Способ получения стойких гликопептидных антибиотиков Советский патент 1976 года по МПК C07G11/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТОЙКИХ ГЛИКОПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

Пример 1. Используют флеомицин Dj (медьсодержащий хлоргйдрат) с максимумом поглощешш 147 при 244ммкм и другим максимумом поглощения Е - 54 при 300 ммкм в метаноле. 20 мг порошкообразного флеомицина DI растворяют в 1 мл воды и в расгаоре суспендируют 20 мг двуокиси марганца. Реакцию проводят , при комнатной температуре в течение 40 час при перемешивании. После реакции суспензию фильтруют и фильтрат пропускают через колонну, заполненную смолой СМ - Сефадекс С-25, предварительно обработанной 0,05 М раствором хлористого натрия для абсорбции продукта реакции. Затем концентрацию раствора хлористого натрия, применяемого в качестве элюата, линвйно повышают, от 0,05 до 1 М для элюировання проодт та реакции. В результате элюируют непрореагировавший флеомицин D, feo фракции, элюированной 0,40 М раствором хлористого натрия, а продукт реакции блеомицина Вг элюируют во фракции, элюированной 0,44 М раствором хлористого натрия. Последнюю фракцию пропускают через колонну, заполненную 1 мл активного угля, что приводит к адсорбированию блеомицина БЗ . Затем продукт промьгаают водой для удаления неорганических солеи и элюируют смесью 0,02 н.раствора соляной кислоты с ацетоном (1:1) и элюат пропускают через продукт, что приводит к элюированию раствора голубого цвета, содержащего блеомицин 82 (медьсодержащий хлоргищ)ат). К элюату добавляют анионроб.менную смолу Дау Х-44. (гадроксильный тип) Д7И доведения рНэлюата до 6,0. и элюа,т фильтруют, растворитель удаляют и вые увдйва|&т. Получают 12 мг голубого порои1К:а..блермии 1нй В (медьсодержащий хлоргИдрат).

Полученное соединение имеет специфический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для гликопептида неполной структуры П, имеет макс , ,м

159 при 244 ммкм, др

поглощения Е,

1см 1 244 ммкм, др и мак, Л 1см Р 293 ммкм и сммум поглощения Е концевую адсорбцию в метаноле.

Величина. Rf для полученного соединения составляет 0,66 при тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол : 10%-ный ацетат аммония : 10%-ная шщ)оокись аммония - Ю : 9 : 1)и 0,56 при тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол : пиридин : зт«сусная кислота : вода 15 : 10 : 3 : 12), что соответствует указанным величинам Rf для блеомицина Bj.

Продукты гидролитического разложения полученных вещест следующие;

CH,-Cri-CH-COOH

I1

III

он NH,

H2N JJ

СНг-СНгСООН

IV НООС 2

СН,-СН - СИ -СН-СООН

J III

NH он CHj

СН-СН-СООН VI

° 2

NH,-СН,-СН-СООН

VJI

,)

NH.

TJ-TTСООН. N-TT- T

.

VIII

NH -CH -CH -CH -CH -NH-C-NH

NH

Антимикробная активность по отношению к микроорганизму Mycobacterium 607, определяемая по чащечному методу (активность стандартного б.пеомицина АЗ - основания принимается за 1000 и/мг), составляет 2720 ед/мг.

Сравнение стойкости полученного блеомицина В2 и исходного флеомицина DI в кислой среде приведено в табл. 1.

1,0 мг полученного блеомицина Bj и такое же количество флеомицина DI растворяют в 10мл 0,01 н.раствора соляной кислоты, и полученный раствор выдерживают в кислой среде (рН2) при 27 С в течений часа. Определяют остаточную антимикробную активность на Mycobacterium 607 по чащечному методу (выражена в расчете на 100 ч. первоначальной антимикробной актив)1ости).

