Способ определения концентрации пчелиного маточного молочка в фармацевтических препаратах и медопродуктах Советский патент 1992 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к химическим способам контроля количества нативного маточного молочка (далее апилака) в фармацевтических и пищевых продуктах.

Изобретение может быть использовано для определения маточного молочка в биологически активных мйдопоодуктах, содержащих повышенные концентрации апилака,

W

а также в лекарственных апилаксодержа- щих препаратах - таблетках, эмульсиях, свечах.

Известен способ контроля количества маточного молочка биологическим методом, включающий инкубацию однодневных пчелиных личинок в течение 6 дней при температуре 35±1°С и влажности 96±1%,

периодическое внесение анализируемого продукта и измерение прироста массы и количества выживших личинок. Недостатки этого способа заключаются в его низкой точности, большой продолжительности анализа, применимости его лишь для чистого апилака или препаратов, преимущественно содержащих апилак. Кроме того, анализ можно проводить лишь в весенне-летний период, когда есть возможность работы с личинками.

Известен также способ контроля количества маточного молочка по содержанию в нем пантотеновой кислоты, включающий анализ последней микробиологическими методами с использованием культур Sacharomycea, Streptococcus, Lactobacillus.Serratia. Способ обладает низкой точностью, а также не применим для анализа медопродуктоа, так как мед сам по себе содержит значительные количества пантотеновой кислоты.

Известен также способ контроля количества маточного молочка в медопродуктах, включающий маркирование вводимого в продукт апилака глюконатом кальция, последующий анализ медопродукта путем ионообменного концентрирования маркера и комплексонометрического титрования ионов кальция в концентрате. Недостатком этого способа является необходимость маркировать апилак прямо в процессе производства, что технологически неудобно. Маркирование отдельных проб значительно усложняет анализ и не применимо при массовых определениях.

По технической сущности и достигаемому эффекту наиболее близким к предлагаемому является способ контроля количества маточного молочка по содержанию 10-окси- 2-деценовой (деценоевой) кислоты, включающий трехкратную экстракцию апилака или апилаксодержащих продуктов диэтиловым эфиром, трехкратную реэкстракцию эфирных извлечений 1N водным раствором NaOH, подкисление щелочного раствора 50%-ной серной кислотой до рН 1, нейтрализацию серной кислоты гидрокарбонатом натрия до рН 8, трехкратную промывку полученного раствора диэтиловым эфиром, повторное подкисление раствора до рН, трехкратное извлечение деценоевой кислоты диэтиловым эфиром, промывку эфирного экстракта водой, сушку его безводным сульфатом натрия, упаривание досуха и обратное титрование сухого остатка в 0.01N NaOH 0,01М-ным раствором серной кислоты в присутствии фенолфталеина. Количество оттитрованной деценоевой кислоты должно составлять не менее 5% в пересчете на сухое маточное молочко.

Недостатки прототипа заключаются е следующем:

Способ включает в себя девять процедур экстракции и две процедуры промывки,

т.е. является чрезвычайно трудоемким. Многократное экстрагирование, сопровождающееся на каждом этапе небольшими потерями анализируемого вещества, в конечном итоге приводит к значительному

0 разбросу результатов, снижению чувствительности и точности способа.

В процессе осуществления способа неоднократно изменяется кислотность экстрактов. Это необходимо для очистки

5 деценоевой кислоты от кислых и основных примесей. Помимо достоинства использование скачкообразных изменений рН имеет и ряд недостатков, проявляющихся на последней стадии обратного кислотно-основ0 ного титрования. При наличии остатков серной кислоты в эфирном экстракте, при недостаточных его сушке и промывке, при неполном упаривании результаты титрования искажаются, содержание деценоевой

5 кислоты завышается. Во всех последующих после изменения рН процедурах необходим строгий контроль кислотности, что дополнительно усложняет анализ.

Кроме деценоевой кислоты в апиалке

0 содержатся и другие органические кислоты, в частности 48-125 мг/г (4,8-12,5.%) никотиновой и 180-200 мг/г (18-20%) пантотеновой кислот 4. Эти кислоты могут экстрагироваться эфиром, растворами ще5 лочей и оттитровываться вместе с деценоевой кислотой, завышая результаты анализа. В процессе осуществления способа приходится работать с токсичным растворителем - диэтиловым эфиром, поэтому для

0 проведения анализа необходимо создание специальных условий работы.

