Штамм дрожжей HaNSeNULa роLYмоRрна -биотрансформатор метанола в формальдегид Советский патент 1991 года по МПК C12N1/16 C12P7/24 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма, трансформирующего метанол в формальдегид.

Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего повышение выхода формальдегида.

Новый штамм Hansenula polymorpha АЗ-24 получен из дикого штамма типа Hansenula polymorpha DL. 1, который хранится в музее Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, г. Пущино, путем направленного микростадийного мутагенеза под воздействием УФ- лучей.

При мутагенезе используют дозу УФ-лу- чей, обеспечивающую 10% выживания клеток. Вначале отбирают мутанты из штамма, резистентные при росте в среде с глюкозой к 0,1 мМ аллиловому спирту. Один из полученных мутантов впоследствии подвергают УФ-индуцированному мутагенезу и отбирают штаммы, проявляющие повышенную резистентность при росте в среде с метанолом к повышенным концентрациям формальдегида (последовательно 6,10.12 мМ). ,

Полученный штамм дрожжей Hansenula polymorpha АЗ-24 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под № У-705.

Штамм Hansenula polymorpha ВКПМ № У-705 характеризуется следующими куль- турально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культу рал ьно-морфологические признаки. Вегетативные клетки при выращивании на сусло-агаре плотностью 8°Б при 37°С в течение 2-3 сут имеют круглую или овальную форму размером (1,5-4,б)Х (1,9-5,3) мкм. Клетки одиночные, редко встречаются небольшие скопления из 2-3 клеток. Размножение почкованием. В основном расположение почек апикальное. Мицелий или

о со VJ

о

чэ

псевдомице;лий культура не образует, капсула отсутствует. Включения при просмотре в световом микроскопе выражены слабо. Реакция с диазонием синим отрицательная. Вегетативные споры не образует. Культура не способна к спариванию. При длительном культивировании на сусло-агаре (более 2-х недель) около 0,5-1 % клеток содержат споры,

На сусло-агаре после 2-4 сут культивирования при 27, 30 и 37°С колонии и штрих светлокремовые, выпуклые, блестящие, с ровными краями, сметанообразной консистенции, легко снимается петлей.

В жидкой среде при выращивании на солодовом сусле плотностью 8°Б при 37°С в статических условиях на 2-3 сут образуется кольцо и островки очень тонкой пленки, а затем осадок клеток слегка кремового цвета. При выращивании культуры в указанных условиях на качалке рост отмечается в виде помутнения среды.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Температурный диапазон роста 10- 42°С, оптимальная температура 37°С. Оптимум рН для роста 5,5. Культура растет в присутствии 1 М сорбита. В среде с 10%- ным NaCI рост слабый.

Чувствителен к циклогексимиду, анти- мицину П, нистатину, резистентен к ампи- цилину, тетрациклину.

Отношение к источникам углерода: хорошо утилизирует глюкозу, мальтозу, трега- лозу, рибозу, эритрол, рибитол, маннит, глицерин, этанол, метанол, плохо утилизирует ксилозу, сахарозу, рамнозу, лимонную кислоту, янтарную кислоту, не утилизирует галактозу, лактозу, раффинозу, L-арабино- зу, крахмал.

В качестве источников азота хорошо ус- ваиват соли аммония и нитраты.

Рост штамма в синтетических средах абсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост.

При росте в среде с глюкозой штамм характеризуется отсутствием алкогольокси- дазной и формальдегидредуктазной активностей.

После выращивания в среде с метанолом клетки обладают активностью алкоголь- оксидазы, формальдегидредуктазная активность отсутствует.

Прототроф.

Клетки штамма не содержат плазмид, % ГЦ пар составляет 48%.

Штамм нетоксичен в опытах на белых мышах.

Штамм хранится на скошенном суслоагаре при 4°С, пересевы следует производить через 3-4 мес.

Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером использования штамма Hansenula polymorpha ВКПМ Ns У-705.

П р и м е р 1. Штамм выращивают до середины экспоненциальной фазы в среде следующего состава (из расчета на 1 л среды): метанол 4 мл, (NH4)2S04 3 г, КНгР04 1 г, MgS04 7H20 0,5 г, CaCIa 0,1 г, дрожжевой экстракт 0,5 г. Культивирование ведут на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 24 ч. Затем клетки осаждают центрифугированием и переносят в свежую ростовую среду, содержащую клетки (10 мг сухого веса/мл), 0,1 М фосфатный буфер с рН 6,0 и метанол (10% по объему). После инкубации на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение

24 ч клетки осаждают центрифугированием. Формальдегид идентифицируют по специфической реакции Нэша с ацетилаце- тоном. В указанных условиях штамм накапливает в среде 0,5 м формальдегида.

На чертеже приведена калибровочная кривая. Концентрации фомальдегида в среде, где кривая 1 - спектр поглощения продукта реакции стандартного 2,1 мМ раствора формальдегида с ацетилацетатом, кривая 2 - то же, для формальдегида, полученного биотрансформацией 1,03 мМ метанола (культуральная жидкость, содержащая 0,618 М формальдегида, разбавлена в 600 раз).

Формула изобретения

Штамм дрожжей Hansenula polymorpha ВКПМ N° У-750 - биотрансформатор метанола в формальдегид.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма, трансформирующего метанол в формальдегид. Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего повышение выхода формальдегида. Новый штамм представляет собой штамм дрожжей Hansenula polymorpha АЗ-24, полученный из дикого штамма Hansenula polymorpha DL 1 путем направленного многостадийного мутагенеза под действием УФ-лучей. Штамм Hansenula polymorpha АЗ-24 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под № У-705. Штамм в среде с метанолом накапливает 0,6 М формальдегида. 1 ил.