Способ определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения Советский патент 1991 года по МПК G01N21/75 

(Л

С

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований. С целью повышения точности исследования сульфаниламидные препараты изолируют из объектов биологического происхождения с помощью водного раствора кислоты. Полученное кислотное извлечение подвергают сорбционной очистке на микроколонках с полиамидным сорбентом от эндогенных веществ, способных образовывать азокрасители, а при проведении фотометрического исследования в качестве раствора сравнения используют смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки и всех реагентов, причем азокомпонент добавляется в реакционную смесь после приведения ее PH к значению в интервале 10,10 - 12,25 10%-ным раствором гидроксида натрия. 9 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований.

Целью изобретения является повышение точности способа определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения.

Способ осуществляют следующим образом.

40 мл анализируемого кислотного, извлечения из ткани органа вносят в мерную колбу емкостью 50 мл, затем вносят в колбу 3,8 мл 40%-ного раствора едкого натра и доводят рН смеси до значения, указанного в табл.2 (графа 3), раствором 10%-ного гид- роксида натрия, добавляя его по каплям, после чего уровень жидкости в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

5 мл крови, исследуемой на содержание сульфаниламидного препарата, вносят в

центрифужную пробирку и прибавляют туда же 10 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и через 5 мин в пробирку при перемешивании вносят 5 мл раствора 4н. хлорной кислоты, содержимое пробирки центрифугируют при 500д в течение 5 мин. Центрифугат переносят в мерную колбу на 50 мл. Осадок в центрифужной пробирке еще дважды обрабатывают аналогичным способом раствором 1 н. хлорной кислоты порциями по 10 мл. К объединенным в мерной колбе емкостью 50 мл центрифугатам прибавляют 3,8 мл 40%-ного раствора едкого натра и после перемешивания доводят рН раствора до значения, указанного в табл.2 (графа 3), раствором 10%-ного гидроксида натрия, добавляя его по каплям, после чего общий объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

5 мл исследуемой мочи вносят в мерную колбу емкостью 50 мл и объем жидкости в

О

о

СО

сл

СК

колбе доводят до метки буферным раствором с соответствующим значением рН (табл.2, графа 3),

В четыре подготовленные микроколонки с полиамидным сорбентом вносят одина- ковые, точно отмеренные объемы подлежащей очистке биовытяжки (но не более, чем указано в табл.2, графа 4), обработанной по методике, описанной выше. Микроколонки центрифугируют в течение 3-5 мин при центробежном ускорении 300- 5QOg, при котором скорость истечения цен- рифугата в приемник составляет около 1 мл/мин. После центрифугирования приемники освобождают от центрифугата и приступают к промывке колонок буферными растворами с соответствующим значением рН (табл.2, графа 3), трижды внося их в микроколонки в объемах, указанных в табл.2 (графа 5). После внесения необходимых обь- емов буферных растворов проводят центрифугирование микроколонок в режиме, описанном выше, Полученные в приемниках центрифугаты отбрасывают, После проведения промывки микроколонок приступают к элюированию с них исследуемого сульфаниламидного препарата. С этой целью в микроколонки вносят буферный раствор с рН 11 в объемах, указанных в табл.2 (графа 7), и трижды их центрифугируют. Полученные с четырех колонок элюаты собирают в мерную колбу емкостью 50 мл. Общий объем жидкости в колбе доводят до метки дистиллированной водой. После перемешивания раствор используют для определения в нем содержания сульфаниламидных препаратов,

Для этого в четыре мерные колбы емкостью 25 мл вносят 0,05-10,0 мл полученного раствора, после чего к содержимому колб прибавляют по 1 мл 4 н. соляной кислоты и в первые три колбы по 1 мл 0,2%-ного водного раствора нитрита натрия. После перемешивания в течение 15 с туда же добавляют по 1 мл 0,2%-ного спиртового раствора 3-а, у-дикарбоксипропилродани- на. После перемешивания в колбы поочередно добавляют 10%-ный раствор едкого натра в объеме, достаточном для получения при перемешивании отчетливого розово- красного окрашивания (рН растворов должна находиться в пределах, указанных в табл.2), аналогичное количество 10%-ного раствора едкого натра вносят в четвертую колбу и после перемешивания туда добавляют 1 мл 0,2%-ного водного раствора нитрита натрия, 1 мл 0,2%-ного спиртового раствора 3-сс, у-дикарбоксипропилродани- на. После перемешивания в течение 15-20 с

объем жидкости в колбах доводят дистиллированной водой до метки.

