Способ получения фруктозы из глюкозы Советский патент 1977 года по МПК C13K11/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРУКТОЗЫ ИЗ ГЛЮКОЗЫ

Выбор буферной системы зависит от степени кислотности в растворе субстрата, создаваемой самим раствором при наличии активных ионов, которые могут быть введены в субстрат и во внутрь пор, например ионов кобальта или магния. В этом случае кислотного действия этих ионов можно избежать путем добавления сульфитных солей.

Для приготовления ферментного препарата согласно описываемому способу желательно, чтобы носитель, используемый для адсорбирования глюкозоизомеразы, обладал следующими свойствами:

о

Размер пор. А:

средний175

минимальный140

максимальный220

Поверхностная площадь, мг/г100

Объем пор, ,6

Пористость, %62,5

Размер частиц, меш25-60

Пример 1. Около 5 г состава, содержащего - 444 г глюкозоизомеразы, полученной из микроорганизма Streptomyces, добавляют к 28,7 мл 0,1М раствора ацетата магния в стакане емкостью 50 мл. Содержимое стакана перемешивают 25 мин при комнатной температуре, а затем фильтруют через фильтровальную бумагу. Остаток на бумаге несколько раз промывают и промывные воды собирают непосредственно в фильтре для отделения фермента. Общий объем фильтрата составляет 50 мл. Затем 500 мг частиц пористого алюминия вводят в сосуд с круглым дном емкостью 50 мл, добавляют 10 мл указанного раствора глюкозоизомеразы. Сосуд помещают во вращающийся испаритель, в котором создают вакуум, и вращают в бане при 30-45°С с интервалом в 25 мин. Затем в сосуд добавляют 10 мл раствора глюкоизомеразы и, спустя 35 мин, при тех же условиях подвергают содержимое сосуда испарению.

При тех же условиях добавляют раствор глюкозоизомеразы с последующим испарением в течение 4 ч. Процедуру повторяют два и более раз с отделением 10 мл раствора глюкозоизомеразы. Затем в сосуд вносят еще 7 мл раствора глюкозоизомеразы и продолжают испарение 1 ч и 10 мин при 45°С. После этого сосуд извлекают из испарителя и охлаждают его содержимое в течение двух дней.

Общее количество раствора глюкозоизомеразы, добавленное к пористому алюминию, составляет 47 мл. К полученной композиции добавляют 50 мл 0,1М буферного раствора малениового натрия (при рН 6,8-6,9), содержащего 0,005М раствор хлористого кобальта и 0,001 М раствор сульфата магния. В течение часа при комнатной температуре берут пробы, Экстракт объемом 50 мл анализируют. После этого композицию промывают 20 мл воды и 10 мл 0,5 М раствора хлористого натрия, затем окончательную промывку проводят в воронке из пористого стекла 50 мл воды.

Композицию переносят в коническую колбу объемом 50 мл и хранят в буферной смеси при комнатной температуре с периодическими анализами общей пробы через 106-дневные интервалы.

Получают следующие результаты:

Пробы ферментного 39,8 международных экстракта (50 мл) единиц (ME) глюкозоизомеразы на 1 мл

Средний объем пробы 130 ME глюкозоизокомпозициимеразы на 500 мг

пробы

Средний объем за- 260 ME глюкозоизогрузкимеразы на 1 г

Пример 2. Носитель, аналогичный носителю, применяемому в примере I, предварительно обрабатывают. Для этого 11 г частиц окиси алюминия помещают в стеклянный цилиндр с притертой пробкой, куда добавляют 100 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 0,01 М раствор ацетата кобальта при рН 7,6. Закрывают пробку, перемешивают содержимое путем переворачивания цилиндра, после чего его помещают в водяную баню с температурой 60°С. Спустя 15 мин композицию декантируют, добавляют в цилиндр 100 мл свежего ацетата магния-кобальта, перемешивают переворачиванием и оставляют в покое на 2 ч и 30 мин при комнатной температуре.

Сырой раствор глюкозоизомеразы, содержащий 590 ME глюкоизомеразы на 1 мл в 0,6 М насыщенном растворе сульфата аммония, очищают для реакции с алюминием. С этой целью к 40 мл раствора глюкозоизомеразы добавляют 1,4 г сульфата аммония для осаждения фермента. Шлам перемешивают 20 мин. Затем путем центрифугирования жидкость удаляют, а к осадку добавляют 12 мл раствора ацетата магния-кобальта, и смесь перемешивают. После этого к раствору фермента добавляют 3 мл 0,5М раствора бикарбоната натрия и перемешивают для растворения фермента. Полученный раствор помещают на 15 мин в водяную баню с температурой 60°С. После бани раствор центрифугируют 15 мин при скорости 16000 об/мин и температуре 2°С. Светлый раствор фермента отделяют, а осадок удаляют. Полученный раствор фермента (28 мл) имеет рН 7,5. Если во время очистки активность не изменяется, то раствор содержит 23 600 ME глюкозоизомеразы.

Затем приготовляют ферментный препарат. Для этого раствор ацетата магния-кобальта после переворачивания цилиндра декантируют от частиц пористого алюминия. К последнему в цилиндре добавляют 28 мл раствора фермента, закрывают цилиндр пробкой, перемешивают содержимое путем переворачивания и помещают в водяную баню с температурой 60°С. В течение 2 ч и 30 мин цилиндр переворачивают каждые 15 мин. Затем его извлекают из бани и оставляют при комнатной температуре еще на 2 ч, переворачивая каждые 30 мин, после этого оставляют в покое на ночь.

Получают 28,5 мл (рН 7,1) раствора фермента, который декантируют, а затем анализируют. Композицию промывают 60 мл дистиллированной воды, затем 40 мл 0,5 М. раствора хлористого натрия и 40 мл раствора ацетата магния-кобальта.

Из цилиндра отбирают 3 пробы общим весом 1 г для анализа. Оставшиеся 10 г помещают в колонну с температурой нагрева 60°С. В колонну подают раствор, содержащий 50% глюкозы и 0,5 М. раствор сульфата магния с буферным раствором сульфата натрия для доведения рН до 7,7-8,0.

В течение первых 26 ч в композицию, пропускаемую через колонну, вводят 0,001 М раствор хлористого кобальта, затем кобальт вводить прекращают, и при дальнейщей работе колонны роль активатора играют только ионы магния.

Исходная объемная скорость потока в колонне - 190 мл/ч. Объем получаемой фруктозы составляет 80-85% от теоретического и поддерживается путем снижения объемной скорости потока через различные интервалы времени. Колонна работает 31 день. К концу работы в результате уменьщения подачи она подсыхает и высыхает полностью через 15 ч. Период изомерного полуперехода перед использованием показывает, что он имеет загрузку в 381 ME глюкозоизомеразы. Это свидетельствует о восстановлении - 17,8% активности от всего количества глюкозоизомеразы (в ME), адсорбированной в носителе.

Анализ прореагировавщего ферментного раствора (28,5 мл) показывает, что он содержит 161 ME глюкозоизомеразы, а восстановление активности в этом прореагировавщем растворе составляет 19,4%.

Величина рН колонны поддерживается в пределах 7,4-7,8 путем соответствующего регулирования подачи материала. Общая загрузка колонны 3810 ME.

Формула изобретения

Способ получения фруктозы из глюкозы путем выдержки раствора глюкозы с ферментным препаратом, отличающийся тем, что, с целью повыщения эффективности процесса и ускорения его, в качестве ферментного препарата используют глюкозоизомеразу, адсорбированную частицами окиси алюминия, имеющими поры диаметром 100-1000 А.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 3694314, кл. 195-31, 1972.