Ё
Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и может быть использовано как инструмент для получения фрагментов ДНК: картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул ДНК. Цель изобретения - выявление штамма Bacillus llchenlformls ВКПМ В- 4268 (49), продуцирующего рестриктазу ВИ 49 I, способную узнавать на двухнитевой ДНК последовательность нуклеотидов 5... GGTC ТС... 3. Штамм выделен из почвы. Выход фермента 1000 ед/r биомассы.
Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и может быть использовано как инструмент для получения фрагментов ДНК, картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул ДНК.
Цель изобретения - выявление штамма Bacillus llchenlformis ВКПМ В-4268 (49) продуцирующего рестриктазу ВП 49 I, способную узнавать на двухнитевой ДНК последовательность нуклеотидов 5...GGTCTC...3.
Штамм выделен из почвы и характеризуется следующими признаками.
. Морфологические признаки - прямые палочки, размер клеток 18 часовой культуры 1,5x0,6 мкм. Клетки располагаются одиночно, либо цепочкой. Эллипсовидные споры располагаются -в клетке субтерминально.
Клетки при спорообразовании не раздува ются.
Культурэльные признаки - на твердом мясо-пептонном агаре через 18ч роста при 37°С образуются колонии с матовой шероховатой поверхностью серовато-белого цвета, врастающие в агар. Образование спор начинается через 48-72 ч при выращивании на мясо-пептонном агаре при 37°С.
После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются глобулы. Рост на жидкой питательной среде характеризуется равномерным помутнением.
Физиолого-биологические признаки - грамположительные аэробные спорообра- зующие палочки. Продуцируют каталазу. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, маннит с образованием кислоты, ксилозу не использует. Утилизирует цитрат и пропио- нат, гидролизует крахмал, редуцирует нитJb
3
раты, в аэробных условиях из нитратов образует газ, дает положительную реакцию Фогес-Проскацэра. Растет в анаэробных условиях, не продуцирует аргинигидролазу, не гидролизует мочевину.
Пример, Штамм В. lichenlformis 49 хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления культуру пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 ч. Для получения биомассы культуру засевают в колбу объемом 3 л, содержащую 700 мл среды, содержащую, г/л: дрожжевой экстракт 5; триптон 5; натрий хлористый 5, и инкубируют в условиях качалки до средней логарифмической фазы, затем клетки отделяют центрифугированием при 10000 д. Выход сырой биомассы 5 г/л.
0,5 г клеток суспендируют в 0,5 мл буфера А (0,2 М NaCI, 0,01 М К-фосфат, рН 7,0 2 мМ дитиотрейтол, 0,1 мМ ЭДТА) разрушают ультразвуком при охлаждении льдом, -клеточные стенки осаждают при 40000 д. Надосадочную жидкость хроматографуют на колонке 1,5x30 см с Toyopeari HW- SS,
уравновешенной в том же буфере со скоростью 20 мл/ч, фракции 0,8 мл. Активность рестриктазы определяют по гидролизу ДНК фага А/ продукты реакции анализируют
5 электрофорезом в геле 0,8% агарозы. Фракции, содержащие рестриктазу, объединяют, диализуют против буфера А, содержащего 50% глицерин и хранят при -20°С. Выход фермента 1 тыс. ед/г биомассы.
0 Специфичность рестриктазы Bli 491 определяли по гидролизу ею различных ДН К с известной первичной структурой (ДНК фагов А, М13.0Х174, плазмиды p BR322). Установлено физическим картировани5 ем, что рестриктаза ВН 49 узнает и гидролизует ДНК р B.R322 в точках с координатами 3435 п.о., ДНК фага А в точках с координатами 11424, 42715 п.о, ДНК Х174 и М13 не гидролизуются. Анализ этих
0 данных приводит к заключению, что рестриктаза ВИ 491 узнает последовательность нуклеотидов GGTCTC.
Формула изобретения 5Штамм бактерий Bacillus lichenlformis
ВКПМ В-4268- продуцент рестриктазы BII49U
| R.I | |||
| Roberts | |||
| Restriction enzymes and their Isoshlsomers | |||
| Nucl | |||
| Acids Rev v | |||
| Устройство для электрической сигнализации | 1918 |
|
SU16A1 |
