Способ получения динуклеотидов Советский патент 1980 года по МПК A61K38/16 C07H21/00 

Изобретение относится к усовершенствованному методу получения динуклеотидов, которые используются для синтеза фрагментов нуклеиновых кислот, необходимых для исследований в молекулярной биологии, биохимии, и генной инженерии. Известен способ получения динуклеотидов, включающий цианэтил1фование (получение моноцианэтильного производного) нуклеотида избытком (18-60 крат ным) цианэтанола и присутствии конденсирующего агента - дициклогексилкарбо- диимида (ДЦК); цианэтильное производное выделяют из реакционной смеси экстракцией ДЦК циклогексаном и осаждением производного из раствора серным эфиром при -10 С, с последующей конден сацией полученного цианэтильного производного нуклеотида с нуклеотидным компонентом в присутствии конденсирующего агента трииаопропилбензолсульфонилхлорида (ТПС), Выход целевого продул, 41% l. Недостатком известного способа является применение на стадии образования циаиэтильных производных конденсирующего агента ДЦК, обладающего ярко выраженными аллергенными свойствами (Ъсобенно опасны его пары и эфирные растворы), и повыщенная взрыво- и пожаро-опасность процесса вследствие применения болыдих количеств огнеопасных растворителей (серный эфир и цшшогексан для удаления ДЦК). Цель изобретения - упрощение процесПоставленная цель достигается тем, что в способе получения динуклеотидов применяют 2-3 кратный избыток цианэтанола, а в качестве конденсирующего агента стадии цианэтнлирования-триизопропил- бензолсульфонилхлорида, что позволяет избежать применения ДДК, обладающего аллергенными свойствами и уменьщить пожароопасность процесса при выделении цианэтильного производного в результате замены экстракции циклогексаном (ДЦК) и осаждения в серном эфире обычной хроматографией, например на силикагеле в. системе хлороформ-метанол.

Кроме того, в качестве фенил (низший) алкилпроизводных применяют триизопропилбенаолсульфонилхлорид или мезитилбнсульфонилтриазолид (МСТ).

Выход целевого продукта 32-4О%,

Пример. 1. Синтез 5 -фосфорилдезокситимидилил-{3 -5 ) дезокситими- дина 61 (рТ-Т) с использованием дициаи- этилового эфира (дСЕ рТ), полученного с помощью ТПС.

а) Цианэтилированиес рТ.

Смесь 1,37 г (4 ммоль) дезокситимидин-5 фосфата (5рТ), 0,68 мл цианэтинола (СЕОН) высушивают упариванием с абсолют1й|1М пиридином.

Остаток после упаривания растворяют в 16 мл пиридина, добавляют в раствор 3,64 г (12 ммоль) ТПС и встряхивают реакционную смесь 2О ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги. При охлаждении до О С к смеси прибавляют 16 млпредварнтель но охлажденной воды, вьодерживают 3 ч при . Реакционную смесь концентрируют в вакууме до минимального объема и упаривают трижды с ЗО мл воды. Добавляют 45 мл воды и отфильтровывают осадок. Фильтрат упаривают досуха, высушивают упариванием с бензолом. Остаток после упаривания растворят в 40 м смеси хлороформ-метанол (9:lV/v) и наносят на колонку с 2ОО мл силикагеля (о,140-0,315 мм). Хроматографируют сначала в линейном градиенте метанола в хлороформе (4ОО мл СНС& -4ООмл смеси CHCfc - , 8:2 V/v), затем 400 мл смеси (СНСед - , l:lV/v собирая фракции по 8 мл/10 мин. Фракции 70-90 (32000 O.Egg-) упаривают, получают маслообразный остаток, содержщий 2,7 ммоля СЦгрТ (67,5% в расчет найрТ).

б) Конденсация нуклеозидного компонента (QCEgpT) с нуклеотидным компонентом (9рТ -ОАс).

1,9 г (4,2 моль) 3-О-ацетилтимидин-5-фосфата (ЙрТ-ОАс) высушивают упариванием с абсолютным пиридином. Остаток растворяют в 10 мл пиридина, добавляют в раствор 4 г (13,2 моль) ТПС и выдерживают реакционную смесь

1-3 ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги. К полученному активному производному нуклеотидного компонента приливают раствор 2,7 мольЗСЕ рТ в 6 мл пир1щина и вьздерживают смесь 6 ч при комнатной температуре При охлаждении до к реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденные 20 мл воды и в ыдерживают 12 ч при . Охлаждают реакционную смесь до , приливают 48 мл охлажденного до О°С раствора 2 н. N&OH и выдерживают 45 мин при . Нейтрализуют реакционную смесь ЗОО мл

