Способ выделения амилазы из препарата амилоризин Советский патент 1993 года по МПК C12N9/30 

Изобретение относится к технической биохимии и биотехнологии, а именно к способам очистки ферментов, и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности для получения чистых препаратов.

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа и повышение активности целевого продукта.

Изобретение заключается в том, что амилазу перед осаждением сульфатом аммония центрифугируют, а затем подвергают б. иоспецифической очистке н сорбенте с инкубацией в буферном растворе.

Для биоспецифической очистки используют сорсилен импрегнированный сыворо- точнымбычьим альбумином, биоспецифическую очистку проводят с использованием 0,05 М раствора универсального буфера с рН 3,5, инкубацию проводят.в течение 20-30 мин при 4-6°С.

Новым в предлагаемом изобретении является применение биоспецифического разделения в качестве первой стадии очистки, позволяющей полностью избавиться от примесей протеаз.

Существенные отличия способа заключаются в четырехстадийном получении амилазы (вместо пяти стадий).

Пример 1. Готовят 15%-ный раствор ферментного препарата амилазы Aspergillus oryzae из амилоризина ПОх в 0,1 Мв универсальном буфере рН 3,5. Нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин и к супернатанту добавляют сорсилен, импрегнированный бычьим сывороточным альбумином (БСА) до конечной концентрации 30-40 мг/мл. После 20 мин инкубации при 4-6°С смесь центрифугируют и отделяют су- пернатант. Затем ферментный раствор подвергают высаливанию 80% сульфатом аммония от насыщения и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлю- лозе. Сорсилен. импрегнируе ый альбумином, получают по известной метоcs

ё

00

о

4

О СО

О

дик.е. Степень очистки составляет 120 раз. Удельная амилазная активность 289220 ед./г.

Пример 2. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена БСА составляет 10 мг/мл. Степень очистки составляет 40 раз. Удельная амилазная активность 96120 ед./г.

Пример 3. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена, импрегнированного БСА, составляет 20 мг/мл. Степень очистки составляет 80 раз. Удельная активность 192210 ед./г.

П р и м е р 4. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена в импрегнированном БС А составляет 50 мг/мл. Степень очистки состав- ляет 110 раз. Удельная амилазная активность 264330 ед./г,

Пример 5. Все операции проводят, как в примере 1. с использованием 0,03 М универсального буфера. Степень очистки составляет 100 раз. Удельная амилазная активность 240300 ед./г.

Пример 6. Все операции проводят, как в примере 1, но с использованием 0,1 М универсального буфера. Степень очистки составляет 110 раз. Удельная амилазная активность 264330 ед./г,

Пример 7. Все операции проводят, как в примере 1, инкубацию в универсальном буфере проводят в течение 10 мин. Степень очистки составляет 100 раз. Удельная активность 240300 ед./г.

Из представленных выше примеров видно, что оптимальными условиями для удаления протеиназ являются: инкубация с биосорбентом при концентрации последнего 30-40 мг/мл в буфере ионной силой 0,05 М в течение 15-20 мин.

В таблице представлены сравнительные характеристики полученной амилазы.

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами: сокращается число операций, повышается степень очистки, снижается протеазная активность.

Формула изобретения

Способ выделения амилазы из препарата амилоризин, предусматривающий растворение сырья, удаление протеолитиче- ских ферментов из раствора, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и его очистку, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа и повышения активности целевого продукта, раство- 5 рение сырья ведут в 0,05 М универсальном буфере с рН 3,5, удаление протеолитических ферментов из раствора осуществляют добавлением сорсилена, импрегнированного бычьим сывороточным альбумином, до концентрации 30-40 мг/мл с последующим ин- кубированием смеси в течение 15-20 мин при температуре 4-6°С, а очистку целевого продукта проводят ионообменной хрома- тографией на ДЭАЭ-целлюлозе. 5

0

5

0

0

Использование: медицина и фармацевтическая промышленность для получения чистых препаратов. Сущность изобретения: змилоризин растворяют в 0,05 М универсальном буфере с рН 3,5. Из раствора удаляют протеазы биоспецифической очисткой. Для этого вносят 30-40 мг/мл сорсилена, импрегнированного бычьим сывороточным альбумином, инкубируют смесь 15-20 мин при 4-6°С. Затем проводят осаждение амилазы сульфатом аммония и ее очистку ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Удельная амилолитиче- ская активность препарата 3615 едУмг белка выход по активности 92%.

Показатель

Предлагаемый способ

ГОСТ 20264, 2-74, едУг

по Ансону, ед/г

Способ по авт. св. №1214755

21,5 час 10

-15-20 85

2400

300

30,0

195,0

82

3,2