Способ получения мутантов по гену LYS 5 у дрожжей SасснаRомYсеS ceReVISIae Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к микробио- ло:| ической. промьшленности, точнее к cej| eK4HOHHO-reHeTH4ecKHM работам с дрфжжами-сахаромицетами, и может быть ист ользовано для получения мутантов по ; гену T,YS5 у дрожжей-сахаромицетов

Цель изобретения - повышение ле1|:тивности системы отбора мутантов по I гену LYS5 и сокращение времени на I их влияние.

В способе получения мутантов по гену LYS5, заключающемся в обработке му -агеном суспензии исходного штамма др)з сжей- Сахаромицетов, высеве на се ле1:тивную среду с Л-аминоадипиновой кислотой и отборе мутантов, с целью поиыгаения селективности системы отбора мутантов и сокращения времени их выявления, в качестве суспензии исходного штамма используют суспензию кл(;ток штамма дрожжей-сахаромицетов, несущего дупликацию гена LYS2.

Для получения мутантов по гену .LYiiS используют штаммы с дупликацией гена LYS2, Лупликации получают путем трансформации исходного штамма дрожжей-сахаромицетов плазмидой несущей в (|;воем составе дрожжей ген LYS2, и ин- еграции этой плазмиды в одну иг хромосом исходного штамма, В резупь- Ta jre этого доза гена IjYS2 удваивается , Для образования мутанта по гену LYI52 мутаген должен инактивировать ДВ( копии гена LYS2 вместо одной, им11вгаейся у исходного штамма. Это приводит к уменьшению доли мутантов LYS2 среди общего количества , вырастаклцих на Л-аминоади- najre, и соответственно, увеличению дойн мутантов по гену LYS5,

Пример 1, В качестве исходны культур для получения мутантов по гену LYS5 используют штамм 53Т- ДЗЙ Saccharomyces cerevisiae генотипа atrp I his3-11 , 151eu2-3, 1 12 и тра 1-53Т-Д327 (PLL 12) Saccha rotnyces cerevisiae генотипа atrp I j 151eu2-3,112 LYS2,: :LYS2 LEU2, Шт тра 1-53Т-Д327 (PLL 12) пред- ст|авляет собой дупликацию гена LYS2, по пученную Путем интеграции плазмиды PLL 12, несущей дрожжевые гены LYS2 и t,RU2, во II хромосому штамма 53Т

Штаммы вырарщвают в жидкой полной 55 срйде на круговой качалке при 30 С до концентрации клеток 1 -10 мл. Затем в,среду добавляют мутаген - 6-Nгидроксиламинопурин в количестве 100 мкг/мл. Обработку проводят в течение 4 ч. Яатем суспензию аликвота ми по 0,1 М.П высевают на чашки с селективной средой. После 5 дней инкубации чашек при 30 С отсевают выросшие на селективной среде колонии и, используя тест на аллелизм, -выявляют среди них мутантов по гену LYS5,

Данные отбора мутантов по гену LYS5 у штаммов 53Т-Д327 и тра 1-53Т- ДЯ27 (PLL 12) после- обработки 6-N- гидроксиламинопурйном представлены в табл«1,

Из табл.1 видно, что у штамма 53Т-Д327 основную массу отобранных ауксотрофов по лизину представляют мутанты по гену LYS2 (99,9%) и лишь незначительную часть.мутанты по гену LYS5 (1,1%), У штамма с дупликацией гена LYS2 тра 1-53Т-Д327 (PLL 12) наблюдается обратная тенденция - подавляющее количество отобранных ауксотрофов. по лизину является мутантами по гену LYS5 (90,9%).

Пример2, В качестве исход- ных культур для получения мутантов по гену LYS5 используют агтамм 53Т- Д327 Saccharorayces cerevisiae (генотип указан в примере 1).и штамм тра 2-53Т-Д327 (PLL 12) S.cerevisiae нотип atrp I his 3-11 , l51eu2-3.112: LEU2 LYS2. Штамм тра 2-53Т-Д327 (PLL t2) представляет собой дупликацию гена LYS2, полученную путем интеграции плазмиды PLL 12 в III хромосому штамма 53Т-Д327.

