Способ получения биомассы бактерий PRoVIDeNcIa SтUаRтII, обогащенной рестриктазой Р Sт 1 Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N9/22 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробио- логической и химической промышленности, а именно касается способа получения биомассы бактерий Providencia stuartii V, высоким содержанием рестриктазы

Pst 1 .

Цель изобретения - повышение выхода биомассы и фермента.

Способ осуществляют следующим образом.

В процессе культивирования вводят свежую питательную среду и лактозу, чго позволяет культивировать клетки Providencia stuartii до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 2,5-3,5 опт.ед. (ФЭК, фипьтр № 6, кювета 0,5 см).

При введении лактозы в количествах менее 0,6 г/л (в виде 40%-ного раствора), например 0,1 г/л, снижается выход биомассы и фермента. Введение лактозы в количествах более 1,6 г/л (в виде 40%-ного раствора), например 2,1 г/л, приводит к снижению выхода биомассы и фермента. При зтом происходит сильное закисление среды, в ко- торой развитие бактерий Providencia scuartii происходит слабо.

При введении свежей питательной среды в концентрации менее 10% по отношению к объему ферментера (напри- мер, 5%) снижается выход биомассы и фермента.

При культивировании бактерий Providencia sCuarcii до оптической плотности бактериальной суспензии менее 2,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см), например 2,0 опт. ед., происходит снижение выхода биомассы и фермента, так как незавершен процесс постепенной ассимиляции лактозы и рыбного гидролизата. При культивировании бактерий Providencia stuartii до оптической плотности бактериальной суспензии более 3,5 опт. ед. (например, 4,0 опт. ед.) происходит снижение вы- хода биомассы и фермента, так как происходит старение культуры и наступает фаза отмирания клеток.

Пример 1. Оживление штамма Providencia stuartii 17 ВКПМ В-4076 осуществляют на сухом питательном агаре, содержащем 35 г/л сухого питательного агара и 1,0л воды, в чашках Петри. Инкубируют в термокамере при 35-37 С в течение 16-18 ч.

С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы с питательной средой, содержащей 50 г/л рыб ного гидролизата и до 1,0 л воды. В каждой колбе находится 200 мл среды. Культуру в колбах выращивают на качалке при 35-37 0 в течение 16-18 ч. Посевной материал готовят из расчета 8%

5 0

5

Q ..

з

0

5

по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферменте.

Ферментацию культуры проводят в ферментере Electrolux рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при:

РН72,-7,4;

подаче воздуха 100 л/мин;

перемешивании 300 об/минj

добавлении лактозы (в виде 40%-ного раствора) при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр К« 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мл воды)

добавлении 20% свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт.ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 13,0 г/л культураль- ной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 66000 ед/г биомассы; 858000 ед/л культуральной жидкости.

Для определения активности использован метод злектрофореза в геле. Активность определяют в конце вьщеле- ния (после хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой).

За единицу активности рестриктазы Pst 1 принимают количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК фага в течение 1 ч при .

Выделение фермента проводят следующим образом.

50 г биомассы бактерий суспендируют в 100 МП 10 мМ трис-НС1 буфера (рН 7,2), содержащего 10 i 2-меркап- тоэтанола, 1 i азида натрия, 1 кд1 трилона Б (буфер А), и доводят этим же буфером до объема 150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мл 10%-ного тритона Х-100 и 150 мг лиэоцима. Лизис проводят 1 ч при постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование ли- зата проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лизат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%- ного водного раствора полизгиленглико5 15

ля (ПЭГ) и 35 МП 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге High speed (20000 X g, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным объёмом буфера А, добавляют тритон X- 100 (0,1%) и наносят на колонку с

фосфоцеллюпозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1% тритона Х-100 (буфер Б). Фермент элюируют 0-1,0 М линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере Б. Фракции, содержащие рертриктазу Psc 1 концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55% глицерина.

Получают очищенный фермент Pst 1 в виде прозрачной бесцветной жидкое- ти.

Рестриктаза Pst 1 расщепляет ДНК фага Л на 18 сайгов.

Содержание нуклеаз - после выделения отсутствую .

Хранят рестриктазу Pst 1 при -10 С в т,ечение 1г.

Пример 2. Оживление культуры и выраЕцивание посевного материала

проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментере Electrolux рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при:

рН7,2-7,4,

подаче воздуха 100 л/мин;

перемешивании 300 об/мин}

добавлении лактозы (в виде 40%-но- го раствора) при достижении оптическо плотности бактериальной суспензии 1,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,1 г/л (50 г лактозы и 125 мл воды)

добавлении 15% свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,5 опт.ед. (ФЭК Фильтр № 6, кювета 0,5 см) 7,5 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,0 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 12,75 г/л ку; ьту- ральной лсидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 63500 ед/г биомассы; 809625 ед/л культуральной жидкости.

о

5

0

5

Определение активности, вь1деление фермента Pst i н хранение проводят подобно примеру 1.

