Способ определения фракций казеина молока Советский патент 1991 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к аналитической и количественной биохимии, в частности к исследованию казеинов молока.

Цель изобретения - увеличение точности и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для растворения казеина и электролита электрофоретической камеры ис- пользуют барбиталовый буферный раствор с рН 8,60-8,75, состоящий из 15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 И мочевины, а для растворения геля агар-агара используют смесь буферных растворов с рН 8,60-8,75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия, 5,5 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и трис-цитратного раствора, состоящего из 34,52 г триса, 3,8 г

15

цитрата на 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,ОМ. При этом для электрофореза используют агар-агар 1,4-1,5%-ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138Х Х200 мм, приготовленного из 30 мл 3%-ного расплавленного до 70-80°С геля агар-агара, барбиталового раствора .„ и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые смешивают до образования однородной жидкости, а казеин используют 6,8-7,2%-ной концентрации в количестве 0,019 мл. Количественное определение фракций зеина проводят на микрофотометре с автоматической записью денситограм.

Барбиталовый буферный раствор в качестве электролита выгодно отличается своей стабильностью, поскольку один и тот же объем его можно использовать для 10-12 электрофоретических разгонок.

Для проведения одного анализа используется только 30 мл образца молока.

Применение геля агар-агара 1,4- 1,5%-ной концентрации в растворе двух буферов барбиталового и трис- цитратного, 8,0 М мочевины в сочетании с использованием малого объема (0,019 мл) 6,8-7,2%-ной концентрации казеина в барбиталовом буферном растворе и 8,0 М мочевины способствуют глубокому расщеплению дисульфидных связей в структуре казеина и четкому его делению на 16-18 отдельных фракций

раствора, разогретого до 80°С. После охлаждения раствора до Т 7° С объем его доводят до 1 л барбиталовым буфером. Раствор казеина хранят в холодильнике при +2°С.

Агар-агар марки Корсаковский в количестве 30,0 г/л промывают дистиллированной водой встряхиванием на шу- тсль аппарате 3-4 дня. Воду меняют 3 раза в сутки. Суспензию агар-агара. 2,5 ч расплавляют на кипящей водяной бане. Добавляют 0,001 г/л мертиолята. Фильтруют через 10 слоев белой марли, разливают в стеклотару для одноразового использования о Закрытыми хранят впрок при 6 С в холодильнике.

Для растворения геля агар-агара используют смесь двух буферных растворов с рН 8,75, подогретую до 80°С, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбиталового натрия, 5,5 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 34,52 г триса, 4,8 г цитрата на 1 л дистиллированной воды в соотношении 1:1 с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 М.

20

25

30

Затем проводят электрофорез с использованием казеина 6,8-7,2%-ной концентрации в количестве 0,019 мл, агар- агара с размером 138 200 MMS приготовленного из 30 мл, 3%-ного расплавof

эс ленного геля агар-агара при 80°С, барбиталового раствора в количестве г 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, лотовые разме „ „лп иивают до образования однородной жидПример. Общий казеин получают чи.

кости, наносят на фиксированную рамкой (138x200x3 мм) химически чистую стеклянную пластину (230x160Х2 мм) на столике. Последний, помещенный в бы- 45 товой холодильник с температурой 6 С, предварительно нивелируют по горизонту. Для лучшего сцепления блока агар- агара со стеклом последнее покрывают

из 30 мл свежего обезжиренного коровьего молока путем прибавления к нему смеси (1:1) 0,1 н. уксусной и соляной кислот при рН 4,6. Казеин получают центрифугированием. Осадок казеина растворяют в 30 мл дистиллированной воды, центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Свободный от сывороточных белков казеин переосаждают 2 раза в 0,1 М растворе NaOH и 0,1 н. растворе смеси 1:1 уксусной и соляной кислот. Затем казеин растворяют. в варбиталовом буферном растворе с

рН 8,6, состоящем из 15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины. Для этого 480 г мочевины растворяют в 490 мл барбиталового буферного

тонким слоем 3,0%-ного расплавленного en геля агар-агара и прогревают при 80 С. Во избежание вытекания жидкого геля из рамки ее заплавляют с внутренней стороны разогретым 3%-ным гелем агар- агара при помощи пастеровской пипет- , ки. Пластину с гелем оставляют в холодильнике на ночь до следующего утра. Во избежание возможного замерзания и испарения геля его сверху зл- крывают и утепляют.

15

. .„ о

6494274

раствора, разогретого до 80°С. После охлаждения раствора до Т 7° С объем его доводят до 1 л барбиталовым буфером. Раствор казеина хранят в холодильнике при +2°С.

Агар-агар марки Корсаковский в количестве 30,0 г/л промывают дистиллированной водой встряхиванием на шу- тсль аппарате 3-4 дня. Воду меняют 3 раза в сутки. Суспензию агар-агара. 2,5 ч расплавляют на кипящей водяной бане. Добавляют 0,001 г/л мертиолята. Фильтруют через 10 слоев белой марли, разливают в стеклотару для одноразового использования о Закрытыми хранят впрок при 6 С в холодильнике.

Для растворения геля агар-агара используют смесь двух буферных растворов с рН 8,75, подогретую до 80°С, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбиталового натрия, 5,5 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 34,52 г триса, 4,8 г цитрата на 1 л дистиллированной воды в соотношении 1:1 с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 М.