Цель изобретения - повышение точности и снижение трудоемкости способа, сокращение времени осуществления и

5 расширение его функциональных возможностей.

Поставленная ель достигается тем, что в известном способе, включающем извлечение из анализируемого продукта компонен0 та, характерного для маточного молочка, определение количества этого компонента и пересчет его на содержание молочка в анализируемом продукте, согласно изобретению, в качестве анализируемого компо5 нента используют специфический белок маточного молочка, который количественно анализируют путем его растворения в 1,0- 5,0 н. растворе NaOH, добавления 25-300 мкл 30%-ного пероксида водорода и через 15-60 с - 1 %-ного раствора , необходимом для появления опалесценции, центрифугирования и фотометрирования над- осадочной жидкости на длинах волн 556 и 680 нм и расчета количества специфического белка маточного молочка по концентрации образованного им комплекса с ионами меди,

Согласно заявляемому способу продукт, содержащий маточное молочко, растворяют в 1,0-5,0 н. растворе NaOH, добавляют 25-300 мкл На02 и через 15-60 с 1 %-ный раствор CuSO. в объеме, необходимом для появления слабой мути - опалесценции смеси. Опалесценцию удаляют центрифугированием, полученный прозрачный раствор, содержащий комплекс меди и специфического белка маточного молочка, фотометрируют на длинах волн 556 и 680 им. Затем, зная содержание этого белка в маточном молочке находят количество последнего в анализируемом продукте.

Предлагаемый способ имеет следующие признаки, отличные от прототипа.

В качестве анализируемого компонента, содержащегося в маточном молочке и отсутствующего в меде и наполнителях (при анализе лекарственных средств), в предлагаемом способе использован белок, имеющий в своем составе высокие концентрации гидроксиаминокислот серина и треонина и .образующий специфически окрашенные комплексы с солями меди.

В отличие от используемой в прототипе деценоевой кислоты анализируемый белок:

содержится в маточном молочке в количестве, в 2-3 раза превышавшем концентрацию деценоевой кислоты. Это позволяет уменьшить чавески дефицитных лекарственных препаратов и медопродуктов, не снижая чувствительности анализа;

обладает большей устойчивостью и позволяет определять количество маточного молочка в мегюпродуктах лекарствах и продуктах лечебно-профилактического питания в процессе их длительного хранения;

позволяет установить фальсификацию ма точного молочка, так как подобрать белок-заменитель, образующий медьсодержащий комплекс с характерным соотношением коэффициентов молярного погашения на длинах вопи 556 и 680 нм, практически очень трудно.

Способ прототипа не является селективным к. деценсевой кислоте: ее можно заменить любой насыщенной Сб- Сю-карбоновой кислотой, оксикислотами или ниацином.

Количестро белка определяют по интенсивности окраски его комплекса с ионами меди путем растворрниа эптчксодержаще- го продукта в 1.0-5 0 н,растворе NaOH, добавления 25-300 мкл 30%-ного и через 15-60 с 1 %-ного CuSCM в объеме, необходимом для образования опалесценции:

анализируемый белок образует с реа5 гентом HaOa+CuSCM специфическую красно-фиолетовую окраску с основным максимумом поглощения - 556 нм и соотношением коэффициентов молярного погашения Ј680/ ,483 ±0,004. Другие белки

10 меда, маточного молочка, пыльцы образуют с ионом Си комплексы, имеющие

Ашах 630-680 НМ И Ј680/6556-1,219 ±0,008.

Благодаря этим спектроскопическим отличиям обеспечивается достаточно высокая 15 селективность и, соответственно, большая точность анализа.

Определение белка маточного молочка возможно в присутствии других чужеродных белков, а также аминокислот, что рас0 ширяет функциональные возможности способа.

В прототипе деценоевая кислота определяется косвенным способом - путем кислотно-основного титрования, т.е. путем

5 определения концентрации ионов водорода в растворе. Естественно, что в условиях прототипа аналогично оттитруется и любая другая кислота.

Предлагаемый способ является пря0 мым, т.к. регистрируется поглощение именно анализируемого белка, связанного в комплекс с ионами меди. Это также обеспечивает значительно большую селективность и точность определения.

