Штамм культивируемых гибридных клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител против альфа-фетопротеина человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гпбридом- ной технологии и может быть использовано для определения АФП п иммучо- (Ьерментном методе.

Цель изобретения - получение штамма культивируемых гибри/гчых клеток животных llus musculus L. , продуцирующих МонАТ к АФП человека и животных. НонЛТ штамма реагируют с ЛФ11 человека, мыши, крысы, свиньи и кошки и не реагирует с ЛУП теленка.

Штамм получают следующим способом.

Мышей линии ВАЬЗ/с и:1мунизируют очищенным препаратом АФП человека. Антиген выделяют и-з смеси сывороток больных с гепатопелл олярным раком

и тератобласточон методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к ДФЧ, кон-ыогнровап- ных с CNBr - активированной сефарозон 4В. Окончательную очистку антигена проводят аналогичным методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к белкам сыворотки взрослого человека - эту процедуру повторяют дважды, что обеспечивает высокую (более 957) чистоту выделяемого антигена. Чистоту ЛФП контролируют с кроличьей антнсьшо- роткой к белкам сыворотки человека методом двойной иммуноднсЬфузин в ге- ле . Полученный препарат смогпшают 1:1

вагззЧ

J1

-с полным адьювантом Фрейнда и каждой мыши вводят 15 мкг АФП в объеме 0,3 мл в шесть точек: подкожно на спине (4 точки по 0,05 мл) и внутримышечно в задние ноги (2x0,05 мл). Через месяц мыши вводят 75 мкг АФП без адьюванта Фрейнда внутривенно (0,2 мл) и внутрибргашинно (0,2 мл). На четвертый день после второго введения антигена берут селезенку и суспензию спленоцитов гибридизу- ют с мышиной миеломой X-63.Ag8.653. Для этого смесь спленоцитов и мне- ломы (6,5:1) в виде осадка инкубируют с 3 мл 50% полиэтиленгликоля (М.в. 1500) в течение 2 мин. Обработанную смесь клеток высевают в две 96-луночные пластины без фидера из расчета 4vlOF спленоцитов в лунку или 4,6хЮ смеси клеток в лунку. Клетки культивируют в среде DMEM с добавлением 20% лошадиной сыворотки, 2 мМ глютамида, 100 мкг/мл гентами- и на. Селекцию гибридных клеток прог од .ч т в культуральной среде в присутствии гипоксантина (13,6 мкг/мл), аминоптерина (0,19 мкг/мл) и тими- дина (3,9 мкг/мл). Появление колоний гибридных клеток зарегистрировано на седьмой день после слияния. На тринадцатый день после слияния множественные колонии (3-5 на лунку) выросли в 100% засеянных лунок. Отбо МонАТ проводят иммуноферментным методом с использованием конъюгата кроличьих антител к IgG мыши с перо- ксидазой хрена. Б 99% лунок в супер- натантах обнаружена специфическая анти-АФП активность. Клонирование и субклонирование позитивных гибридо проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя посев гибридом в количестве 3,1 и 0,5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером. В качестве фидера используют клетки перитонеального экссудата мышей BALB/c (5 И О3 клеток в лунку). Клонирование проводят на культуральной - среде, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки. При реклонирова- нии отмечается 100% позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен С9-84, депонирован под номером ВСКК (II) К 348D.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Культуральные своистла, Гибридому культивирует верес (рН 7,2) DMEM или RPM1 1640, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 г лют амин а, 100 мкг/мл гентамицина, при 37°С в присутствии 5% С0„

без С0.2 (в

Ј (в пластинах) или

плотно якрытой йог, дс) 1т ы.ш-яь,; вания штамма можно ис ользовать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон емкостью 25 ы засевают в 7 мл ростовой среды ЗкЮ -10 клеток штамма С9-84. Пассирование проводят один раз в 3-4 дня той же дозой клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три). Титр антител в культуральной среде при определении иммуноферментным методом 2 у103 .

Для культивирования in vivo мышам BALB/c, сенсибилизированным пристанем (0,5 мл внутрибрюшинно) за 7 дней до прививки гибридом, вводят внутрибрюшинно 5.106 -10 клеток штамма С9-84 в 2 мл среды RPII1 с ген- тамицином. Асцитическую жидкость забирают у живых мышей по мере ее накопления, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз Асцитный штамм перевивают на свежих мышей (5. 10 -10 клеток на мышь), проводя не более трех пассажей. В пулах асцитов, полученных от разных животных и в разных взятиях, титр антител при определении иммучофермент- ным методом достигает значения 10 .

Продуктивность штамма. В 1 мл культуральной среды содержится не более 10-20 мкг антител, а в асцити- ческой жидкости не менее 5 мг/мл антител.

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки, DMEM или RPII1 1640 и диметилсульфоксида (5:4: :1) 5-106 клеток штамма смешивают с 1 мл такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же после программного замораживания материала (1 в мин) помещают в хранилище с жидким азотом. Хранение в жидком азоте в течение нескольких лет обеспечивает почти 90% выживаемость клеток (визуальная оценка). Клетки штамма выдерживают хранение и при (-70)°С но только до 1 мес. Размораживание штамма проводят в водяной бане иг

37°С 2-3 мин, после чего клетки отмывают центрифугированием от среды для замораживания и переводят в обычную культуральную среду.

