Ј
14.
Использование; способы получения антибиотиков, в частности ванкомицина. Сущность изобретения: осуществляют взаимодействие раствора ванкомицина с раствором гидроокиси натрия при добавлении одного из них к другому при перемешивании в течение 10 с - 2,5 мин и до достижения рН в смеси 7,8-8,24, после чего перемешивание прекращают и смесь отстаивают, Процесс ведут при 10-30° С. В результате получают легко фильтруемый осадок ванкомкцина (основания). 1 з.п. ф- лы, 4 табл.
Изобретение относится к области производства антибиотиков, в частности, к способу осаждения ванкомицина.
Вследствие проявляемого к ванкомици- ну интереса и его важности ведется непрерывный поиск более эффективных способов выделения антибиотика из его ферментационных смесей.
Ванкомицин представляет собой продукт ферментации. Обычно ферментационный бульон фильтруют, фильтрат подкисляют и пропускают через один или несколько слоев хроматографической смолы с целью вызвать отделение фракций с антибиотической активностью. Добавление при перемешивании основания рН элюата, содержащего очищенный антибиотик, устанавливают в пределах 8-8,2. Осаждение занкомицинз (основания), как правило, начинается при рН 7.2-7,5, т.е. еще до достижения необходимого значения рН. Взвесь
кристаллов перемешивают с непрерывным регулированием рН до необходимого значения до момента полного осаждения. Этим способом достигаются невоспроизводимые выхода, происходит непредсказуемое осаждение и образование неравномерно трудно фильтрующего осадка (1).
Трудности, возникающие при фильтровании взвесей ванкомицина (основания) представляют пробивку при промышленном получении ванкомицина, существующую уже около двадцати лет.
Целью изобретения является улучшение качества осадка.
Было обнаружено, что если осаждение ванкомицина (сснования) задержать до момента установления рН раствора по меньшей пере 7,8 и завершать осаждение без перемешивания, в этом случае происходит непрерывное образование продукта в виде хорошо сформированных больших пластио о ю Ч о
CJ
нок. Такие пластинки могут быть легко отфильтрованы на воронке Бюхнера с помощью центрифуги или фильтрпресса. Кроме того, при этом увеличиваются выхода продукта и улучшенная фильтруемость продукта позволяет обрабатывать растворы с более высокой концентрацией ванкомици- на, что также увеличивает выход ванкоми- цины на загрузку и улучшает эффективность процесса.
Описываемый способ настоящего изобретения заключается в быстром соединении водного раствора ванкомицина с водным раствором основания с получением раствора со значением рН перед осаждением по меньшей мере 7,8 и последующим продолжением осаждения без перемещения. Выражение значение рН по меньшей мере 7,8 означает минимальное значение рН, при котором использование статической технологии осаждения приводит к хорошо сформированным, легко фильтруемым пластинкам ванкомицина (основания). При высоких концентрациях ванкомицина оказывается возможным получать такой осадок при таких низких значениях рН как 7,5, если при этом раствор не перемешивать. Однако, в этих условиях осаждение не бывает полным и выхода снижаются, Увеличение рН до 9 влияет на стабильность ванкомицина, при этом снижаются выхода и образуются обесцве ценные продукты. Наилучшие результаты достигаются при начале осаждения в интервале значений рН 7,8-8,24. Рекомендуется устанавливать рН 7,8-8,24 и прекращать перемешивание до начала осаждения.
В одном из вариантов изобретения значение рН элюированного концентрата ванкомицина устанавливают в пределах 6,5-7 добавлением основания, т.е. соединения, образующего в водном растворе ионы гид- роксила, такого как гидроксид натрия, гид- роксид калия и т.п. Отбирают аликвотное количество, которое титруют с целью определения количества основания, которое необходимо добавить до повышения рН по меньшей мере до 7,8. Вычисленное количество основания быстро и при перемешивании добавляют с элюированному концентрату до рН по меньшей мере 7,8 до начала осаждения. Перемешивание прекращают сразу же после добавления основания и раствор оставляют отстаиваться. Рекомендуют основание добавлять с такой скоростью, чтобы при этом устанавливать рН 8-8,24, и перемешивание прекращалось. В результате получают большие хорошо сформированные и легко фильтруемые пластинки продукта.