5 Если в способе-прототипе возможна пе- ретитровка (т.е. использование избыточного количества реактива-титранта), приводящая к порче пробы, то в предлагаемом способе избыток реактива, не связан0 ного с белком, выпадает в осадок и отделяется центрифугированием. Этим он. кстати, отличается от различных разновидностей биуретового реактива 5-7, где соли меди, стабилизированные цитратами или

5 тартратами (например, сегнетовой солью), остаются в растворе и мешают спектрофо- тометрическому определению. Кроме того, биуретовый реактив дает одинаковую окраску со всеми белками, что не позволяет оп0 ределять какой либо один, в дачном случае анализируемый белок.

Удаление избытка меди из раствора предохраняет анализируемые пробы от порчи, что, в конечном итоге, способствует по5 вышению точности способа.

Наличие в составе аналитического реагента пероксида водорода предохраняет образовавшийся комплекс белка г мгдью от восстановления последней до Зго позволяет проводить анализ в присутствии большого количества восстанавливающих Сахаров, а также аскорбиновой кислоты, .содержащихся в медопродуктах или добавляемых в качестве консерванта и антиокислителя к апилаку. Таким образом, использование системы CuSCM+HaOz расширяет функциональные возможности способа.

Точность предлагаемого способа в 3,6 раз выше, длительность - в 5,4 раза ниже, чем у прототипа. Помимо этого, способ имеет более низкую трудоемкость, позволяетанализи- ровать большее разнообразие продуктов, содержащих пчелиное маточное молочко, т.е. обладает большими функциональными возможностями.

П р и м е р t, Определение количества анализируемого белка в маточном молочке. Сравнение способа-прототипа и предлагаемого способа. 0,1-0,3 г маточного молочка растворяют при перемешивании в 2 мл 1 н. раствора NaOH. К полученной смеси добавляют 50 мкл 30%-ного Н20з- затем через 30 с порциями по 50 мкл приливают 1%-ный раствор CuSCM до появления опалесценции. Полученную систему центрифугируют 2-3 мин, а затем спектрофотометрируют на длинах волн 556 (As) и 680 (Аб) нм. Содержание белка находят по формуле:

питания. Для точного определения содержания маточного молочка в медопродуктах необходимо предварительно провести анализ маточного молочка и меда. 0,4-0,8 г медопродукта. например Апибэльзэма - 1 и такое же количество чистого меда растворяют в 2 мл 1 н. NaOH, к растворам прибавляют 100-300 мкл 30%-ного НзОз и через 30-60 с 300-400 мкл 1 %-ного CuSO/i. через

5-10 мин после добавления соли меди проводят измерения As и Ае.

Анализ маточного молочка осуществляют, как в примере 1.

Для расчета процентного содержания

маточного молочка находят величину

и -

еда

АЈ

20

которую, затем, подставляют в формулу (2):

Хмп -

5.791 -УУ.Ь-ДГ-АГ

b - 0.481

(2)

где Хмп - подержание белка маточного молочка в медопродукте.

Зная количество белка в чистом маточном молочке (Хмм) и количество этого белка в медопродукте, находят содержание маточного молочка

Использование: химические способы контроля количества нативного маточного молочка (апилака) в фармацевтических и пищевых продуктах. Сущность изобретения: содержащие маточное молочко препараты растворяют в растворе щелочи, добавляют 30%-ный пероксид водорода затем через 15-60 с-1%-ный раствор сульфата меди до появления опалесценции. Полученную смесь центрифугируют и фотометрируют на длинах волн 556 и 680 нм. По формуле находят концентрацию специфического белка, маточного молочка в анализируемом про- дукте.Т табл. XI XI О СА) СЛ

X

7,83-W

(1,22- As-Аб),

(1)

где X - количество анализируемого белка, мг/г;

W - общий обьем анализируемого раствора, мл;

g - масса навески маточного молочка, г; As, Ае - оптические плотности растворов на длинах волн 556 и 680 нм.

Проведенные анализы показали, что содержание белка в нативном маточном молочке колеблется от 157 до 345 мг/г (обычно 240-310 мг/r), в лиофилизированном апилаке 986 мг/г (обычно 685 - 885 мг/г).

В табл. 1 приведены результаты сравнительных испытаний прототипа и предлагаемого способа. Поскольку результаты анализа не соизмеряемы по абсолютной величине, анализируются различные вещества, для сравнения точности анализируемых методик используются коэффициент вариации и ошибка среднего арифметического.

Результаты испытаний показали, что точность предлагаемого способа в 3,6 раз выше, чем прототипа.

