Способ тестирования рестриктаз S @ и S @ из микроорганизмов рода SтRертомYсеS Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаз Sac II и Sst II в микроорганизмах рода Streptomyces и может быть использовано в молекулярно- биологических и биотехнологических исследованиях.

Цель изобретения - повышение специфичности тестирования.

Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и подвергают гидродинамическому разрушению ультразвуком. Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55°С в течение 10-15 мин. После охлаждения до 4-6°С экстракт освобождают от дебриса, а надосадок содержит рестриктазу Sac II или ее изошизомер Sst II. Активность ферментов на 1 г влажных клеток составила не менее 6000 ед. для рестриктазы Sac II и не менее 10000 ед. для Sst II. Экстракт разрушенных клеток микроорганизма-продуцента нескольких экдонуклеаз рестрикции подвергают термообработке при 50-55°С, в результате повышается точность определения целевой рестриктазы (Sac II и Sst II) за счет освобождения клеточного экстракта от сопутствующих термолабильных ферментов. Термообработка клеточного экстракта позволяет также облегчить селекцию по целевому продукту, а из нескольких продуцентов выбрать наиболее активный.

В таблице приведена зависимость точности тестирования рестриктаз от режима термообработки клеток.

Как видно из таблицы, оптимальной для тестирования рестриктаз Sac II и Sst II является обработка клеточного экстракта при

О

со

VJ

50-55°С. При температуре ниже 50°С сохраняется картина рестрикции, характерная для двух эндонуклеаз рестрикции (Sac I + Sac II или Sst I f Sst II), при 60°С и выше инактивируются.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Один грамм биомассы S.achromogenes ATCC 12767 суспендируют в 4 мл трис- буфера рН 7,5, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэ- танола. Суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т на резонансной частоте в диапазоне 22 кГц в течение 4-6 мин. Экстракт разрушенных клеток прогревают 15 мин при 50°С и центрифугируют 30 мин при 18000 об/мин. Активность рестриктазы Sac II в полученном супернатанте тестируют методом гидролиза ДНК фага А с 857 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в горизонтальном блоке а га- розы. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое в течение 1 ч полностью специфически расщепляет 1 мкг ДНК.

Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 мМ трис-буфер рН 7,5,6 мМ MgCl2. 6 мМ Ш, 6 мМ 2-меркаптоэтанол. 1 мкг ДНК Я с 1857 в 40 мкл смеси и 2-10 мкл грубого экстракта клеток. Разделение полученных фрагментов проводят в 0,1 М Na-боратном буфере рН 8,2, содержащем 2 мМ ЭДТА, в 1% агарозном геле. Окрашенные этидий-бромидом (1 мкг/л) гели просматривают в УФ-свете.

Активность рестриктазы Sac II в грубо очищенном экстракте клеток составила 6000 ед. в 1 г влажной биомассы или 90900 ед. в 1 г сухого мицелия.

0

5

Пример 2. Тестирование рестриктазы Sst II в грубоочищенном экстракте клеток S.stanford ATCC 29415 проводят аналогично примеру 1. Активность рестриктазы Sst II составила 10000 ед. в 1 г влажных клеток или 150500 ед. в 1 г сухого мицелия.

Пример 3. Тестирование рестриктазы Sst II проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что экстракт разрушенных клегок S.stanford не подвергают термо- обрэЬотке. Активность рестриктазы Sst II в грубом клеточном экстракте не определяется, тестируется суммарная активность двух рестриктаз из-за присутствия рестриктазы Sstl.

Пример 4. Тестирование рестриктазы Sst II проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что клеточный экстракт прогревают 10 мин при 55°С. Активность

0 фермента составляет 10000 ед. в 1 г влажных клеток.

Пример 5. Тестирование рестриктазы Sst II проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что экстракт разрушенных клеток прогревают 12 мин при 52°С. Активность рестриктазы Sst II в грубо очищенном препарате клеточного экстракта S.stanford составляет 10500 ед. в 1 г влажных клеток.,

0

Формула изобретения Способ тестирования рестриктаз Sac И и Sst из микроорганизмов рода Streptomyces, предусматривающий получе5 ние грубого экстракта путем разрушения клеток ультразвуком, центрифугирование с получением супернатанта, отличающий- с я тем, что, с целью повышения специфичности тестирования, экстракт разрушенных

0 клеток микроорганизмов подвергают термообработке при 50-55°С в течение 10-15 мин.

5

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаз Sac II и Sst II рода Streptomyces и может быть использовано в молекулярно-биологических и биотехнологических исследованиях. Целью изобретения является повышение специфичности тестирования. Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и разрушают ультразвуком. Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55°С в течение 10-15 мин. После охлаждения до 4-6°С экстракт, содержащий рестриктазу Sac II или Sst II, освобождают от дебриса. Активность ферментов на 1 г влажных клеток составляет не менее 6000 единиц для рестриктазы Sac II и не менее 10000 единиц для рестриктазы Sst II. 1 табл. Ё