Пример 3. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводяч подобно примеру 1 .

Ферментацию культуры проводят в ферменте Electrolux с рабочей ем- кос1 ью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при:

рН

7,2-7,4; 100 л/мин; 300 об/мин

5

0

0

5

0

5

подаче воздуха

перемешивании

I добавлении лактозы (в виде 40%- иого раствора) при достижении опти- ческой плотности бактериальной сус- ;пензии 1,25 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 0,6 г/л (25 г лактозы и 62,5 мл воды)

добавлении 10% свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,25 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 5,0 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 2,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр М 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 12,5 г/л культуральной жидкости.

Выход рестрикгазы Pst 1: 61000 ед/г биомассы, 762500 ед/л культуральной жидкости.

Определение активности, вьщеление фермента Pst 1 и хранение проводят подобно примеру 1.

Пример 4. Оживление культуры и вьц ащивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментере Electrolux рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при:

рН7,2-7,4,

подаче воздуха100 л/мин|

перемешивании300 об/мин{

добавлении лактозы (в виде 40%-но- го раствора) при достижении оптической плотности бактериальной суспензии клеток 0,75 опт.ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мл вод;- .

добавлении 20% свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед.

(ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фш1ьтр К 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 5,6 г/л культураль- ной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 31250 ед/ биомассы; 175000 ед/л культуральной жидкости.

Пример 5. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментере Electrolux рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 10 л воды, при:

РН7,2-7,4;

подаче воздуха 100 л/минt

перемешивании 300 об/мин

добавлении 20% свежей среды при достижении оптической плотности бакте риальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр К 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л

добавлении лактозы (в виде 40%-но- го раствора) при достижении оптичес- кой плотности бактериальной суспензии 2,25 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мл воды).

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, филы р № 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 6,6 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 34200 ед/ биомассы; 225720 ед/л культуральной жидкости.

5

0

0

5

та 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мл воды).

Процесс вьфащивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 7,6 ед/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 40500 ед/г биомассы, 307800 ед/л культуральной жидкости.

Пример 7. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментаторе Electrolux рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролиёа- та и до 1 л воды, при:

,2-7,4;

подаче воздуха100 л/мин;

перемепмвании300 об/мин;

добавлении 20% свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр К 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр К 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 8,2 ед/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 37000 ед/г биомассы; 303400 ед/л культуральной жидкости.

Таким образом в результате использования предлагаемого способа выход биомассы возрастает с 7,5-8,0 до 12,5-13,0 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктазы Pst 1 повьшается с 400-600 до 61000-66000 ед/г био

Изобретение относится к микробиологической и химической промышленности, а именно касается способа получения биомассы бактерий PROVIDENCIA STUARTII с высоким содержанием рестриктазы P ST 1. Целью изобретения является повышение выхода биомассы и фермента. Для этого в качестве источника азота и витаминов используют рыбный гидролизат, в процессе выращивания на стадии достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,25-1,75 опт.ед. в среду вводят лактозу и свежую питательную среду, причем лактозу вводят в количестве 0,6-1,6 г/л (в виде 40%-ного раствора), а свежую питательную среду - в концентрации 10-20% по отношению к объему ферментера и процесс ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 2,5-3,5 опт.ед. В результате использования предложенного способа выход биомассы возрастает до 12,5-13,0 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктазы повышается с 400-600 ед/г биомассы до 61000-66000 ед/г биомассы или с 3000-4800 ед/л культуральной жидкости до 762500-858000 ед/л культуральной жидкости.

6. Оживление культуры . массы или с 3000-4800 До 762500858000 ед/л культуральной жидкости.

Пример

и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментере Electrolux рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1 л воды, при:

рН7,2-7,4)

подаче воздуха 100 л/мин;

50

Формула изобретения

Способ получения биомассы бактери Providencia stuartii, обогащенной рестриктазой Pst 1, включающий культ вирование продуцента на питательной среде, содержащей источники аминного

перемешивании

300 об/мин; азота и витаминов при аэрации и пеЬЗ

) ремешивании, отличающийся

добавлении лактозы (в виде 40%-но- го раствора) при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр № 6, кюве

Формула изобретения

Способ получения биомассы бактерий Providencia stuartii, обогащенной рестриктазой Pst 1, включающий культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники аминного

азота и витаминов при аэрации и пе

) ремешивании, отличающийся

тем, что, с целью повышения выхода биомассы и фермента, в качестве источника аминного азота и витаминов ис9151836710

пользуют рыбный гидролизаг, в процес-чесгве 0,6-1,5-г/л, а свежую пигагельсё вьфащива(шя на стадии достиженияную среду - в концентрации 10-20% по

оптической плотности бактериальнойотношению к объему ферментера и просуспензии 1,25-1,75 опт. ед. в средуцесс ведут до достижения оптической

вводят лактозу и свежую питательнуюплотное;и бактериальной суспензии 2,5среду, причем лактозу вводят в коли-3,5 oirr. ед.