Пример 2. Определение количества маточного молочка в медопродуктах и других продуктах лечебно-профилактического

Содержание 1

маточного

Lи

«лмп.100%

АММ

молочка в I медопродукте /

Если нет возможности проанализировать чистые мед и маточное молочко, содержание белка в медогтродукте определяют по формуле (1), Оно должно составлять 3,14-6,90 мг/г. Так. проведенный анализ Апибальза- ма-1, содержащего 2 % маточного молочка, показал наличие белка в количестве

6,33 ±0,32 мг/г(коэфф. вариации 3,83%).

Примерз. Изучение комплексообразования белков маточного молочка с солями

меди. Маточное молочко содержит высокомолекулярный гидрофильный белок, образующий благодаря высокой концентрации серина и треонина комплексные соединения с солями меди Си2, специфически поглощающими в фиолетовой области -556

нм. Другие белки маточного молочка, а также белки и полисахариды меда образуют комплексы, поглощающие при 630-680 нм. Фиолетовый комплекс (далее V-комплекс) является более прочным, чем комплексные

соединения других белков с ионами меди, поглощающими в синей (680 нм) области (далее В-комплексы). По мере добавления раствора Си2ь сначала образуются красно- фиолетовые растворы V-комплекса, затем появляются сине-д жолетовая окраска, характерная для смеси V- и В-комплексов. Наличие специфической области поглощения на длине волны 556 нм позволяет использовать V-комплекс меди для аналитических целей.

Навески маточного молочка растворяли в 3 нл 1 н. NnOH добавляли 1,0 мл 1%-ного CuS04. Осадок отделяли центрифугированием, надосадочную жидкость фотометриро- аали при 556 им. В качестве контрольного D4CTBCQ3 использовали комплекс аминокислоты аргинина, полученный в аналогичных условиях.

Определение типа зависимости поглощения V-комплекса от. количества маточного молочка приведено в табл. 2.

Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что зависимость является строго линейной - коэффициент корреляции ,989. Это позволяет использовать V-комплекс для определения содержания молочка в смесях с другими веществами.

Использование серии буферных растворов ь i aneci в; растворителей для маточного молочка показало, что комплексы меди с белком образуются, если рН смеси не меньше II. Оптимальный интервал 12,25-13,55 единиц рН.

Для определения оптимальной концентрации щелочи одинаковые навески маточного молочка (0,02 г) растворяли в 2 мл 0,05; 0,5; 1,0; 2.0: п- 0; 4,0: 5,0 10,0 н. растворах NaOH. Оптическую плотность растворов после добавпенчя 0,2 мл 1 % CuSO/q измеряли при 556 и 68Г нм каждые ЗС .

Проведзкные измерения (табл. 3) показали, что наибольший V-комплекса (А55бт у наблюдается в 1,0 5.0 н. растворах NaOH Соотношение поглощения на длинах волн 556 и 680 нм в этом интервале концентраций сохраняется постоянным, время максимального выхода комплекса изменяется от 0,5 до 6,0 мин, что приемлемо при проведении анализа. В 0,5 н.растворе анализируемый гродукт вообще не образуется, т к. erc-ijH 10,21 ( 12,25)

Зависимости выхода V-комплекса от концентрации растворов щелочи приведена в габл 3.

К раствору 0,016 г маточного молочка в 2 мл 1 н. NaOH приливали 0,05 мл 30%-ного 5 Н202 и затем добавляли 1%-ный раствор CuSO порциями по 0.05 мл Через 5 мин после прибавления каждой порции производили измерения оптической плотности при 556 и 680 нм. Количество V-комплекса 10 находили, как в примере 1. В качестве стандарта Для расчета содержания В-комплекса использовали комплекс с аргинином.

Из табл. 4 следует, что по мере добавления раствора меди концентрация V-комп- 15 лекса сначала возрастает, затем становится постоянной - 280,15 ±1,11 мг/г. После добавления избыточных объемов раствора начинается выпадение осадка Си(ОН)2: количество анализируемого комплекса при 0 этом уменьшается, что, вероятно, вызвано появлением окрашенных гидроксосоедине- ний меди, приводящих к изменению коэффициента Ь в формуле (2). Таким образом, наилучший выход комплекса достигается 5 при добавлении максимальных количеств раствора меди, не вызывающих образования осадка Си(ОН)г. Следовательно, в процессе анализа добавление следует проводить до появления опалесценции рас- 0 твора.

Заивисимость выхода V-комплекса от концентрации меди в растворе приведена в табл. 4,

П р и м е р 4. Стабилизация комплексов 5 балка и пероксидом водорода.

