Способ получения цитохрома с Советский патент 1975 года по МПК C07K1/36 C07K14/80 

1

Изобретение относится к медицине.

Известен способ получения цитохрома С, по которому дрожжевые клетки ДЕШЖДЬ} промывают и отделяют центрифугированием. Затем их разрушают этилацетатом, после чего провод::т экстракцию водой в присутствии сульфата аммония (1О%-ного насыщения) при рН раствора 7,0-7,5,:Уста.1{ввливаемом аммиаком.

После этого отделяют взвешенные час,тицы центрифугированием. Полученный гат диализуют, затем диализ пропускают через колонку ДЭАЭ- целлюлозы.

Полученную жидкость диализуют, под вергают повторной хроматографии на; колонкё КМ-целлюлозы, при этом цитохром С адсорбируется в верхнюю часть колонки. Десорбцию цитохрома С и.з колонки КМ- целлюлозы осуществляют аммиаком. диализуют и высхшивают при температуре -75 С, Выход сырого фермента цитохрома С при пересчете на высушенные дрожжи составляет 0,03%.

Цель изобретения - сокращение процесса и увеличение выхода продукта.

Для этого экстракцию цитохрома С после разрушения дрожжевых клеток ocy-i ществляют раствором сахарозы, а очнсрку продукта проводят последовательной iсорбцией его в статических условиях на , КМ-целлюлозе и пропусканием элюата ; через колонку ДЭАЗ- целлюлозы и КМ1 целлюлозы.

Пре алагаемый способ заключается в следующем.

Клетки дрожжей разрушают этилацетатом и центрифугируют при 5ООО об/мин в течение 10 мин. Разрушенные клетки промывают дистиллирован ; НОЙ ВОДОЙ Два раза и псшторно цевтрифуч : гируют.

Из разрушенных и промытых клеток экстрагируют цитохром С раствором сахарозы (0,25 М). Причем осуществляют этот процесс в присутствии сульфата аммония до 1О%-ного насыщения. Значений рН раствора с помощью 5%-ного раство ;ра аммиака устанавливают 7,0-7,5. За,тем раствор оставляют в покое при 5IJLD С в 7ечение 2,5-3,0 часов. После

этого его центрифуткрукхг пглг 13ООО об/мин в течение Ю мин при 1-4 С. Пол -ченн ю надосадоч гую жидкость красноватого цвета проверяют спектрефотометрически. При наличии максимумов спектропоглошенйя при длинах волн 316,412,548 и 548 нм продолжают процесс.

Жидкость ставят на яиализ в целлофа: новых мешках против 2 О объемов 2 мМ раствора- однозвмещенного фосфата калия, i содержащего О,.-:5 М сахарозы в течение 16 час, а затем пропускают через коло: -; ку КМ-целлюлозвл, обработанной 2 мМ , раствором фосфата калия з статических условиях (т.е. в резервуарах). Адсорбиро- ванный цитохром С на КМ-целлюлозе пе реносят на стеклянную воронку к промывают 10 ivdAI раствором сянозамегаекного фосфата калия (с применением вакуума). Элюцкю проводят буферным раствором двузамещенного фосфата натрия рН 8,5 : 9,0, Элюат пропускают через копошг/

ДЗАЗ целлюлозьь обработанной указанны : выше буфером.

Раствор й лаллзукут в цеплофановых меjuKax против 2О объемов. 2 мМ раствора однозамешегпюго фосфата калий в присут: ствйк 0,25 Мсахарозы в течение 8 час ; затем хроматографируют на КМ- целлголозы. ггромывают и элюирую .

Раствор цитоярома С ставит ка еиелиз против дистнллированкой воды в течение

4

:1О час, после чего высушива от лиофиль о при 75 С

Выход фермента при пересчете на высушенные дрожжи ™ 0,04% при содержанЕ и чистого цитохрома С 50-55%.

Цитохром С, пол Т1енный по данному способу, проверен в экспериментальных и клинических условиях и дал положительные результаты при лечении патологичесних состояний, св5{эакных с гипоксией и аноксией (различные нарушения KpOBo;i6ращения: кислородное голоданием организма, отравления,; мышечные и нервные заболевания, травмы мозга, ожоги).

О

редмет изобретения

Способ получения цитохрома С путем экстракции разрушенных этилацетаТом дрожжевых клеток в присутствии сульфата аммония, освобождения экстракта от взвешенных частиц, диализа, последующей очистки с использованием ДЭАЭ-целлюло- зьт и КМ-целлюлозы, отличаю щий с 3 тем, что, с целью повышения выхода п-олевого продукта, экстракцию осущес твляют раствором сахарозы, а очистку проводят по-слелователъной сорбцией целевого продукта в статических условиях на КМ-ыеллюлозе и пропусканием элюата через колошсу ДЗАЗ-неллюлозы и КМцеллюлозы.