СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ Советский патент 1971 года по МПК C12N9/82 

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способу выдeJIeния ферментов, например L-аспарагиназы.

Известны различные способы выделения ферментных препаратов. Например, L-acnapaгиназу выделяют из культуральной жидкости, полученной при выращивании микроорганизмов, путем введения в нее многоатомных спиртов с последующим добавлением органического растворителя.

Предлагается в качестве лшогоатомных спиртов использовать полиалкилены с молекулярным весом не более 10000, предпочтительно 1000-5000, в таком количестве, чтобы концентрация полиалкилена в растворе соетавляла 40-60%. В качестве полиалкилепа можно применять полипропилен- или полиэтиленглнколь.

Способ осуществляется следующим образом.

В раствор фермента, содержащий 1-30%, лучше 1 - 10%, L-аспарагиназы, вводят 40- 60%-иый водный раствор полиалкилена, предпочтительно полиэтиленгликоля, до достижения его концентрации в растворе 15-40%, желательно 18-30%.

гирование., а в по.тученный фугат вновь вводят иолпалкилен. Эту операцию повторяют несколько раз. Осадки сооирают и удаляют из них иолиалкилеп, растворяя их в воде и удаляя нерастворимые компоненты.

Из раствора, освобожденного от полиалкилена, осаждают У -аспарагпназу, вводя в него органически растворитель, например избыток ацетона, диизопроппловый эфир.

Из растворенного осадка полпэтиленгликоль можно удалить путем диализа и выделить фермент, вымораживая не поддающиеся диализу компоненты.

Кроме того, осадок можно высушить, а затем извлечь полиалкиленгликоль, в частности иолиэтиленгликоль, с помощью ацетона или других растворителей.

Целесообразно весь процесс выделения ферментов производить при температуре О- и любых значениях рИ, предпочтительно 4,0-10,0.

Пример 1. 1000 мл раствора, получепного из 50 г сырой L-аспарагиназы с актпв} остью 112 ед/мг, охлаждают до и смешпвают с 500 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля. Осадок выделяют ценгрифугированием. Из оставшегося раствора с помощью 100/кл 50°/о- 1ого раствора полиэтиленгликоля осаждают дополнительное количество продукта п выделяют его. Фугат снова смешивают с 100 мл раствора полиэтиленгликоля и вызывают новое осаждение. Операцию осаждения раствором иолнэтиленгликоля повторяют до 3-4 раз. Достигнутые степень чистоты и выход L-аспарагиназы для четырех фракций пр 1ведены в табл. 1. Таблица 1 стью 576 ед/мг растворяют в 100 мл воды и фракционируют несколько раз, используя раствор полиэтилеигликоля, как описано з примере 1. В табл. 2 представлены полученные для четырех фракций результаты. Таблица 2

Пример 2. 100 г сырой аспарагиназы с активностью 103 растворяют в 2 л воды и осветляют при центрифугировании. Доводят рН раствора до 8,5 с помощью 1 N КОН и фракционируют, используя раствор полиэтиленгликоля, как в примере 1. Полученные вторую и третью фракции объединяют. Выход 12 г или из расчета на исходную активность 88% от теории. Получают L-аспарагиназу с активностью 765 ед/мг.

Пример 3. 5,0 г полученной путем фракционирования с помощью ацетона предварительно очищенной L-аспарагиназы с активноПредмет изобретения

L-аспарагиназы, из культуральной жидкости, полученной при выращивании микроорганизмов, иутем введения в нее многоатомных спиртов с последующим добавлением органического растворителя, отличающийся тем, что в качестве многоатомных спиртов используют полиалкилены с молекулярным весом не более 10000, предпочтительно между 1000 и 5000, добавляемые в виде 40-60%-кого водного раствора.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полиалкилена используют полиэтиленгликоль.