Соли двухвалентной меди проявляют в сильнощелочной среде окислительные свойства и легко реагируют с восстановителями, содержащимися в маточном молочке, 0 меде, витаминизированных медопродуктах. Наиболее сильными восстановителями являются аскорбиновая кислота и альдегидо- сахара, разлагающие V-комплекс с образованием Си20. Нестабилизированный 5 комплекс разлагается при анализе маточного молочка за 15-30. при анализе медопро- дуктов - за 2-7 мин.

В качестве стабилизаторов были использованы сильные окислители - персуль- 0 фат аммония в концентрации 10 г/л (насыщенный раствор) и 30%-ный пероксид водорода. Исследования показали, что ( действует очень медленно и поэтому не пригоден для анализа 5 4,1, Зависимость устойчивости V-комплекса в маточном молочке от количества добавленного 30%-НОГО Н202.

0,103 г маточного молочка растворяли в 2 мл 1 н, NaOH, добавляли 25-1ГО мкл 30%- ного Нг02 и 300 мкл 1 %-ного Си 0.j Об&ем

раствора доводили 1 н. NaOIH до 2,5 мл. Оптическую плотность измеряли на длине волны 556 нм.

Зависимость устойчивости V-комплекса в маточном молочке от количества НаОа приведена в табл, 5.

Добавление к раствору маточного молочка 30%-ного N262 в количестве более 25 мкл практически полностью стабилизирует V-комплекс, образующийся при последующем добавлении CuSO/j. Такое же количество пероксида водорода достаточно для стабилизации лекарственных средств с апилаком - таблеток, мазей,свечей.

В случае анализа медопродуктов требуется значительно большее количество пероксида водорода, Это объясняется наличием в меде значительно большего количества альдегидосахаров и аскорбиновой кислоты. Из-за высокой скорости распада комплекса большое значение имеет количество меда, взятого на анализ. Измерения времени устойчивости комплекса при использовании разных навесок медопродукта и объемов HzOa, проведенные в 20 точках (в трех параллелях), позволили вывести эмпирическое уравнение вида:

g -°-74-wk ° 96

1

WH202

+ 0,189,

связывающее все варьируемые параметры. Так, если для стабилизации взято 300 мкл Н202 и необходимо, чтобы комплекс был устойчив в течение 30-40 минут, согласно уравнению навеска должна составлять 0,094-0,118 г.

Оптимальными для анализа меда и медопродуктов являются объемы в интервале от 200 до 400 мкл. При WH2O2 200 мкл время существования комплекса слишком мало для осуществления способа; при WH2O2 400 мкл в растворе образуются медленно разлагающиеся пероксосоединения меди, искажающие результаты анализа.

Для сохранения комплекса необходимо, чтобы при внесении раствора CuS04 почти все восстанавливающие примеси были окислены. Поэтому при осуществлении способа сульфат меди добавляют в анализируемый раствор после пероксида водорода, Временной интервал между внесением

Н20 и CuSO/i также оказывает влияние на устойчивость V-комплекса.

0,124 г меда растворяли в 2 мл 1 н. NaOH, затем к раствору приливали 200 мкл

30%-ного Н202. Через определенный промежуток времени ( т ) добавляли 400 мкл 1%-ного CuS04 и измеряли время между образованием комплекса и его распадом (t). Зависимость устойчивости комплекса

от интервала между внесением растворов На02 и CuS04 приведена в табл. б.

Полученные результаты, приведенные в табл. 7, показывают, что комплекс наиболее устойчив, если раствор CuS04 вносят в анализируемую смесь через 0,25-1,00 мин (15- 60 с) после добавления 30%-ного Н202.

П р и м е р 5. Выведение формулы для расчета количества белка, реагирующего с солями Си2+с образованием V-комплекса.

Поскольку V-комплекс приходится определять на фоне различных концентраций В-комплекса, наиболее удобным является использование уравнений Фирордта для двухкомпонентных смесей 8. Измерения

оптической плотности проводят на двух длинах волн 556 (As) и 680 (Ае) нм. Тогда: .