смолы КРС-2П (f Н)до рН 8, переносят массу в колонку со 100 мл смолы КРС - 2П (Р,. ) и промывают колонку 1,5 л 30%-ного раствора пиридина в воде. Элюат упаривают досуха, растворяют

в 5ОО мл раствора триэтйламмонийбикарбоната (ТЭАБ) и наносят на колонку с 2ОО мл ионообменной смолы ДЭАЭмолселект А-25 (НСО 2,6:34 см). Хроматографируют в линейном градиенте

ТЭАБ (3 л 0,05 М - 3 л 0,35 М), собирая фракции по 2О мл/2О мин. Из фракций 276-350 выделяют 26OOOO.E.g динуклеотида 9(рТ-Т). Выход 32% (в расчете надрТ). Р{ (рТ-Т) относительно

дрТ в системе EtOH (3:7) 0,9; В250/ 250 0,66; ,,72; E2gQ/E. ,26. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте 94,3%, содержание динуклеотида по данным микроколоночной ионообменной хроматографии 97%.

П р и м а р 2. Синтез 5 -фосфорил- N -анизоилдезоксицитидилил-(3 -5 )-Н-изобутирилдезоксигуанозин 5 (рС G )| с использованием моноцианэтилового эфира (ЗСЕрС ), полученного с помощью ТПС.

а) Цианэтилирование 9рС .

