассы: 7,75 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 77500 ед./г биомассы, 600625 ед./г культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 и хранение провдят подобно примеру 1.

П р и М е.р 3. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат 45,0

Глюкоза1,5

5 . 15 Лактоза .2,5

ВодаДо 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного мате- риала, ферментацию культуры проводят подобно примеру 1.

Выход биомассы: 7,5 г/л культу- ральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 75000 ед./г биомассы, 562500 ед./л культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 и хранение проводят подобно примеру I.

П р и м е р 4. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат 42,5 Глюкоза1,0

Лактоза2,0

ВодаДо 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят подобно примеру 1.

Выход биомассы: 4,2 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 20000 ед./г биомассы, 84000 ед./л культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 и хранение проводят г подобно примеру 1.

Пример5. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат 52,5

Глюкоза3,0

Лактоза4,0

ВодаДо 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводя подобно примеру I.

Выход биомассы: 4,5 г/л культуральной биомассы.

Выход рестриктазы Pst I: 15000 ед./г биомассы, 67500 ед./л культуральной жидкости.

Определение активности, вьщеле- ние фермента Pst 1 и хранение проводят подобно примеру I.

Таким образом, в результате использования предложенной среды повышается выход рестриктазы Pst I с 400-600 до 75000-80000 ед./г биомассы или с 3000-4800 до 562500- 640000 ед./л культуральной жидкости по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования бактерий Providencia stuar- tii - продуцента рестриктазы Pst 1, включающая источники углерода, амин- ного азота, витаминов и воду, о т- личающаяся тем, что, с целью повьпиения выхода рестриктазы Pst I, она содержит в качестве источников углерода глюкозу и лактозу, а в качестве источников аминного азота и витаминов - рыбный гидролизат при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Рыбный гидролизат 45-50 Глюкоза,5-2,5

Лактоза2,5-3,5

ВодаДо л

Изобретение относится к биотехнологии и касается состава питательных сред для культивирования бактерий PROVIDENCIA STUARTII-продуцента рестриктазы PST 1. Целью изобретения является повышение выхода рестриктазы PST 1. Питательная среда содержит в качестве источников углерода глюкозу в количестве 1,5-2,5 г/л и лактозу в количестве 2,5-3,5 г/л, а в качестве питательной основы - рыбный гидролизат в количестве 45-50 г/л и воду до 1 л. В результате использования предложенной среды выход рестриктазы PST 1 возрастает с 400-600 ед/г биомассы до 75000-80000 ед/г биомассы или с 3000-4800 ед/л культуральной жидкости до 562500-640000 ед/л культуральной жидкости по сравнению с известным способом.