Определение оптической плотности окрашенных растворов азороданинов проводятс помощью фотоколориметра КФК-2 при светофильтре с Яэфф. 490±10 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 50 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный в четвертой мерной колбе.

Содержание сульфаниламидных препаратов в пробах рассчитывают по соответствующим калибровочным графикам.

Для построения калибровочных графиков в мерные колбы емкостью 25 мл вносят

по 0,01, 0,05, 0,1, 0,2,0,3, 0,4 мл стандартного раствора препарата в 1,0 н. соляной кислоте с концентрацией 100 мкг/мл, недостающее до 1 мл количество 1 н. соляной кислоты и по 1 мл 0,1%-ного водного

раствора нитрита натрия. Через 15с в колбы добавляют по 1 мл 0,1%-ного спиртового раствора 3-« , у-дикарбоксипропилродани- на. После тщательного перемешивания общий объем жидкости в колбах доводят до

метки смесью- 0,05 М раствора тетрабора- та натрия и 0,1 н. раствора гидроксида натрия (1:2,95). После перемешивания содержимого колб производят измерение оптической плотности окрашенных растворов азороданинов с использованием фотоколориметра КФК-2 в кювете с толщиной рабочего слоя 50 мм при светофильтре с длиной волны Аэфф 490±10 нм.

Светопоглощение во всех случаях подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентраций 1-40 мкг препарата в 25 мл конечного объема. В качестве раствора сравнения в данном случае используют смесь вышеперечисленных реактивов.

Количественное содержание сульфаниламидных препаратов в исследуемых образцах рассчитывают по следующим формулам: при определении содержания сульфаниламидных препаратов в тканях органов п

где X - содержание сульфаниламидного препарата (мкг) в навеске ткани органа, взятой на исследование;

0С-количество (мкг) сульфаниламидного

препарата, найденное по соответствующему калибровочному графику; Уобщ - общий объем (мл) кислотного извлечения, полученный из навески ткани органа;

5 VK - объем исследуемого раствора (мя), нанесенный на одну микроколонку;

Vc - объем конечного раствора (мл), взятый на проведение одного анализа,

при- определении содержания сульфаниламидных препаратов в крови и моче

х 125 с

VK Vc

где X - содержание сульфаниламидного препарата в крови или моче (мкг/мл);

С - количество (мкг) сульфаниламидного препарата, найденное по соответствующему калибровочному графику;

/к - объем исследуемого раствора (мл), нанесенный на одну микроколонку,

Vc - объем конечного раствора (мл), взятый на проведение одного анализа.

Подготовка микроколонок для работы.

Очистку полученных вытяжек из тканей органов, крови и подготовленных к анализу проб мочи осуществляют методом сорбции на полиамидном сорбенте (ТУ 6-09-1-822- 73).

Микроколонка представляет собой трубку длиной 65-70 мм с внутренним диаметром около 13 мм, запаянную с одного конца перфорированной перегородкой. Для изготовления микроколонки на перфорированную перегородку кладут пористый диск из фильтровальной бумаги, после чего в колонку вносят необходимое количество (табл.2, графа 2) сухого сорбента и сверху помещают еще один пористый диск из фильтровальной бумаги, затем слой сорбента в микроколонке уплотняют поршнем от того же шприца. Поверх пористого диска из фильтровальной бумаги помещают прижимное кольцо с наружным диаметром 13 мм и внутренним диаметром 10 мм. Приемник представляет собой стеклянную пробирку длиной 45-55 мм с внутренним диаметром около 13 мм.

Хроматографическая микроколонка соединяется с приемником куском клейкой ленты размером 15x30 мм.

Перед работой микроколонку дважды центрифугируют с 96%-ным этиловым спиртом (порциями по 3-5 мл), после чего ее дважды промывают буферным раствором с необходимым значением рН (табл.2, графа 3) порциями по 3-5 мл, после такой подготовки микроколонка готова к работе. Для проведения анализа желательно готовить новую колонку. Бывшие в употреблении колонки можно использовать до трех раз, подвергая их регенерации, для этого микроколонки трижды центрифугируют с порциями по 3-5 мл 96%-ного этилового спирта, после чего микроколонки дважды центрифугируют с порциями по 3-5 мл буферного раствора с необходимым значением рН (табл.2, графа 3). Хранить микроколонки можно в сухом виде, подготавливая перед работой по методике, описанной выше.

