Способ иммобилизации ферментов Советский патент 1989 года по МПК C12N11/14 

1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии биохимического превращения органических веществ растительного или животного происхождения, и может найти применение в медицинской, химической и микробиологической промьшзленности.

Цель изобретения - повыщение гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощение и ускорение процесса иммобилизации.

Способ осуществляется следующим образом.

К промытой в дистиллированной воде и высзш1енной титановой губке приливают перекись водорода с концентрацией 30-35% при соотношении титановая губка.: перекись водорода равном 1:(3-5)

соответственно. Смесь термостатируют при 55-67°С при встряхивании в течение 45 мин, затем промьшают дистилли-- рованной водой до нейтральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч. Активированную таким образом титановую губку охлаждают до 0-4 С, после чего иммобилизуют на ней фермент.

Титановая губка является побочным продуктом при получении чистого гитана методом магнийтермического восстановления четыреххлористого

титана.

Титановая губка имеет высокую механическую прочность, большую удельную поверхность, составляющую 0,06-0,11 , и невысокую насыщенную массу в пределах 0,7-1,1 г/см .

Пример 1. Получение активированного носителя,

К 5 г промытой в дистиллированной воде и высушенной при 100 С титановой губки добавляют 1.5 мл перекиси водорода с концентрацией 30-35%, Смесь термостатируют при 55 С при встряхивании в течение 45 мин, заванный препарат с активностью фермента 132 ед/г, что составляет 66% от активности титанативного фермента.

Пример 5, Иммобилизация су пензий клеток E.coli,

Б качестве ферментативно активн го материала используют суспензию

тем,промывают дистиллированной водой Q клеток E.coli с аспартазной актив20

25

30

до нейтральной реакции и сушат при течение 1 ч. Активированную , taKHM образом титановую губку охлаждают до и используют для иммобилизации ферментов,15

Пример 2. Иммобилизация пепсина .

К 2 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл 0,5%-ного раствора пепсина в О,1 М ацетатном буфере при рН 4,0 Смесь, взбалтывают на механической качалке в течение 1 ч при 4 С и вьщерживают в течение 10 ч. Титановую губку С иммобилизованными ферментами промывают от несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды. Получают иммобилизованный препарат с активностью 1800 ед/г, т,е, 62% активности на- тивного фермента.

Пример 3, Иммобилизация пек- тиназы из Aspergillus niger,

К 2 г титановой губки, активиро- .ванной по примеру 1, приливают 5 мл 3%-ного раствора пектиназы в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,0, Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч. при 0°С и оставляют на 10 ч. Губку промы-s: вают 100 мл дистиллированной-воды до нейтральной реакции. Получают иммобилизованный препарат с активностью фермента 83,2 ед/г, что составляет 90% от активности нативного фермента. Пример 4, мобилизация про- теазы из Aspergillus oryzae,

К 5 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл 0,5%-ного раствора проторизина в- 0,1 М универсальном буферном растворе при рН 4 (0,1 М борной кислоты, 0,1 М фосфорной кислоты, 0,1 М уксусной кислоты в 1 М щелочи)о Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч при и оставляют при этой температуре на 10 ч t Титановую губку промывают 100 мл дистиллированной воды до нейтральной среды. Получают иммобилизо35

40

45

50

2 С

55

ностью. Клетки E.coli отделяют из культуральной среды и промывают ди тиллированной водой с последующим центрифугированием в течение 10 ми К 2 г титановой губки, активирован ной по примеру 1, приливают 10 мл- суспензии клеток E.coli, Смесь охлаждают до 6-8°С, приливают 9 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 8,0 Смесь тщательно перемешивают и взб тывают на механической качалке 2 ч при 4 С и ост-авляеют на 10 ч. Тита новую губку с иммобилизованной сус пензией клеток промьшают на фильтр от несвязанных клеток 0,1 М водным раствором хлористого натрия до исчезновения светопоглощения при 280 нм в промьюных водах и О,1 К ацетатном буфере при рН 4,5 до отсутствия ионов хлора. Получают пре парат с общей аспартазной активно стью 69520 ед, что составляет 90% от исходной общей аспартазной акти ности внесенных свободных клеток.

Пример 6, Получение актив рованного носителя фермента.

К 5 г промытой в дистиллированн воде, а затем высушенной при 100 С титановой губки добавляют 25 мл ко центрированной гидроперекиси. Смес термостатируют при 67 С при.встрях вании в течение 45 мин, затем пром вают дистиллированной водой до ней ральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч. Активированную таки образом титановую губку охлаждают . Подготговленную активированную титановую губку используют для им билизации на ней ферментов.

Пример 7, Иммобилизация сина, V .

- К 2 г титановой губки, активир ванной по примеру 6, приливают 10 0,5%-ного раствора пепсина в 0,1 ацетатном буфере при рН 4,0, Смес взбалтьшают на механической качал в течение 1 « при 4°С и выдержива в течение 10 ч. Титановую губку с

ванный препарат с активностью фермента 132 ед/г, что составляет 66% от активности титанативного фермента.