20

25

Затем проводят электрофорез с использованием казеина 6,8-7,2%-ной концентрации в количестве 0,019 мл, агар- агара с размером 138 200 MMS приготовленного из 30 мл, 3%-ного расплавof

ленного геля агар-агара при 80°С, барбиталового раствора в количестве г 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, лотовые разметонким слоем 3,0%-ного расплавленного геля агар-агара и прогревают при 80 С. Во избежание вытекания жидкого геля из рамки ее заплавляют с внутренней стороны разогретым 3%-ным гелем агар- агара при помощи пастеровской пипет- ки. Пластину с гелем оставляют в холодильнике на ночь до следующего утра. Во избежание возможного замерзания и испарения геля его сверху зл- крывают и утепляют.

Прозрачный твердым блок геля агар- агара освобождают от рамки, ставят на трафарете, вырезают 8 лунок размером 10x1,5 мм на расстоянии 6 мм одну от другой и 90 мм от катода (-). В каждую лунку микропипеткой вносят по 0,019 мл раствора 6,8-7,2%-ного казеина. Блок геля с материалом кладут на металлический столик с охлаждением проточной водой электрофоретической камеры.

Две кюветы электрофоретической камеры заполняют по 1 л барбиталовым буферным раствором с рН 8,75, состоя- щим из 15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины. Для - этого 480,0 г мочевины растворяют в 490 мл барбиталового буферного раст- вора, разогретого до 80°С. После охлаждения раствора до 17 С объем его доводят до 1 л барбиталовым буферным раствором. Контакт между блоком геля

ка обеспечивает увеличение точности деления казенна на фракции и упрощение его выполнения, увеличение числа четких фракций казеина молока до 16- 18, сокращение времени процесса элек трофореза с 18,5 ч по прототипу до 5,25 ч, т.е. в 3,5 раза.

Количественное определение содержания фракций казеина на микрофотометре с автоматической записью денсн- тограмм является объективным способом исследований, устраняет элемент ручной обработки электрофореграмм.

Формула изобретения

Способ определения фракций казеина молока, предусматривающий растворение казеина, геля агар-агара, электролита электрофоретической камеры в буферном растворе, проведение электрофореза с использованием агар-агара и казеина и определение фракций казеина, о т

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к аналитической и количественной биохимии, в частности к исследованию казеина в молоке. Цель изобретения - увеличение точности и упрощение способа. Для ра- етворения казеина и электролита элек- 1фоАоретической камеры используют барбиталовый буферный раствор с рН $,60-8,75, состоящий из 15,48 г бар- 0ктала натрия, 2,75 г барбитала на f л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины, а для растворения геля агар- агара используют смесь буферных растворов с рН 8,6-8,75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия, 5,50 г барбитала на 1 л дистиллированной в ды и 34,52 г триса, 4,80 г цитрата на 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 М. Для электрофореза используют агар-агарi 1,4-1,5%-ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138x200 мм, приготовленного из 30,0 мл 3%-ного расплавленного при 70-80°С геля агар- агара, барбиталового раствора в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при -этом казеин ис- пользуют 6,8-7,2%-ной концентрации в количестве 0,019 мл в барбиталовом буферном растворе рН 8,60-8,75 и содержанием 8,0 М мочевины. cs «S

агар-агара и буфером кювет электрофо- 25 л и ч а ю щ и и с я тем, что, с церетической камеры с платиновыми электродами осуществляют при помощи поролоновых мостиков-фитилей размером мм. Электрофорез проводят при следующем режиме: 80 В - 60 мин, 130 В - 75 мин и 180 В - 180 мин. После окончания электрофореза стеклянную пластину с гелем 36 ч фиксируют в 1 л 4%-ного раствора уксусной кислоты, сменяя его 2 раза. Отмытый гель сверху закрывают промоченной фильтровальной бумагой размером, соответствующим блоку, во избежание образования трещин, сушат при 37 С, красят 1 ч 1%-ным раствором амидо- черного 10 В на 7,0%-ной уксусной кислоте Затем отбеливают протеино- граммы 2,0%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением 2%-ного глицерина. Количественное содержание каж- д агаР 1,4-1,5%-ной концентрации, толдой из 16-18 фракций казеина определяют сканированием (микрофотометр) с автоматическим самописцем и интегратором. Общий казеин согласно предложенному способу разделяется на 16- 18 четких фракций, которые соответствуют 6-9 Фракциям -казеинов, 2-3 фракциям К-казеинов, 3 фракциям Й-ка- зеинов и 5-7 фракциям }f-казенной,

щиной 2,8-3,0 мм, размером 138x200 мм приготовленного из 30 мл 3%-ного расплавленного геля агар-агара при температуре 70-80вС, барбиталового раст- JQ вора в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при этом ,

Использование предлагаемого спосо- ее казеин используют 6,8-7,2%-ной кон- ба определения йракций казеина моло-центрации в количестве 0,019 мм.

лью увеличения точности и упрощения способа, для растворения казеина и электролита электрофоретической камеры используют барбиталовый буферный

0 раствор рН 8,6-8,75, состоящий из

15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины, а для растворения геля агар-агара используют смесь бу- ферных растворов с рН 8,6-8,75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия и 5,5 г барбитала на 1 л дистшыирован- ной воды и трис-цитратного раствора,

0 состоящего из 34,52 г триса, 4,8 г цитрата на 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,ОМ, а для электрофореза используют агар д агаР 1,4-1,5%-ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138x200 мм, приготовленного из 30 мл 3%-ного расплавленного геля агар-агара при температуре 70-80вС, барбиталового раст- JQ вора в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при этом ,