П р и м е р 1. Определение содержания сульфаниламидных препаратов в ткани пе- 5 чени.

Свежую печень трупа человека, погибшего в результате травмы, мелко измельчают и по 100 г помещают в центрифужные стаканы емкостью 250 мл. В стаканы при- 10 бавляют по40 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата с концентрацией 100 мкг/мл в буферном растворе с рН 7,4 и оставляют на сутки при комнатной температуре, периодически пе- 15 ремешивая. Параллельно проводят холостые опыты. По истечении 2 ч в стаканы прибавляют 80 мл 1н раствора хлорной кислоты. Содержимое стаканов тщательно перемешивают и центрифугируют при 500д в 0 течение 5 мин Центрифугат сливают в химический стакан емкостью 1 л, а к твердому остатку в центрифужном стакане вновь прибавляют 80 мл 1 н. хлорной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой 5 и центрифугируют в тех же условиях Операцию изолирования проводят 6 раз Общий объем объединенных вытяжек измеряют с помощью мерного цилиндра на 1 л. Около 50 мл полученного извлечения помещают в 0 центрифужную пробирку и центрифугируют при 500д в течение 10 мин. Из полученного безбелкового центрифугата отбирают 40 мл и далее поступают так, как описано выше.

Результаты определения содержания 5 сульфаниламидных препаратов в ткани печени (модельная смесь) приведены в табл.4. Как видно из табл.4, ошибка способа при определении содержания сульфаниламидных препаратов в ткани печени состав- 0 ляет 3,83-9,56%. Невысокие результаты (73,13%; 71,04%), полученные для некоторых препаратов,связаны не с недостатками предлагаемого способа определения, а с ограниченными возможностями способа изо- 5 лирования сульфаниламидных препаратов растворами кислот из биологических тканей.

Для сравнения точности способов проведено определение содержания сульфани- 0 ламидных препаратов в контрольных опытах (т.е. в вытяжках из ткани печени, не затравленных сульфаниламидами)предла- гаемым способом и способом, выбранным в качестве прототипа (табл 5). 5Из табл 5 следует, что предлагаемый

способ позволяет точно определить содержание сульфаниламидных препаратов в кислотном извлечении из биологической ткани. Использование способа, предусматривающего непосредственное определение

сульфаниламидных препаратов в кислотной вытяжке по реакции образования азокраси- теля, не позволяет получить точных данных, что может привести к значительным ошибкам, особенно при судебно-химических исс- ледованиях, так как даже в отсутствие в пробе исследуемых препаратов данные анализа свидетельствуют о их наличии в анализируемом образце. Предлагаемый способ позволяет полностью устранить эти недо- статки.

П р и м е р 2. Определение сульфаниламидных препаратов в крови.

В мерные колбы емкостью 100 мл прибавляют по 10 мл раствора соответствующе- го сульфаниламидного препарата в буферном растворе рН 7,4 с концентрацией 400 мкг/мл, после чего в колбы добавляют цитратную кровь человека, доводя уровень жидкости в колбах до метки. Содержимое колб тщательно перемешивают и инкубируют в течение 24 ч. По истечении указанного срока отбирают пробы по 5 мл и далее поступают так, как описано выше.

Результаты определения содержания -сульфаниламидных препаратов в крови представлены в табл.6.

Ошибка способа определения сульфаниламидных препаратов в крови составляет 0,69%-4,17%. .

Для сравнения точности предлагаемого способа и способа, выбранного в качестве .прототипа, было проведено определение сульфаниламидных препаратов в незатравленной крови.

Результаты исследования представлены в табл.7.

П р и м е р 3. Определение сульфаниламидных препаратов в моче.

В мерные колбы емкостью 100 мл при- бавляют по 10 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата в буферном растворе с рН 7,4 с концентрацией 400 мкг/мл, после чего в колбу добавляют свежую мочу человека, доводя уровень жидкости в колбах до метки. Содержимое колб тщательно перемешивают и инкубируют в течение 24 ч.

По истечении указанного срока отбирают пробы по 5 мл и далее поступают так, как описано выше.

Результаты определения сульфаниламидных препаратов в моче человека представлены в табл.8.

Как следует из данных, приведенных в табл.8, ошибка способа определения составляет 2,18-4,12%.

Для сравнения точности предлагаемого способа и способа, выбранного в качестве прототипа, проведено определение содержания сульфаниламидных препаратов в образцах мочи, в которой отсутствовали определяемые препараты.

Результаты определения представлены в табл.9.

Данные, приведенные в табл.7 и 9, свидетельствуют о том, что использование способа, выбранного в качестве прототипа, не позволяет точно определять содержание сульфаниламидных препаратов в крови и моче. Использование предлагаемого способа позволяет полностью устранить этот недостаток.

Результаты количественного определения сульфаниламидных препаратов в извлечениях из биологического материала

Как следует из данных, приведенных в табл.1, абсолютная ошибка способа, выбранного в качестве прототипа, может достигать 45%, в то время как абсолютная ошибка предлагаемого способа не превышает 11%.

Формула изобретения

Способ определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения путем извлечения препарата из биообъекта кислотой, очистки, получения окрашенного раствора с азокрасителем и фотометрирования, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, вытяжку пропускают через колонку с полиамидным сорбентом, добавляют раствор гидроксида натрия до рН 10,1-12.85 и фото- метрируют, используя в качестве раствора сравнения смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки всех реагентов.

Таблица 1

Условия очистки биологических вытяжек, содержащих сульфаниламидные препараты, на микроколонках

со

Таблиц

Интервалы значений рН, в пределах которых оптическая плотность азоро- данинов является максимальной и стабильной

Препарат

Интервал значений рН

Таблица

Определение содержания сульфаниламидных препаратов в извлечениях из ткани печени

Норсульфазол

318879,70

305976,48

298474,60

288272,05

295673,90

Стрептоцид

353388,33

325181,28

322080,50

341685,40

343285,80

X 75,35 С 2,90 Gx 1,30

IMS- А 4,79

М 75,351 4,79

И 84,26

G 3,29

Gx 1,47

4,08

А 4,84

М 84,26i 4,08

Таблица

Определение содержания сульфаниламидных препаратов в контрольных опытах предлагаемым способом

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

976,17 828,13 614,87 718,72 990,12

Таблица 6

Определение содержания сульфаниламидных препаратов в крови человека

4000 4000 4000 4000 4000

Норсульфазол

3671 3575 3671 3858 3763

4000 4000 4000 4000 4000

Стрептоцид

3858 3954 3763 3763 3954 .

4000 4000 4000 4000 4000

Сульфален

4000 3960 4000 3960 4000

Сульфамонометоксин

4000 4000 4000 4000 4000

3933 3823 3600 3713 3823

4000 4000 4000 4000 4000

Этазол

3643 3820 3908 3643 3643

X 92,69

G 2,68

Пх 1,20

Ь,,ч 3,33

А 3,59

М 92,69t 3,33

X 96,46

G 2,39

Gx 1,07

Io,45 2,97

А 3,08

М 96,461 2,97

X 99,60

G 0,55

Gx 0,25

Ibffi 0,69

А 0,69

М 99,60i 0,69

X 94,46

G 3,16

Gx 1,41

I0|,f 3,91

A 4,14

M 94,46 3,91

X 93,29

G 3,12

Gx 1,40

ToflV 3,89

A 4,17

M 93,29i 3,89

Таблица 7

Определение содержания сульфаниламидных препаратов в незатравленной крови (в контрольных опытах)

Таблица

Определение содержания сульфаниламидных препаратов в моче человека

4000 4000 4000 4000 4000

Норсульфазол

3858 3763 3762 3671 3763

4000 4000 4000 4000 4000

Стрептоцид

3763 3671 3763 3954 3954

4000 4000 4000 4000 4000

Сульфален

4000 4000 4000 3920 3980

Сульфамонометоксин

4000 4000 4000 4000 4000

3600 3490 3600 3600 3713

8

X - 94,09 G - 1,65 Gx 0,74

1айт А 2,18

М 94,08t2,05

X 95,53

G 3,17

Gx 1,42

W 3,94

А 4,12

М 95,53 3,94

X 99,50

G 1,33

Gx 0,77

Ip,4f 2,11

А 2,13

М « 99,50 t2 ,11

X 90,02

G 1,96

Gx 0,88

Ччт « 2,44

А 2,71

М 90,02 12,44

ТИП

I

Этазол

Таблица 9

Определение содержания сульфаниламидных препаратов в незатравленной моче (в контрольном опыте)

Продолжение табл. 8

и:::::::::