Пример 5, Иммобилизация суспензий клеток E.coli,

Б качестве ферментативно активного материала используют суспензию

клеток E.coli с аспартазной актив0

5

0

5

35

40

45

50

55

ностью. Клетки E.coli отделяют из культуральной среды и промывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием в течение 10 мин. К 2 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл- суспензии клеток E.coli, Смесь охлаждают до 6-8°С, приливают 9 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 8,0, Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч при 4 С и ост-авляеют на 10 ч. Титановую губку с иммобилизованной суспензией клеток промьшают на фильтре от несвязанных клеток 0,1 М водным раствором хлористого натрия до ис . чезновения светопоглощения при 280 нм в промьюных водах и О,1 К ацетатном буфере при рН 4,5 до отсутствия ионов хлора. Получают препарат с общей аспартазной активностью 69520 ед, что составляет 90% от исходной общей аспартазной активности внесенных свободных клеток.

Пример 6, Получение активированного носителя фермента.

К 5 г промытой в дистиллированной воде, а затем высушенной при 100 С титановой губки добавляют 25 мл концентрированной гидроперекиси. Смесь термостатируют при 67 С при.встряхивании в течение 45 мин, затем промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч. Активированную таким образом титановую губку охлаждают до . Подготговленную активированную титановую губку используют для иммобилизации на ней ферментов.

Пример 7, Иммобилизация пепсина, V .

- К 2 г титановой губки, активированной по примеру 6, приливают 10мл 0,5%-ного раствора пепсина в 0,1 К ацетатном буфере при рН 4,0, Смесь взбалтьшают на механической качалке в течение 1 « при 4°С и выдерживают в течение 10 ч. Титановую губку с иммобилизованными ферментами промывают от несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды. Получают иммобилизованный препарат с активностью 1870 ед/г, т.е. 64,4% активности на- тивного препарата.

Пример 8. Иммобилизация про теазы из Aspergillus oryzae.

К 5 г титановой губки, активированной по примеру 6, приливают 10мл 0,5%-ного раствора проторизина в О,1 М универсальном буфере растворе при рН 4. Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч при 2 С и оставляют при этой температуре на 10ч. Титановую губку промывают 100 мл дистиллированной воды до нейтральной среды„ Получают иммобилизованньш препарат с активностью фермента 140 ед/г, что составляет 70% от активности нативного фермента.

Пример 9. Получение активированного носителя фермента

К 5 г промытой в дистиллированной воде, а затем высушенной при титановой губки добавляют 20 мл концентрированной гидроперекиси. Смесь термостатируют при 60 С при встряхивании в течение 45 мин,затем промывают дистиллированной водой до нейтт ральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч. Активированную таким образам титановую губку охлалсдают до , 0°С. Подготовленную активированную титановую губку используют для иммобилизации на ней ферментов.

Пример 10, Иммобилизация пепсина.

К 2 г титановой губки, активированной по примеру 9, приливают 10мл 0,5%-ного раствора пепсина в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,О Смесь взбалтывают на механической качалке

в течение 1 ч при 4 С и выдерживают в течение 10 ч. Титановую губку с иммобилизованными ферментами про -1ыва ют от несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды. Получают иммо билйзованный препарат с 1780 ед/г, т.е„ 61,5% тивного фермента.

активностью активности на

Примеры 11-18. Способ осут ществляют аналогично, но при различном соотношении титановой губки и гидроперекиси при активации носителя.

Результаты указаны в таблице.

Как видно из таблицы при выходе за режимы соотношения титановая губка:перекись водорода снижается активность иммобилизованного фермента.

Формула изобретения

1,Способ иммобилизации ферментов, предусматривающий активацию носителя на основе титана и последующее связьюание ферментов с активированным- носителем, отличаю-щ и и с я тем, что, с целью повышения гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощения и ускорения процесса, в качестве носителя используют титановую губку, а активацию ос тцествляют путем обработки 30-35%-ной перекисью водорода при соотношении титановая губка : перекись водорода равном 1 : (3-5) соответственно и температ у- ре 55-67 с.

2.Способ по п.

1, о т л и ч а. ю Щ и и с я тем, что обработку перекисью водорода 45 45 мин.

ведут в течение

1Д72505

8

Продолжение таблицы

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицинской, химической и микробиологической пром. Целью изобретения является повышение гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощение и ускорение процесса. Согласно способу титановую губку, промытую водой и высушенную при 100°С, активируют путем обработки перекисью водорода с концентрацией 30-35% при соотношении титановая губка: перекись водорода 1:/3-5/ в течение 45 мин при 55-67°С, после чего на активированный таким образом носитель иммобилизуют фермент известным способом. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.