Штамм бактерий РRотеUS VULGaRIS-продуцент рестриктазы Р @ II Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5f-CAGCTG-3 , данный сайт узнавания является единственным в ДНК плазмиды рВ R 32г и ряде челночных плазмид (41р5, 4Rp17, 4Ep2), что определяет возможность широкого использования этой рестриктазы.

Цель изобретения - выявление штамма-продуцента Proteus vulgaris В-3671 (84), нетребовательного к питательным средам и синтезирующего одну сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5;- CaGCTG-З с более высоким выходом.

Штамм выделен как контаминант при глубинном культивировании гемофиль- ных микроорганизмов.

Штамм Proteus vulgaris 84 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные размером 0,5- 0,6 мкм на 1,0-2,5 мкм, прямые или почти прямые, в стационарной фазе имеется вариабельность по размерам. Не образуют эндоспор. Беспигментный, грамотрицательный.

Физиологические признаки.

Факультативный анаэроб, усваивает гЛюкозу с образованием кислоты и гаОЭ

ю

&ь

за, выделяет , индолположительный разжижает желатину, дезаминирует фе нилаланин, каталазоположительный. От типового вида Proteus vulgaris от- личается по способности сбраживать маннозу и ксилозу.

Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных комплексных питательных средах (СПАХ МПБ) при температурах 30-37°С и рН 6,8- 7,0. Колонии на агаризованных средах округлые, сероватого оттенка, края ровные. При культивировании дает специфический запах.

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом, в растворе глицерина при -70°С или в лиофильно- высушенном состоянии.

Биотехнологические свойства штам- ма.

При исследовании биомассы в ней обнаружена и выделена рестриктаза Pvu II, способная узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CAGCTG-3;.

Для глубинного культивирования используется доступная дешевая среда на основе рыбного гидролизата, вместо пептоносолевой среды. Предлагае- мый штамм характеризуется высоким выходом рестриктазы Pvu II, составляющим 80-100 тыс.е.а./г (в 2 раза больше, чем у известного штамма).

Пример 1 . Клетки Proteus vul garis 84 бактериологической петлей пересевают на чашки Петри с агаризо- ванной средой (на основе 3,5%-ного рыбного гидролизата), содержащей 1%-ную донорскую кровь. Чашки с за- сеянной культурой инкубируют в термостате при 30°С 16 ч. Подросшую културу переносят в жидкую питательную среду следующего состава: рыбный гид ролизат 3,5%, вода дистиллированная остальное, рН 7, 2. Культивирование осуществляют в термостатированных качалках при 30°С; 200 об./мин, до стационарной фазы роста.

Глубинное культивирование прово- дят в ферментере Microferm в аналогичной среде при 30°С, аэрации 1 объем в минуту, 200 об./мин мешалки. В течение культивирования следят за поддержанием рН и оптической плот

ностью. При достижении ранней стацио нарной фазы роста (оптическая плотность gee - 2,7) культивирование прекращают. Биомассу осаждают центрифуги

с

ю 15

20

25

0

,,- 4Q 45

55

рованием. Выход биомассы составляет 3,7 г/л.

Замороженную или сырую биомассу Proteus vulgaris 84 в количестве 10 г переносят в стакан вместимостью 50 мл, добавляют 30 мл буфера А, содержащего 0,02М КН,рР04; 0,001 М ЭДТА; 0,01 М 2-меркапто- этанол, рН 7,0, Содержимое стакана суспендируют на магнитной мешалке до получения однородной суспензии. Ее обрабатывают ультразвуком пять раз по 40 с (ультразвуковой дезинтегратор MSE), мощность 200-300 Вт, частота 20 кГц, амплитуда 14 мкм) с охлаждением на ледяной бане. Клеточный дебрис отделяют центрифугированием, 1600 об./мин, 30 мин, центрифуга 1-21.

30 мл осветленного лизата наносят на колонку с 100 см3 фосфоцеллюлозы Р-11 Сорбированный материал элюиру- ют буфером Б (0,02 М КНгР04; 0,01 М 2-меркаптоэтадол; 0,001 М ЭДТА; 1 М NaCl, рН 7,0) до тех пор, пока поглощение элюата не станет равным поглощению буфером Б. Объем смыва 200 мл.

Смыв переносят в диализные мешки и диализуют против буфера А (3 л по 8 ч). Супернатант после диализа наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой объемом 8 см3 со скоростью 20 мл/ч. Колонку промывают буфером А. Фермент элюируют линейным градиентом концентрации 0-1 М NaCl, объем градиента 100 мл. Элюат собирают фракциями по 5,0 мл. Фракции, содержащие фер-. мент, объединяют и диализуют против буфера А (3 л) в течение 16 ч, наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 объемом 4,5 см3. Фермент элюируют линейным градиентом 0-1 М NaCl. Объем градиента 50 мл. Элюат собирают по 1 мл фракциями, общий объем 10 мл. Полученный препарат диализуют в течение 16 ч против 400 мл буфера Б. Выход рестриктазы Pvu II составляет 100 тыс.е.а./г.

Пример 2. Культивирование биомассы и выделение фермента проводили как и в примере 1, но использовали предварительный пассаж на агари- зованной среде без добавления крови. Выход фермента составил 20 тыс.е.а./г.

П р и м е р 3. Получение фермента проводили как в примере 1, но при пассировании штамма Proteus vulgaris 84 В-3671 на агаризованной среде при5 16329746

меняли 0,5%-ную донорскую кровь. Вы-.-Полученный штамм обладает следуюход фермента составил 80 тыс.е.а./г. преимуществами по сравнению с

П р и м е р 4. Пассирование прово-известным: содержит одну сайт-спедили как в примере 1, но при концент-ДиФическую эндонукпеазу рестрикции

рации крови Т,5%. Наблюдали угнете- Pvu Ы пР°ДУДирует в 2,5 раза больние роста, выход биомассы составилше Ъ евого фермента, чем известный

3 г/л. Выход рестриктазы 90 тыс.е,а./г.штамм нетребователен к питательным

ПримеР5. Получение фермен-средам а также Устойчив при хранета проводили как в примере 2, но,0 ШИ Различньк УСЛОВИЯХ.

использовали концентрацию рыбногоФормула изобретения

гидролизата 4%. Выход фермента неШтамм бактерий Proteus vulgaris

изменялся, но наблюдается уменьшениеВКПМ В-3671 - продуцент рестриктазы

урожая биомассы до 3,2 г/л.. Pvu И«

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции Pvu II, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5J- CAGCTG-3. Штамм Proteus vulgaris