В другом варианте изобретения р Н элюированного концентрата устанавливают в
пределах 6,5-7. Раствор быстро при перемешивании добавляют к раствору основания соответствующей концентрации с получением конечного значения рН по
меньшей мере 7,8. Раствор основания может быть буферным. Перемешивание прекращают сразу же после прибавления элюированного концентрата. И в этом случае вновь рекомендуется, чтобы элюат до0 бавлялся в полном объеме и чтобы конечное значение рН было в интервале 8-8,24. И в этом случае получают большие, хорошо сформированные и легко фильтруемые пластинки продукта.
5 На скорость осаждения влияет температура раствора. Рекомендуется, чтобы температура раствора была 10-30°С. При температуре раствора выше 30°С осаждение часто начинается прежде, чем рН до0 стигнет значения 7,8, и полученный в результате ванкоми цин (основание) трудно поддается фильтрованию. Напротив, при температуре ниже 10°С осаждение происходит медленно и через два часа заверша5 ется менее чем наполовину. Таким образом, кристаллизацию рекомендуется проводить при температуре 10-30 ° С, наиболее предпочтительное при 20-25°С, с получением легко фильтруемого осадка в течение при0 емлемого с промышленной точки зрения времени.
На скорость осаждения также влияет концентрация ванкомицина в элюате. Рекомендуется, чтобы элюированный концент5 рат содержал 75-200 мг/мл ванкомицина, наиболее предпочтительно 85-160 мг/мл. В целом, чем выше концентрация, тем быстрее идет осаждение и тем оно более полное. При более высоких концентрациях может
0 возникнуть необходимость в регулировании рН при 20°С или ниже с целью избежать преждевременного осаждения ванкомицина (основания). Затем температура может быть повышена до 25°С с целью заверше5 ния осаждения. Осаждение ванкомицина (основания) из растворов с концентрацией менее 75 мг/мл происходит более медленно и приводит к продукту, фильтрующемуся более медленно по сравнению с более концен-
0 трированными растворами. П р и м е р 1.
Аликвоты элюированного концентрата- по 440 мл, содержащие 75 мг/мл ванкомицина, доводят до рН 7 добавлением при
5 перемешивании 3 н раствора гидроксида натрия. Затем рН повышают от 7 до 8,24 добавлением в течение 75 секунд Зг раствора гидроксида натрия. Перемешивание прекращают сразу после добавления гидроксида натрия. Через 1,5 минуты начинает осаждаться
ванкомицин (основание). Температуру раствора поддерживают при 25°С. Степень кристаллизации контролируют с помощью ультрафиолетового анализа. Примерно через 6 часов взвесь фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 1,25 дюйма (3,2 см), снабженной стеклянной колонкой, под давлением 0,984 ат. Фильтровальный пирог промывают 105 мл 50%-го водного метанола и затем 105 мл метанола. Время фмльтро- вания - 7,5 мин, первое промывание занимает 11 мин, второе поомывание - 9 мин. Выход ванкомицина (основание) 90%.
Пример 2-5.
Воспроизведена методика примера 1с использованием элюируемого концентрата, содержащего 90, 120 и 160 мг/мл ванкомицина. Осаждение из раствора с 160 мг/мл ванкомицина проведено дважды. В ходе первого опыта при регулируемой темпера- туре 25°С осаждение начинается при рН 7,9. Перемешивание прекращают после добавления всего аликвотного количества гидро- ксида натрия (рН 8,24). В втором опыте температура элюата - 10°С, температура раствора гидроксида натрия - 15°С, температура кристаллизации в результате достигает 210°С. Перемешивание прекращают сразу же после добавления раствора гидроксида натрия, рИ 8,23. Осаждение начина- ется спустя 35-40 секунд.Полученные в примерах 1-5 результаты суммированы в таблице 1.