Характеристика целевого продукта МонАТ, продуцируемых штаммом С9-84, относится к субклассу IgGI , Константа связывания антител штам-- ма С9-84 с АФП равна 2- СИ°л/м - -:i ределение проведено жидко-фазным конкурентным радиоиммунологическим методом. Взаимодействие МонАТ с АФП может быть определено в иммупофер- ментпом и радиоиммунологуческом методах, а также в метолах иммуноизг а- хоФореза на ацетат-целлюлозной мембране, смешанной преципитации в ге че , МонАТ С9-84 связывается с АФП, находящимся в растворе и иммобилизованным на твердой фазе , а также л г том случае, когда само Мои AT CQ-8 t прикреплено к носителю, напрпмео к пластнку. В методе двойной пммуно- диффузии в геле МонА 1 П9-84 АФП о прецнпктирует. При анализе с ЛФП. различных видов млекопитающих МоНЛГ С9-84 реагирует с АФП человека, мыши, крысы, собаки, свиньи и кошки, за исключением АФП теленка. По результатам иммуноферментного анализа МонАТ С9-84 характеризуется одинаковым сродством к ЛФП от больных ,- первичным раком печени ч ЛОГ1 ччбрш - нального происхождения и более низким сродством к АФП тератобластолп:ого происхождения. Использование штамма С9-84.

Пример. Применение МонАТ С9-84 в качестве антитела, конъюги- рованного с пероксилазой лля иммуноферментного определениг ЛФП.

Для выполнения анализа требуется не менее двух типов МонЛТ против АФП направленных к двум разным детерминантам АФП. В данном примере использовали МонАТ F2-84, иммобилизированное на пластике и связывающее АФП, а также конъюгат МонАТ С9-84 с ферментом, проявляющий связавшийся АФП.

Приготовление конъюгата на основе МонАТ. Очищенную фракцию иммуноГ ЛОбуЛПНОВ МЬШШ. ПОЛ -1й|1Ь 10 ИЗ J.C

цита С9-8-15 хонъюглр.-, i.i л ; ,., г ..., методом с пероксилазой хрена

В ка-,. с1, ье ч- .гполь зуют сорбированную HP п: зйтс- .I .H HL . ную фракцию ip.Myi-ioivin y ;л;с,

полученн то из гсипта ло то)т же методике. Белок во фракциях оире- делили на cпeкrrpoфoтo icтpc ,

Определение АФП иммуно.1эерментным проводят на стандартах АФП

из коммирчоского наоора.

Анализ проводят с сдуьч нм( об-разом.

Б 96 - луночные полис проловые платы заливают по 100 мкл очищенной фракции иммуноглобулинов F2-84 в концентрации 2,5 мкг/мл на забуфереином

физиологическом растзорг (ЗФГ) рН 7,3 г. инкуб ми ую г 1,j-2 ч После „ ленпя содер; го лунк . прок , вают ЗФР. Свободные участки пластика блокируют 200 мкл G,5 i-Horo сы

вороточног о ал1 бумлн.1 человека на ЗФР -2 ч при 37°(,. После удаления содержимого и однократного промывания ЗФГ в лунхн ; дуплетах вносят но 100 мк i смеси кснъктата. разведеннгго в 800 раз б сЬегмм из коммерческого набора, с кажгым из стандартов ЛФП }i отдельное т . (0. 2,5,. 59 10, 20 ь 40, 80, 100 и 320 нг/м О в соотноше0

5

0

нии

и ИПКУ .ЧШУЮТ

5

5

при 37°С 1,5- удаляют, 3 раза промывают ЗОР с О„03Z твнна 20 и 1 раз гчс тиллпронапьоп водой. а послеРНС-М пчане ан.ппчл в но- бавлягат по ЮС мк i раствора субстрата (13 мг ортобепилендиамипа на 10 т фоссЬат-цнтратиого бугЬера рН 5,5) и через 30 мин измеряют оптическую плотность раствора в каждой лунке при длине волны 490 им на спектрофотометре МР 590. Учнп-шают среднее значение оптической плотности для каждого стандарта и строят калибровочную кривую,

Конъмп-ф тваньос с фермегтом МонАТ С9-84 пригодно лля опрелеченпя АФП в сочетании с МонЛТ F2-8j (на твердой Лазе). Опреде-ляемяя концентрация АФП лежит в диапазоне 2,5-320 нг/мл. Формула изобретения

Штамм культивируом -гч гибридных клеток животных Mas musculus L. ВСКК (IT) № 34ol) - продуцент IOHOICTO- нальных антител против а и.фа-фетопро- теина человека.

li JOOnOTi. ИГ ,: НОСИ ГГЯ К JMnpl-r- ДОМНОП ТОХНОЛОГ Н It МОЖСТ Гм.ГГЬ :,С пользована для определения фетопрота дня в тммуио Ьерчсп гном чс- тоде. Цель изобретения - почучепне штамма культивируемых гиор д;:их клеток . Ihis mn-culus Lcr пролу- u,ripy:o; iHX моноклокальные антитела (МонЛТ) к альфп-Лсгопротеньу (АФТ) человека и кш отных. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X6J, Ag 3o65J со CTurciioMiiTaMif Mbnjefi с , имму ii m up он an пых очюценкым АФП чслсвока. г амм депонирован под ВСКК It; 3-oOt 1тамм кутьтивчруюг в cpe-u- Mi4 RFMi 1640 с 15% сыворотки чмбриоч.я коровы и стандартными короткожипуп пп добапка 1 при 5« СО2 в яо-тду е. Кдетк1: пересевают каж п..с i-Ь дня с начальной плотностью 1-2 . С 1еткн секретирхют МонАТ класса i,eG1. Гнтр МонДТ в супсрчатан- тах около 2000. в лсцптинх жидкостях 105 при онреде ICHHH ifi-i-л нофер- мен гным методом. {Л с: