СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА Советский патент 1973 года по МПК C12P19/40 

Изобретение относится к микробиологической отромышлениости.

Известен способ .получения «ноэина путем вьцращищадия продуцирующих его меткрооргадиамов рода Bacillus на питательной среде, содержаш.ей источники углевода, органического и неорганического азота, аденина, необходимые амданойислоты, минеральные соли и стИ|мулято.ры роста 1пр.и переьмешивгиии и аэрации среды, отделения биомассы извлечения инозина из культуральной среды SIKTMBMрованньш углем, отделения инозина от угля л-ромывкой, осветления раство.ра на ионообменной смоле с последующем осаждением иноЗИна из pacTBOipa этиловым спирто-м.

Предлагаемый способ лоз:воляет увеличить вы-ход инозина.

Для этого в качест1ве продуцирующих микроорганизмов используют штамм iBacillus subtilis Ген-2б5, .не п.родуцирую.щий аденин, тирозин, гистидин.

В качестве источ.ника углевода можно использовать мелассу, гидрол, а в качестве источника аденина, амииокислот и органического азота-(кукурузный экстракт, соевую муку или белково-витаминнцй концентрат.

Перед осветлением раствора на ионообменной смоле желательно его концентр.ировать упаривавием под вакуумом, а перед

осаждением проводить вторичное упаривание .также .под вакуумом.

Штам-м Bacillus subtilis Ген - 265 .имеет следующие свойства.

Гр aiM м и о л ОЖ1И тел ьн а я, сно р оо б р а зу ю ща я .палоч.ка.

На мясо-паптоином агаре (сутки роста при 37° С) образует желтовато-серые круглые колонии диаметром 2-2,5 мм, шероховатые, с лопастным краем кожистой консистенц.ии.

При посеве штрихом на мясо-;пептонном агаре (сутюи роста .цри 37° С) наблюдается умеренный рост, штрих широкий, опаковый с лопастным краем и матовой шероховатой поверхностью, кожИстой консистенции.

Па мясо-лептонном бульоне образует морщинистую сухую лленку.

На ломтиках картофеля пигмент не образует, .имеет матовую сухую скла.дча,тую поВерхиость.

Желатину разжижает; .крахмал-гидрол.изует; молоко-(пептониаирует.

Во всех случаях роста на полноценных средах П|рисутствует залах, характерный для культур вида Bacillus subtilis.

На синтетических средах с минеральным азотом рост отсутствует.

Штамм нуждается в добавке аденина, тирозияа, гистидина. О.пти1мальная температура

для роста 37° С. При ферментации на специально составленных средах, содержащих непищевое сырье, штамм Ген-265 накаплиВает до 10,0 г1л .инозйна.

Хранение щтамма нроизводят в виде лиоф|Ильно высушенных культур в стеклянных а1М1пулах.

В предлагаемых средах в качестве основных источников углеводов, аденина и аминокислот истользуют отходы пищевой П|ромышлен11ост1и и пищевое сы:рье (свекловичная меласса, гидрол, кукурузный эмстра.кт, соевая мука и белково-витаминный концентрат БВК).

При йонользованни в качестве .источника углеводов для мвкробиолотичаскаго синтеза инозина .мелассы в ферчментационную среду, а следовательно, и культуральную жидкость вносят значительное количество нео.ргаиичеС1ких солей, окрашенньгх соединений, органических соединений .кислого и основного характеров.

Эти соединения сильно затрудняют выделевие йнозина.

На стадии выделения для отделения биомассы культуральную жидкость центрифугируют и к супериатаяту добавляют для адсорбции няозина активизированный уголь марки СТ (100-250 мещ) «з расчета 100 мг угля на 10 мг нуклеозида.

После перемешивания уголь отфильтровываю.т. Инозин элюирует щестшкратной экстракцией водно-спиртовым раствором аммиака .и фильтраты концентрируют в до 1/10 ;Первоначально.го объема.

Поскольку нолученный сконцентрированный раствор сильно окрашен, то его осветляют, пропуская через колонку с крупнопористой смолой на основе метафевилендиамина и формальдегида. Смола обладает более сильными адсорбционными свойствами по отношению iK пигмен.та.м мелассы, чем к нуклеозидам.

Выходящую бесцветную жидкость, содержащую ИН031ИН, упаривают под вакуумом и для осаждения ииозииа добавляют четыре объема этилового спирта.

Инозин кристаллизуют на холоде в течение нескольких часов, отфильтровывают и высущявают на воздухе.

Пример 1. Размножение культуры осуществляют в несколько этатов.

Ее поддерживают на агаре Хоттингера и инкубируют при 37° С в течение 24 час. Культуру со скошевного агара-Хоттиигера нереносят на жидкую .посевную среду следующего соста1ва, %:

Глюкоза2,0

Паптон1,0

Дрожжевой экстракт1,0

NaCl0,25

Инокулят инкубируют в аэрируемых условиях (на качал.ке) при 28° С в течение 24 час. Посевной Материал передают в ферментационную среду в количестве 2-5 об: %.

Используют фермента.ционные среды следую.щего состава, %:

Ферментационная среда 1

Меласса20,0

Кукурузный эктракт 3,0

(NH4)2S042,0

СаСОз2,0

КН2Р040,2

К2ПРО40,2

MgSO4 - 7Н2О0,4

Вода 1водоирово.дная Ферментационная среда 2

Меласса20,0

Кукурузный экстракт 3,0 Мочевлна0,6

CaCl2.2H200,01

КН2Р040,2

К2НР040,2

MgSO4 - 7П200,2

Вода водопроводная

Процесс ферментации проводят мето.дом глубинного .культивирования в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 15 мл среды, «а (качалке, делающей 220-250 об/мин, ил.и металлическИХ фер:ментерах емкостью 20 л с т рби1нной мешалкой (скорость 700 об/мин), барбатером и системой автоматического пеногашения.

Перед началом фермента.ции значение рП среды должно быть близким к нейтральному (перед стерилизацией рП сре.ды дово.дят раствором NaOn до 7,0-7,2).

Оптимальная аэрация для указанных сред соответствует скорости растворения кислорода (35,0 мг О2 л в мин).

Уменьшение скорости растворения кислорода iB среде подавляет биосинтез инозина.

О,пт1имальной темюературой процесса биосинтеза является 28-30° С. При понижении или ловышании темиературы на 4-6° С биосинтез инозина в значительной степени тормозится.

При оптимальных условиях ферментации

ма,к1симальное накопление инозина наблюдается на шестые сутки. В -конце фер:ме.нтации

в культуральной жидкости накапливается

до 7,0 г/л имоз.ина.

Для выделения инозина «ультуральную жидкость (600 мл) центрифугируют 30 мин. Показатель прело.мле-ния центрифугата равен 1,3512; вязкость раствора 3,8 сп; рН раствора после прибавления 1,5 мл концентрированной соляной к}рслоты раван 7,0.

К центрифугату добавляют 30 г активированного угля СТ ( меш).

Предварительно уголь кшпятят с 3 М соляной кислотой и отмывают до нейтральной реакции. Раствор с а1кти1В|Ированны м углем

перемешивают 15--20 мин, после чего отфильтровывают под вакуумом через бумажный фильтр. После промывания угольных осадков водой ИНО.ЗИН -извлекают спиртовым раствором ам миа1ка (С2Н50Н : NiH40H : вода-25 :

: 1 :24).

После шестикратной экстракции объем фильтрата равен 600 мл.

Полученный концентрат пропускают через колонку со смолой ИА-1 на основе формальдегида ,и парафенйлендиамина и фенола (высота 5 см, объем 10 мл) со скоростью 1,5 мл в 1 мин. Затем колонку лромьивают двумя объемами воды с той же скоростью и фракции, соаержа.ЩИе инозин, объединяют и упар.ивают в ;ва1с}уме при 40° С до 10 мл.

Для осажделия инозина к раствору добавляют 40 мл этилового соирта ,и раствор выдержлвают нри 40° С 10 «гас. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и лерекристаллизовьгвают из Бодио-спиртового раствора. Кристаллы высушивают в ваку м-экстражторе над CaCla.

Выход инозина на стадии кристаллизации 33%-.

Маточные растворы Д01ба(вляют к следующей царпии концентрата и немеете с ним осветляют на колонке со смолой ИА-1.

Пример 2. Штамм-продуцент, условия ферментации и выделения ийозима те же, что и в лртмере 1. Отличие состоит в составе посевной среды.

Посевная среда содержит, % :

Меласса4,0

Кукурузный экстракт 2,0 (NH4)2SO40,5

СаСОз1,0

Вода водопроводиая

Содержание иноздна в конце фер.ментацпи 7,2 г/л.

Пример 3. Шта:М1Липродуцент, условия ферментации и выделения инозина та1кие же, как в примере 1. Отличие ;в составе ферментациовной среды.

Состав фер.ментационной среды, %: Меласса20,0

Соевая мука5,0

NH4NO32,0

СаСОз2,0

Вода водопроводная

Содержа/ние инозина в конце ферментации 6,7 г/л.

При ер 4. Штамш-продуцент, условия ферментации и выделения инозина такие же, как в примере 1. Отличие в составе посевной и ферментационной сред.

б

Состав посевной среды, %:

Гидрол4,0

Кукурузный экстракт 2,0 Б: В. К.1,0

1 Н4НОз0,5

СаСОз1,0

Состав ферментационной среды, % : Гидрол20,0

Кукурузный экстракт 2,0 Б. В. К.1,0

NH4NO32,0

СаСОз2,0

Вода водоироводная

Содержание ««озина в конце ферментац)П 10 г/л.

Предмет изобретения

1.Способ получения инози;га путем -выращиваиия продуцирующих его микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углевода, органического и неорганичеса :ого азота, аденина, необходИМые аминокислоты, минеральные соли и стимуляторы роста при перемешивании и аэрации среды, отделения биомассы, извлечения инозииа из культуральной среды активированным углем, отделения инозина от угля пр0 мыв1кой, осветления раствора на ионообменной смоле с последующим осаждением инозина из раствора этиловым спиртом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода инозина в качестве продуцпрующих микроорганиз.мов используют щталгм Bacillus subtilis Ген-265, не продуцирующий аденин, тирозин, гистидин.

2.Способ по и. I, отличающийся , что

0 в качестве источника углевода используют мелассу, гидрол, а в качестве источника аденина, аминокислот и органического азота - клжурузный экстра.кт, соевую муку илз белково-витаминный концентрат.

3.Способ по п.н. 1 и 2, отличающийся тем,

5 что перед осветлением раствора на ионообменной смоле его концентрпруют упариванием нса вакуумом, а неред осаждением проводят вторичное упариван1 е, также под вакуу0мом.