Способ индикации Советский патент 1980 года по МПК C12K1/04 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для ускоренной диагностики Mycoplas ma pneumoniae.

Известен способ индикации Mycoplasma pneumoniae в смывах- путем иладунофлюоресцентного исследования мазков 1 .

Однако известный способ позволяет выявить возбудитель лишь у 50-75% больных с инфекцией Mycoplasma pneumoniae.

Целью изобретения является повышение эффективности способа.

Эта цель достигается тем, что смывами заражают эксплантаты трахеи цыплят, обработанные стафилококковым токсином, культивируют их в питательной среде при температуре 33-37 С в течение 3-5 дней и затем готовят мазки-отпечатки.

Пример. От больных пневмониями производят забор носоглоточных или бронхиальных смывов с помощью . сухих стериальных ватных тампонов и помещают их в пенициллиновые флаконы, содержащие по 2 мл среды 199 с 0,5% желатины и пенициллин 1000 ед/мл. В .лабора-торни тампоны

со смывами тщательно отжимают пастеровской пипеткой и полученную мутноватую жидкость отсасывают в другие стерильные флаконы. Не позднее 1 ч после забора материала должно быть проведено заражение эксплантатов трахеи.

Для приготовления эксплантатов используют ткань трахеи 3-И)-дневных цыплят, которых выращивают в условиях термостатаиз развиваквдихся куринных эмбрионов. После извлечения трахею тщательно отмывают от крови в чашксос Петри раствором Хенкса с пенициллином 200 ед/мл. Затем в свежей чашке Петри для получения кольцевидных фрагментов трахеи проводят разрезлезвием бритвы по межхряшевым промежуткам. Кольца трахеи дополнительно отмывают в растворе Хенкса. Их ткани трахеи одного цыпленка готовят обычно 24 трахеальных кольца. Фрагменты трахеи в количестве трех колец псмещают в пенициллиновый флакон, содержадий 1 мл среды 199; проводят, пипетирование с целью промывания просвета трахеальных колец. После удаления среды из флакона вводят О , 1 мл

стафилококкового токсина (исходный, гемолитический титр 1:1600) в разведении 1:32.-4:64 (разведение производят в среде 199); оптимальная концентрация токсина, не обладающая цитотоксическим действием,, опрёделена путем титрования в культуре клеток куриных фибробластов, зараженных эталонным штаммом м.рпеитоniae. Контакт ткани трахеи и токсина дают в течение 15-20 мин. Далее не отрасывая токсин, во флаконы вносят 0,2-0,3 мл носоглоточного или бронхиального смыва больнь1Х. Инфицирование эксплантатов проводят путем непосредственного контакта-ткани трахеи и смыва в течение 30 мин. На один исследуемый материал берут 2 флакона с эксплантатами трахеи. По истечении времени контакта во флаконы наливают 1 мл питательной среды, состоящей из среды 199 с 2% нормальной лошадиной сыворотки без консерванта и 10%- дрожжевого Экстракта. Зараженные эксплантаты трахеи инкубируют .при 35±2С. .Спустя 3-5 суток после культивирования инфицированных эксплантатов из них готовят мазкиотпечатки путем прикладывания слизис той трахеи на поверхность обезжиренных предметных стекол (с каждого кольца трахеи снимают по 3 отпечатка) ..Далее препараты высушивают, фиксируют в смеси Никифорова- в течение 10-15 мин. После фиксации препараты исследуют непрямым методом иммунофлюорёсценции по Кунсу с использова.нием гипериммунной кроличьей сыворотки против M.pneumoniae с титром 1;320 и выше: на препараты с отпечатками, помещенные во влажную камеру . (чашки Петри) наносят 1 каплю иммунной сыворотки и инкубируют их при температуре 37°С в течение 30 ми После этого препараты отмывают в двух сменах забуференного физиологического раствора (рН 7,2) и споласкивают дистиллированной водой. На слегка подсушенный препарат наносят каплю а нтикроличьей флюоресциирующей сыворотки осла, разведенную до рабочего титра 1:8 (используют м,еченую флюоресциинизотиоционатом (ФИТЦ) сыворотку).После 20-минутной инкубации во влажной камере при 37.С препараты отмывают в течение 30 Мин в физиологическом растворе (рН 7,2), затем водой и просматрива после просушки и нанесения глицерин в люминесцентном микроскопе МЛ-2 ил ЛШАМ в падающем свете.

Предлагаемый способ более чувствительный и позволяет выявись возбудитель у больных в 2-4 раза чаще, чем известный способ. Так, при исследовании мазков, приготовленных непосредственно из смывов больных, антиген М„рпеитоп1ае выявлен лишь у 2 из 27 больных, а при исследовании мазков-отпечатков из зараженньвс смывами эксплантатов трахеи дополнительно еще у 6 больных. Известный способ выявляет антиген M.pneijmoniae только у двух., а предлагаемый способ - у всех четырех больных с нарастанием титра специфических антител и дополнительно ; у четырех больных без сероконве хиии к М.рпешпопгае. Поэтому использование предлагаемого способа выявления обеспечивает по сравнению с известным способом более высокий процент обнаружения M.pneumoniae у больных,

Формула изобретения

Способ индикации Mycoplasma pneumoniae в смывах путем иммунофлюаресцентного исследования мазков, о тл ичающи и с я тем, что, с целью повышения эффективности способа, смывами заражают эксплантаты трахеи цыплят, обработанные стафилококковым токсином, культивируют их в питательной среде при температуре 33-37 С в течение 3-5 дней и затем готовят мазки-отпечатки.

Источники информации, принятые во внимание при экспертиз

1. Ж.Микробиология, 1972, № 11, с.24-27.