Способ получения фосфолипазы Д Советский патент 1993 года по МПК C12N9/20 A61K35/78 

Изобретение относится к технической биохимии и может быть использовано в медицине и пищевой промышленности.

Цель изобретения - повышение выхода белка и каталитической активности фосфолипазы Д.

Для достижения поставленной цели в способе получения фосфолипазы Д, включающем экстракцию белков из корнеплода среднеазиатской редьки с осаждением целевого фермента, экстракцию проводят боратно-ще- лочным буфером, при этом в среду выделения добавляют 5-15 мМ ионов кальция.

Новым в предлагаемом решении является прием очистки фермента на этапе его экстракции из сырьевого продукта путем применения соединений кальция. Существенные отличия изобретения состоят в использовании вместо трис-буфера боратно-щелочного буфера с включением в него 5-15 мМ ионов кальция.

Сущноотс предлагаемого способа заключается в том, что экстракцию белков проводят боратно-щелэчным буфером рН 8,2 в присутствии ионов кальция с концентрацией 10 мМ.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Навеску 200 г корнеплода среднеазиатской редьки размельчают, экстрагируют в течение 4 ч при 4°С десятикратным объемом боратно-щелочного буфера рН 8,2, гомогенизируют гомогенизатором типя РТ-2 при 8000 об/мин в течение 20 мин. Растворимые белки отделяют от осадка центрифугированием при 5000 об/мин 20 мин. К надосадочной жидкости добавляют 2 объема охлажденного ацетона (-10°С) и перемешивают. Осадок отделяют декантацией, промывают безводным ацетоном и сушат на воздухе для удаления ацетона. Осаждение ацетоном проводят дважды. Смена буфера на боратно- щелочной приводит к увеличению выхода белка до 596 мг и увеличению активности ферментного препарата до 1073 ед.

П р и м е р 2. Процесс проводят по примеру 1, но экстракцию проводят борат- но-щелочным буфером рН 8,2, содержащим 5 мМ кальция. Введение 5 мМ кальция повышает выход по белку до 660 мг, активность ферментного препарата до 1584 ед.

(Л

С

00

кэ

NJ 00 VI 00

П р и м е р 3. Процесс проводят по примеру 1, но экстракцию проводят борат- но-щелочным буфером рН 8,2, содержащим 10 мМ кальция. Введение 10 мМ кальция повышает выход по белку до 674 мг, активность ферментного препарата до 2292 ед.

П р и м е р 4. Процесс проводят по примеру 2, но экстракцию проводят борат- но-щелочным буфером рН 8,2, содержащим 15 мМ кальция. Введение 15 мМ кальция повышает выход по белку до 650 мг, активность ферментного препарата до 1365 ед.

П р и м е р 5, Процесс проводят по примеру 1, но экстракцию проводят борат- но-щелочным буфером рН 8,2, содержащим 20 мМ к.альция. Введение 20 мМ кальция повышает выход по белку до 610 мг, активность ферментного препарата до 1037 ед.

В таблице представлены сравнительные данные выхода фосфолипазы Д, полученной по известному и предлагаемому способам.

Активность фосфолипазы Д выражена в микромолях холина, образующегося из лецитина за 1 мин под действием 1 мг фосфолипазы Д по белку.

При сравнении данных по известному и предлагаемому способам видно, что повышение концентрации трис-буфера до 0,1 М

0

5

0

5

при рН 8,2 дает выход белка 409 мг, что выше известного (267 мг). Смена буфера на боратно-щелочной приводит к увеличению выхода белка до 596 мг. Точно так же «зели- чивается выход по активности ферментного препарата: 900 ед. и 1073 ед. вместо 368 ед. Введение 5-20 мМ кальция повышает как выход по белку, так и активность фермента (см. таблицу). Максимальное увеличение наблюдается при введении 10 мМ кальция: выход по белку увеличивается до 674 мг, а активность ферментного препарата - до 2292 ед.

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с прототипом: повышает выход фермента в 2,5 раза; увеличивает каталитическую активность полученного препарата в 6.2 раза. Формула изобретения Способ получения фосфолипазы Д, включающий экстракцию белков буфером из корнеплода среднеазиатской редьки и осаждение целевого фермента охлажденным ацетоном, отличающийся тем, что с целью повышения выхода белка и каталитической активности фосфолипазы Д, экстракцию проводят боратным буфером рН 8,2, содержащим от 5 до 15 мМ кальция.

Использование: техническая биохимия, медицина, пищевая промышленность. Сущность изобретения: фосфолипазу Д получают экстракцией белков из корнеплода среднеазиатской редьки с осаждением целевого фермента ацетоном, при этом для повышения выхода и каталитической активности экстракцию проводят боратным буфером рН 8,2 с добавлением в среду выделения 5-15 мМ ионов кальция. 1 табл.