Примеры 6-9.
Воспроизведена методика примера 1 с использованием элюированного концентрата, содержащего 83,7 мг/мл ванкомицина, и изменением температуры. Полученные результаты суммированы в таблице 2. В примере 9 при 30°С осаждение началось прежде, чем весь раствор гидроксида натрия был добавлен.
П р и м е р 10.
К аликвотному количеству на 200 мл элюированного концентрата, содержащего 74 мг/мл ванкомицина, добавляют мочевину (14,8 г). Добавлением 33 мл 3 н раствора гидроксида натрия устанавливают рН 6,5. Полученный раствор в течение 10-15секунд при перемешивании прибавляют к 30 мл 3 н раствора гидроксида натрия, содержащего 2,5 г ацетата натрия, и перемешивание сразу же прекращают. Полученный раствор имеет рН 8. Температуру раствора поддерживают при 25°С. Осаждение ванкомицина начинается сразу же. Через 30 мин взвесь фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 9 см. Фильтровальный пирог промывают 100 мл 50%-го водного метанола с последующим повторным промыванием 100 мл метанола. Время фильтрования - 1,9 мин, первое промывание занимает 2,6 мин, второе промывание - 2,6 мин. Выход 95%. Примеры 11-14.
Воспроизведена методика примера 10 при использовании различных количеств мочевины и ацетата натрия. В некоторых случаях для второго промывания используют метанол, а для третьего промывания - ацетон.
Для сравнения 200 мл взвеси кристаллов, полученной по известной методике из элюата, содержащего 73 мг/мл ванкомицина, фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 9 см.
Результаты примеров 10-14 суммированы Е таблице 3.
П р и м е р 15,
Добавлением гидроксида натрия (19°С) в 750 л элюированного концентрата (15°С), содержащего 35 мг/мл ванкомицина, устанавливают рН 7. Аликвотное коли ествотитруют до рН 8,2 и рассчитывают количество 3 н раствора гидроксида натрия, необходимое для установления в элюате значения рН 8.2. Рассчитанное количество (56 л) из находящееся под давлением сосуда в течение 2,5 мин выдувают в резервуар и перемешивание прекращают. Осаждение начинается прежде, чем все количество гидроксида натрия оказывается добавленным. Температуру раствора стабилизируют при 25°С. Через 4,5 часа взвесь фильтруют с помощью фильтр-пресса. Фильтровальный пирог промывают водой до понижения проводимости ниже 3000 мкм ом (примерно 1300 л), после чего повторно промывают ацетоном (950 л). Время фильтрования - 10 мин. первое промывание занимает 15 мин, второе промывания - 7 мин, выход 92%.
П р и м е р ы 16, 17.
Воспроизведена методика примера 15, за исключением того, что гидрсксид натрия прибавляют за 1,5 мин и осаждение начинается через 15 секунд после завершения прибавления.
Результаты примеров 15 и 16 сравнивают со средним временем фильтрования для трех опытом, проведенных по известной методике с использованием злюата, содержащего 75115 мг/мл ванкомицина.
Результаты примеров - суммированы в таблице 4.
Формула изобретения
Осаждение начинается при рН 7,9.
Результаты осаждения ванкомицина
мени от 10 с до 2,5 мин и до достижения рН в смеси 7,8-8,24, после чего перемешивание прекращают и смесь отстаивают.
Таблица 1
Таблица 2
Результаты фильтрования осаженного ванкомицина
Результаты фильтрования осаженного ванкомицинз
Таблица 3
Таблица 4
| Патент США № 3067099, кл | |||
| Способ приготовления хлебного вина | 1925 |
|
SU424A1 |