Для получения мутантов по гену. LYS5 используют мутаген -пропиолак тон в дозе 20 мкг/мл, остальные условия те же, что и в примере 1,

Данные отбора мутантов по гену LYS5 у штаммов 53Т-Д327 и тра 2-5ЗТ- Д327 (PLL 12) после обработки/)-про пиолактоном представлены в табл,2,

Из Ta6ji.2 видно, что тенденция, обнаруженная ранее (пример 2), проявляется, когда используется иной мутаген и иная дуплшсация гена LYS2, а имеино у штамма с дупликацией гена LYS2 процент мутантов по гену LYS5 (96,7) много выше, чем их процент у штамма, не имеющего дупликации (8,5).

Используя пpeдлaгae iьй способ, можно повысить селективность системы отбора мутантов по гену LYS5 по

лагаемым способом - примерно со 100 колониями. Такое значительное сокрящение объема теста на аЛлелиэм приводит к сокращению времени на выявление мутантов примерно в 10 раз.

Формула изобретения

сравнению с базовым объектом как минимум в 10 раз. Так, в соответствии с базовым объектом из 100 колоний, выростих на селективной среде после обработки исходной суспензии -про- пиолактоном, только примерно 9 колоний (В,5%) оказьгоаются мутантами по гену LYS5, а в соответствии с предлагаемым способом примерно 97 ко- Способ получения мутантов по ге- лоний (96,7%), т.е. почти все коло- ну LYS5 у дрсйсжей Saccharomyces НИИ,cerevisiae, заключающийся в обработке мутагеном суспензии клеток

Используя предлагаемый способ, исходного штамма, высеве на селек- кожно сократить затраты времени на g. тивную среду с о(,-аминоадипиновой выявление мутантов по гену LYS5. кислотой и отборе мутантов, о т л и- Так, в соответствии с базовым объек- чающийся тем, что, с целью том для выявления 100 мутантов по повышения селективности,системыот- гену LYS5 надо провести тест на ал- бора мутантов и сокращения времени лелизм примерно с 1000 колоний, вы- на их выявление, в качестве суспензии росших на селективной среде после исходного штамма используют суспен- обработки суспензии клеток -про- зию клеток штамма S.cerevisi fe, не- пиолактоном, а в соответствии с пред- сущего дупликацию гена LYS2,

.Т а б л и ц а 1

Штамм Отобрано Отбор мутантов по гену

ауксотрофов 1-

по лизину LYS2 . LYS5

53-Д327 89 88(99,9%) 1(1,1%)

Тра 1-5.3ТД327(РЬЬ12)555(9,1%)50(90,9%)

I Таблица2

ШтаммОтобрано Отбор мутантов по гену

ауксотро- j

фон по ли- LYS2 LYS5 . зину .

53-Л32789 89(91,5%) 7(8,5%)

Тра 2-53ТД327 (PLL12) 60 2(3,3%) 58(96,7%)

лагаемым способом - примерно со 100 колониями. Такое значительное сокрящение объема теста на аЛлелиэм приводит к сокращению времени на выявление мутантов примерно в 10 раз.

Способ получения мутантов по ге- ну LYS5 у дрсйсжей Saccharomyces cerevisiae, заключающийся в обраФормула изобретения

Способ получения мутантов по ге- ну LYS5 у дрсйсжей Saccharomyces cerevisiae, заключающийся в обра

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к селекционно-генетическим работам с дрожжами-сахаромицетами, и может быть использовано для получения мутантов по гену LYS5 у дрожжейгсахаромицетов. Целью изобретения является поввпцение селективности отбора мутантов по гену LYS5 и сокращение времени на их влияние. Изо бретение заключается в том, что в отличие от известных способов получения мутантов lio гену LYS5 у дрожжей-сахаромицетов в качестве суспензии клеток исходного штамма используют суспензию штамма, несущего дупликацию гена LYS2i Суспензию обрабатывают мутагеном и высевают на селективную среду с об-амино- адипиновой кислотой, на которой в данном случае вьфастают практически только мутанты по гену LYS5. Такбй способ позволяет более чем в 10 раз увеличить селективность системы отбора мутантов по гену LYS5 и Примерно в 10 раз сократить объем теста на аллелиям, необходимого для выявления мутантов по гену LYS5 среди ауксотро- фов по лизину, вырастающих на селективной среде с oi -аминоадипиновой кислотой. 2 табл. (Л с 4 4 со 01 00 О1