Способ разделения гликозилированной и негликозилированной форм пролактина биологического материала Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам разделения гликозилированной и неглико- зилированной форм пролактина при подготовке пробы биологического материала для иммунохимического определения гликозилированного пролактина. . .

Целью изобретения является упрощение способа за счет сокращения стадий. ,

На чертеже представлен график корреляхщонной зависимости результатов, полученных по предлагаемом (ось У) и известному (ось X) спосо- ам.

Согласно способу инкубирования биологической жидкости с раствором Конканавалина А и отделение полученного комплекса гликозилированной формы с конканавалином А от негликозилированной .формы пролактина проводят путем добавления .раствора поли- этиленгликоля и центрифугирования.

Пример 1. Разделение гликозилированной и негликозилированной форм пролактина в проб.е сыворотки крови человека. .

В аналитические -пробирки вносят по 0,1 МП сыворотки К.РОВИ, добавляют по 0,15 мл раствора к-онканавалина А (2,,5 мг/мп) в 0,5 М трис-НС буфере (рН 7,0), содержащем 0,2 М NaCl и Са 1.Тп2(по .О ,001 Ю и инку- .бируют 90 мин при комнатной температуре . Во все пробирки прибавляют по 0,25 мл 25%-ного полиэтиленгликоля (мол. масса 4000-6000) в воде. Пробирки встряхивают, выдерживают 10 мин при комнатной, температуре, центрифугируют 10 мин при .2000 g и суперна- тант отбрасывают.

fsoA

СП

ча

« ел

3

П р и м е р 2, Разделение гликоз лированной и негликозилнрованной форм пролактина в экстрактах гипофизов человека.

Ацетонированньп порошок (2 г) гипофизов человека экстрагируют 100 м 1 н, NaOH -при в течение 20 мин После нейтраштзации экстракта аликв ту (0,1 мл) используют для разделен форм пролактина, как описано в примере 1 .

П р и м е р 3. Сравнение полноты разделения глцкозилированной и не- гликозилированной форм пролактинаг предлагаемым способом и известным,

if обоих случаях концентрацию гли козилированного пролактина определя радиоиммуноанализом с помощью стандартного набора HPRJ.K-PR (CIS - International) . Перед радиоиммуноанализом осадок, содержащий гликозилир ванн ьй пролактин растворяют прибавлением в пробирку 0,1 мл 0,05 М трис-НС1-буфера (рН 7,0), содержа- щего 0,2 М NaCl и, 0,05 твин-20.

Радиоиммунологическое определени концентра1щей гликозилированного прлактина в нескольких (п - 5) гипо1Ъи зарных экстрактах, обработанных по предпагаемому и известному способам не выявило достоверных различий (р .0,05), обусловленных способом обработки.

Результаты сравнения двух способов фракционирования пролактина в применении к сыворотке крови человека отражены на корреляционном графике (в нг/мл). Выполненные расчеты показывают, что имеет место высокая степень корреляции (г 0,97) результатов радиоиммуноанализа фракци гликозилированного пролактина, выделенной предлагаемым и известным ссобами из одних и тех же проб сыворотки крови.

Анализ экспериментальных данных показывает, что предлагаем1лй способ

10

15

0

5

0

5

0

5

известньй одинаково эффективны в отношении разделения гликозилированной и негликозилированной форм пролакти-| на} предлагаемый способ более прост, так как не требует хроматографии каждой анализируемой пробы; более производителен, так как позволяет одному квалифицированному лаборанту в стандартных лабораторных условиях в течение первого для обработать большее число проб сыворотки. Кроме того, в отличие от известного предлагаемый способ согласуется с процессом иммунохимического микроанализа (РИА, ИРМА, ИФА и др.), так как состоит только из общих с микроанализом стадий пипетирования реагентов и разделения фаз. Вследствие этого предварительная обработка проб по предлагаемому способу и микроанализ могут проводиться в,одну аналитическую линию или выполняться в едином автоматизированном режиме.

Формула изобретения

Способ разделения гликозилированной и негликозилированной форм пролактина биологического материала путем контактирования пробы биологического материала с конканавалином А и отделения полученного комплекса гликозилированной формы пролактина с конканавалином А от негликозилированной формы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения стадий, контактирование проводят путем инкубации пробы в течение 90 мин с раствором конкана- валина А в трис-НС1 буфере, содержащем ионы натрия, магния, кальция и марганца, затем пробу обрабатывают раствором полиэтиленгликоля с мол. мае. 4000-6000, а отделение образовавшегося комплекса проводят центрифугированием.

100

100 300 500 700 9ОО

Изобретение относится к медицине и решает задачу разделения гликозилированной и негликозилированной форм пролактина при подготовке пробы биологического материала для иммунохимического определения гликозилированного пролактина. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в инкубировании биологической жидкости с раствором конканавалина А и отделении полученного комплекса гликозилированной формы с конканавалином А от негликозилированной формы путем добавления раствора полиэтиленгликоля и центрифугирования. 1 ил.