Таблица 1 Пример2. 20мг порошкообразного флеомицина Е (медьсодержащий хлоргидрат) с максимумом поглощения Е,154 244 ммкм, другим максимумом поглощения Е 57 при 300 ммкм и концевым поглощением УФчасти спектра в метаноле окисляют по методике примера 1, и полученный продукт выделяют хроматографией с применением СМ - Сефадекса С-25 в соответствии с методикой примера 1. В результате непрореагировавишй флеомицин Е элюируют во фракции, элюированной 0,60 М раствором хлористого натрия, а полученный 84 злюируют во фракции, злюированной 0,64 М раствором хлористого натрия. В соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатьшают активным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют и растворитель удаляют. Продукт высуишвают и получают 10 мг голубого пороижа блeo fflци a Вц (медьсодержащий хлоргидрат). Полученное соединение имеет специфический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для г;шкопептнда непо/шой структуры I, и имеет максимум поглощения Е,° 162 при 244 ммкм, другой максимум поглощения Е, ° при 293 ммкм и концевое поглощение в метаноле. Величина Rf для тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол : 10%-ный ацетат аммония : 10%-ная гидроокись аммония - 10:9:1) составляет 0,50, а для тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол : пиридин : уксусная кислота : 1Вода 15:10:3:-12) -0,54. Антимикробная активность на Mycobacterium 607, определяемая по чацючному методу (активность стандартного свободного основа1Шя блеомицина АЗ принимается за 1000 и/мг), составляет 6354 и/мг. Сравнение стойкости Г1олу1енного блеомицина 84 и исходного флеомицина 04 в кислой среде приведено в табл. 2. Таблица 2 П р и М е р 3. 20 мг порошкообразного флеомицина D (не содержащий медь хлоргидрат) с максимумом поглощения Е|- 150 при 244 ммкм, друтм максимумом поглощения Е 56 при 300 ммкм и концевым поглощением УФчасти спектра в метаноле, содержащим CuSO4, окисляют по мето;о1ке примера и полученный продукт выделяют хроматографией с применением СМ - Сефадекс С-25 по мсгошпсс примера 1. В результате 11ег1 юреа1ировавишй флеомитщн D злюируют во фракщ.и, элюнрованной 0,42 М раствором хлористою на1рия, а полученiii u блеомицин Б2 злюируют но фракции, :)Л|пирс)в;11пи.1Й 0,46 М раствором хлористого натрия. 8 соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатьшают aKTitBHbiM углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют и растворитель удаляют. Продукт высущ1тают и получают 9 мг бесцветного порощка блеомицина Bj (хлоргидрат, не содержащий медь). Полученное соещ1нение имеет специфический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для гликопептида Е1еполной структуры Г, и имеет максимум поглощения Е,, 161 при 244 ммкм, другой максимум поглощения -Е ° 127 при 293 ммкм и концевое поглощение в метаноле (содержит сульфат меди). Величина Rf для тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол : ацетат аммония : 10 %-ная гищзоокись аммония - 10:9:1), составляет 0,61, а для тонкослойной хроматографш на авицеле (н-пропанол : пиридин : уксусная кислота : вода 15:10:3:12) -0,48. А1ттиьп1кробиая активность на Mycobacterium 607, определяемая почащечному метод (активность стандарт1{ого свободного основания блеомицина А2 принимается за ЮООед/мг), составляет 2680 ед/мг. П р и М е р 4. 20 мг поротикообразного флеомицина D (медасодержащик хлоргадрат), имеющего максимум поглощения Е. 47 при 244 ммкм, другой максимум поглощения 54 при 300 ммкм и концевое поглощение УФ-части спектра в метаноле, и 20 мг феррицианида калия растворяют в 1 мл воды и осуществляют реакцию при комнатной температуре в течение 48 час. После реакции реакционную смесь пропускают через колонну, заполненную 30 мл СМ-Сефадекса С-25, предварительно обработанной 0,05 М раствором хлористого натрия. Ферришташщ калия и продукт его реакции проходат через колонну, флеомицин и продукт его реакщщ адсорбируются с образованием голубой полосы на верхней части колонньк Концентратдаю раствора хлористого натрия в качестве злюата повышают линейно от 0,05 до 1,0 М при злюированин продукта реакции. В результате непрореагировавишй флеомитщн Dj з.люируют во фракции, элюированной 0,40 М раствором хлористого натрия, а продукт реакции - блеомицин 82 элюируют во факции, злюированной 0,44 М раствором хлористого натрия. В соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатьгеают акттшным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют и растворитель удаляют. Продукт высупшваю и полушют 6 мг го;тубого поротпка бтгеомицина Bj (медьсодержащий хлоргидрат). Пол ченное соединетте имеет спетшфическнй спектр поглощения УФ-лучей, характерный для глнкопептида неполной структурь Т, и имеет максимзм пог.лощершя Е .., 156 при 244 ммкм, другой максиму м поглощения Е | при 293 ммкм и концевое поглощеште в метаноле. Величина Rf получен1ГО О соодннения дчя тонкослойной хроматог11афии на спликагеле (лтеганол. : 10 %-Hbiii ацетат аммония