Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой штамм, который можно использовать для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей последовательность нуклеотидов 5- TCC-GGA-3 в составе двухцепочечной ДНК и расщепляющей ДНК в этой области.

Цель изобретения - выявление штамма Bacillus llchenlformis ВКПМ В-4722 (В 13), продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом.

Штамм бактерий Bacillus llchenlformis В-13 выделен в результате поиска продуцентов оестриктаз среди микробов воздуха вне помещения.

Штамм бактерий Bacillus licheniformls имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. В молодой культуре (16-18ч) клетки подвижные, палочковидные, небольшие 0,5-0,7 мкм в поперечнике и 2-4 мкм в длину. Располагаются поодиночке, парами. Споры эллиптические 0,6 х 1 мкм. Отчетливой раздутости спорангия нет. Грамположительные.

Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб, каталазоположи- тельный. Аэробно слабо образует кислоту из глюкозы, сахарозы, мальтозы, глицерина, маннита, но Ке из арабинозы, сорбита, рам- нозы, лактозы, этанола. Из глюкозы также образует ,ацетоин, но не газ. Анаэробно из

о сл

о о

VI

глюкозы образуют кислоту, Гидролизует крахмал, казеин, желатин, твин-80, Дезами- нирует аргинин. Сероводород и индол не образует. Восстанавливает нитрат в нитрит. Чувствителен к ампилициллину, хрорамфе- николу, канамицину, стрептомицину, тетрациклину (100 мкг/мл среды 1). Используют глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии для роста. Растет при 10 - 55°С, оптимум 37°С, рН среды 6-8, оптимум рН 7,0, концентрация NaCI 0 - 7%, оптимум 0,7%. Содержание Г + Ц в ДНК 49% (по плавучей плотности).

Культуральные признаки. Среда 1, пита- тельный агар, г/д: панкреатический гидролизат кильки 17,9; NaCI 5,9; агар 11,2, рН 7,3± 0,1. После 17 ч инкубирования при 37°С образует плоские неправильной формы шероховатые, морщинистые, серые колонии диаметром 1 см и более, часто заполняющие всю поверхность агара. Выращивание при 20°С позволяет получить отдельные колонии, которые первоначально круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, прозрачные, затем становятся шероховатыми, серыми, неправильной формы.

Среда 2, питательный бульон, г/л: гидролизат кильки 33; NaCI 7, рН 7,2-7,4.

При выращивании с интенсивной аэрацией при 37°С штамм дает равномерное помутнение. Среду используют для препаративного выращивания биомассы.

Среда 3, твердая минимальная, г/л: глюкоза 3; NH/iN030,3; KH2P040,1; taHPCM 0,1;МдЗСм 0.05; NaCI 0,05; СаСОз0,5; FeSC-4 0,0005; агар 15; водопроводная вода. После 50 ч инкубации при 30°С дает плоские колонии неправильной формы. Среду используют для выявления минимальных пищевых потребностей штамма.

Пример 1. Выращивание биомассы и выделение рестриктазы ВН 13 I.

Культуру выращивают на среде 2 при 37°С, аэрации 1,5 л/л мин, скорости вращения мешалки 200 об/мин. Когда оптическая плотность культуры достигает 4,5 при

550 нм, клетки осаждают центрифугированием и хранят при -20°С. Выход биомассы 7,0 г/л.

Рестриктазу выделяют по известной схеме, включающей разрушение клетокультразвуком, гель-фильтрацию на биогеле А

0,5 М, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе

и фосфоцеллюлозе. Фермент хранят при 20°С в буфере с 50%-ным глицерином.

Параметры получения рестриктаз из

Bacillus llchenlformis В 13 и Acinetobacter calcoaceticus приведены в таблице.

Пример 2. Определение активности рестриктазы ВИ 13 L

Реакционная смесь в 20 мкл содержит

0,5 мкг ДНК фага, Я0.05 М трис-HCI (рН 8), 0,2 М NaCI, 0,01 М MgCla. Для определения активности аликвоты фермента 1 - 10 мкл вносят в реакционную смесь, инкубируют при 55°С в течение 1 ч, затем проводят электрофорез в 1 %-ном агарозном геле. За единицу активности фермента принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Я в условиях реакции.

Таким образом, предлагаемый штамм, по сравнению с известными, обеспечивает повышенный (в 5 раз) выход целевого фермента; продуцирует только одну рестрикта- зу и позволяет сократить технологически

трудоемкие хроматографические стадии очистки (с 5 стадий в известном способе до 3 в предлагаемом).

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-4722 - продуцент рестриктазы ВМ 13 I.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Bacillus lichenlformls ВКПМ В-4722(В-13), продуцирующего рестриктазу с более высоким выходом фермента. Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bli 13 I, которая является изо- шизомером рестриктазы Ssp. Ml Bli 13 I, узнает последовательность 5LTCCGGA-3 в составе двухцепочечной ДНК. Биомассу штамма выращивают в питательном бульоне на основе гидролизата кильки до поздней логарифмической фазы. Клетки разрушают ультразвуком и рестриктазу получают хро- матографической очисткой на биогеле А 05М, ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе. Выход фермента 5000 ед. на 1 г биомассы. Препарат пригоден для генно-инженерных работ. 1 табл. сл С