Ае - A6V + А6Ь - Ј6V Cv + Ј бЬСь А5 A5V + A5b - Ј5V Cv +Ј5b Cb (5) где Ae , Aev , Аеь - поглощение при 680 нм анализируемого раствора. V- и В- комплексов;

As , Asv , Asb - поглощение при 556 нм анализируемого раствора, V- и В-комплек- сов,ЈбЬ, Ј6V, Ј5b, Ј5V молярные коэффициенты погашения комплексов при 680 и 556 нм; Сь и Cv - концентрации комплексов. Пусть соотношение молярных коэффи- циентов погашения при 680 и 556 нм равно:

для V-комплекса: v -;

«8

для b-комплекса: b -p.

Ј§

(6)

50

Решая систему уравнений (5) относительно Cv и подставляя величины v и b (6), получаем:

Cv

b -Аз - Ае

eg-(b-v) Отсюда выводим расчетную формулу

X М±. 9 -(b-vj

(1)

где Мг молекулярная масса белка-стандарта, г/моль;

- остальные обозначения см. пример 1 (формула 1) и пример 6 (формулы 5-6).

Поскольку молекулярная масса и коэффициент молярного погашения анализируемого белка не известны, в качестве стандарта используют сывороточный человеческий альбумин. Комплекс альбумина с медью имеет максимум поглощения при 556 нм, величина v у него совпадает с белком для маточного молочка - 0,481.

При использовании этого стандарта формула приобретает вид:

X -

5,791-W Ь-Аз-Аб

(2)

gb- 0,481

Величина b, характеризующая В-комп- лекс, для маточного молочка равна в среднем, 1,220; для меда колеблется в пределах 1.220-1,316. Определение величины b описано в примере 2.

П р и м е р 6. Сравнение продолжитель- ностей осуществления способа-прототипа и предлагаемого способа.

Хронометраж прототипа и предлагаемого способа, выполняемых в трех параллелях, приведен в табл. 7.

Результаты хронометража аналитиче- ских операций показывают, что предлагаемый способ осуществляется в 5,4 раза быстрее, чем прототип.

В отделе криобиогимии и фармакологии нейрогуморальных систем института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР в ноябре 1990 года была проведена экспериментальная проверка предлагаемого способа (размещение на испытания и акт прилагаются). За базовый объект взят прототип, а за новый - предлагаемый способ;

Результаты экспериментальной проверки свидетельствуют о том, что предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед базовым объектом:

в качестве анализируемого компонента, имеющегося в апилаке и отсутствующего в меде и наполнителях лекарственных препаратов, используется специфический белок маточного молочка;

количество белка определяют по итен сивности окраски его комплекса с ионами меди путем растворения эпипрксодержзще- го продукта в 1,0-5.0 н. раствора NaOII, 5 добавления 25-300 мкл 30%-ного На02 и через 15-60 секунд 1%-ного CuSCM в объеме, необходимом для образования опалес- ценции.

Предлагаемый способ имеет точность в 10 3.6 раза выше, длительность анализа - в 5,4 раза ниже, чем прототип; является менее трудоемким, позволяет анализировать более широкий спектр продуктов, в том числе и с низким содержанием маточного молочка. 5

Формула изобретения

Способ определения концентрации пчелиного Mai очного молочка в фармацевтиче0 ских препаратах и медопродуктах, предусматривающий извлечение из пробы анализируемого продукта компонента, характерного для пчелиного маточного молочка, установление значения концентрации

5 этого компонента, коррелирующего со значением концентрации пчелиного маточного молочка в исходном анализируемом продукте, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, сокращения времени и

0 трудоемкости, в качестве компонента, характерного для пчелиного маточного молочка, используют специфический белок маточного молочка, установление значения концентрации последнего осуществляют путем после5 довательного введения в пробу анализируемого продукта 1,0-5,0 N раствора NaOH,30%-ного пероксида водорода, выдержку полученной смеси в течение 15-60 с и введение 1 %-ного раствора CuS04 при обь0 емно-массовом соотношении пробы анализируемого продукта, раствора №ОН,пероксида водорода, раствора CuSO соответственно 20-60:2-3:0,025-0,30:0,25-0,75 (мг:мл:мл:мл), центрифугирование полученного комплекса,

5 фотометрирование надосадочной жидкости на длинах волн 556 и 680 нм и установление значения оптической плотности, соответствующего значению концентрации специфического белка маточного молочка.

в 0,05 н. NaOH комплекс не образуется,

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Добавление раствора CuSCM вызвало образование осадка.Фотометрию проводили после центрифугирования.

Н2СЪ. не добавляли.

Таблица 1

Таблица 5

Таблица 6

Данную операцию проводят одновременно или почти одновременно для всех трех параллелей.

Таблица /