Смесь 1,66 г (3,2 моль) пиридиновой соли Ь - анизоилдезоксицитидин-5 -фосфата (ЙрС ), 3,2 ммоля трибутиламина (TEA) в пиридине и 0,68 мл (9,2 ммоль) цианэтанола (СЕОН) высущивают упариванием с абсолютным шфи- дином. Остаток после упаривания растворяют в 16 мл пиридина, прибавляют к раствору 3,64 г (12 ммоль) ТПС и выдерживают реакционную смесь 1,5ч при комнатной температуре в условиях, исключающих попадание влаги. При охлаждении до (-20) С к смеси добавляют 16 мл воды и выдерживают 12 ч при 40°С. Упаривают реакционную смесь досуха, остаток высушивают 3-кратиым упариванием с дио саном, растворяют в 2О мл смеси хлоро форм-метанол (l:lv/v), В раствор доба ляют 5О мл скпикагеля.(О,14О-0,315м тщательно перемешивают массу и с пом щью вакуума удаляют из нее растворите Полученную сухую массу наносят на колонку с 200 мл силикагеля (О,140О,315 мм). Хроматографируют сначала в линейном грац кенте метанола в хлороформе (700 мл С-НСй - 700 мл смеси СНС-Сз - СН,,ОН, 8:2 V/V), затем ЗОО м смеси (CHCt - , 1:1,V/V), собирая фракции по 1О МЛ/1О мин. Из фр ций55-76 вьщеляют 147ОО О.Е.,„ (2i% в расчете HaQpC f, из фракций 78-155-320ОО O.E.oa аСЕрС {46% в расчете ). б) Конденсация;нуклеозидного компонента (ЙСЕрС) с нуклеотидным компонентом (ЙрСд;). Смесь О,7 ммольб1рСЕрС и 2,18 (3,9 моль) А О-диизобутирилдезоксигуанозйн-5 -фосфата (flpQi ) высушива упариванием с абсолютным пиридином, растворяют в 7 мл пиридина. Прибавляют к раствору 1,95 г (7,8 .-моль) МСТ и выдерживают реакционную смесь в течение 5 сут. в темноте в условиях, исключающих попадание влаги. При охла дении до(-2О)-С. к реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденные 16 мл 1 м раствора триэтиламина (ТЭА в пиридине и 8 мл воды и выдерж1-1вают 12 ч при 4°С. Охлаждают реакционную смесь до (-1О)°С, прибавляют 39 мл предварительно охлажденного до (-б) раствора, 2 н. НаОН и вьщерживают 20 мин при . Нейтрализуют реакцио ную смесь 200 мл смолы КРС-2П (PxjH) до рН 8, переносят массу в.колонку со 100 мл смолы КРС-2П (Ру Н и промывают колонку 1 л 20%-ного рас вора пиридина в воде. Фильтрат упарива досуха, растворяют в 20О мл О,О5 М ТЭА Б и наносят на колонку с 2ОО мл ионообменной смолы ДЭАЭ-молселект А-25 (НСО , 2,6-34 см). Хроматогра фируют в линейном градиенте ТЭАБ в 10%г-ном спирте (1,5 л О,О5 М 1,5 л 0,4 м), собирая фракции по 12 мл/8 мин. Из фракций 155-220 выделяют 1,ЗООО О.Е. динуклеотида Й( ). Выход 64% (в расчете набСЕрС ); .( Q) в системе с; El ОН 0,7; 2,jgQ/E2gQ 0,94; E2gQ/E jQQ l,13. Содержание нуклеотидного материала 95%, содержание динуклеотида по данным кнпсроколо- , ночной ионообменной хроматографии 97%. П р и м е р 3. Синтез 5-фосфорил- - Н -изобутирилдезоксигуанилил-(3/ -5 )-Н -анизоилдезоксицитозина 3 (pQ - С) -с использованием моноцианэтилового эфира (ЗСЕрС ), полученного с помощью ТПС. а)Цианэтилирование dpQ Цианэтилирование N-изобутирилдезоксигуанозин-5-фосфата (dpQ) проводят как описано в примере 2 за исключением того, что смесь 2 г (4 , моль) трибутиламмонийной солидрб , 0,68 мл (9,2 ммоль) СЕОН вьщерживают в течение 1 ч с 3,64 г (12 моль) ТПС. После обработки реакционной смеси проводят хроматографию на силикагеле элюируя сначала 700 мл раствора смеси СНСЦ-СН,ОН (8:2,V/V), затем линейным градиентом метанола в хлороформе (500 мл смеси CHCfcg - , 8:2, 500 мл смеси CHCErg, - , 2:3, Y/V), собирая (фршщииг по 7 мл/10, мин. Из фракций 4О-9 5 выделяют 11300 О.Е.« 1 7% в расчете HaapQ), из фракций; 19.О-24О-2700О O.E.ge (40%)olCEpQ. б)Конденсация нуклеозидного компонента (6CEpQ ) с нуклеотвдным компонентом (ЗрСдд). Конденсацию проводят как описано в примере 26 за исключением того, что в реакцию берут 2,8 г (4,8 моль) пиридиновой соли 3 -О-ацетил- Н -анизоилдезоксицнтид.ин-5-фосфата, 1,6 ммоль CEpq и 2,51 г (1О,О моль) МСТ. После обработки реакционной смеси и удалешш защитных групп хроматографируют в линейном градиенте ТЭАБ в 109а-ном спирте (3 л 0,05 М - 3 л 0,4 м) собирая фракции по 12 мл/8 мин. Из фршшлй 155-220 щеляют 25000 O.E.QQ динуклеотида а ( ). Выход 52% (в расчете на ЗСЕ pQ ); R 0,7 в системен Ид OAc-EtOH (3:7, V/v); E,go/E28o 0,87; Е,/3500 0.93. Содержание нуклеотидного материала 95%, содержание динуклеотвда по .данным микроколоночной ионообменной хроматографии 97%. П р и м е р 4. Синтез динуклеотвда {рТ-т) без предварительного дициан- этильного производного, полученного с помощью ТПС. Получение динуклеотида проводят так само как описано в примере 1 за ч i........ т . ,.-; .. : ,г/7: . /730 исключением того, что к реакционной смеСИ, полученной при взаимодействии 2,07 г (6,4 ммоль) триэтиламмонийной соли ЙрТ и 1 мл (14,9 . моль) СЕОН с г (18 моль) ТПС, приливают раствор активного производного нуклеотвдного компонента, полученного при взаимодействии 5,85 г (13,2 моль) пиридиновой солиЙрТОАс с 11,8 г (39 :моль) ТПС. После разложения реакционной смеси, как описано в примере 16 50 мл воды, удаляют цианэтильные и ацетильные защитные группы с помощью обработки 60 мл концентрированной КН-ОН в теченйе 5 ч при . Упаривают раствор и отфильтровывают осадок. Фильтрат разбавляют водой до 3 л и наносят на колонку с 750 мл ионообменной смолы ДЭАЭ - молселект А-25 (НСО, 40-5см) Хроматографируют в линейном градиенте ТЭАБ (О,О М 5 л - 0,5 М 5 л), собирая фракции по 42 мл/7 ми,н. Из фракций 23О-272 ввЩбляют 49ООО O.E.gsy нуклеотида а (рТ-Т). Выход 40% (в расчете наЗрТ). Продукт идентичен по качеству продукту, полученному в примере. 1 .8 Формула изоб ретения 1. Способ получения динуклеотидов, включающий цианэтилирование нуклеотида избытком цианэтанола в присутствии конденсирующего агента с последующей конденсацией полученного цианэтильного производного нуклеотида с нуклеотидным компонентом в присутствии фенил (низщий) алкилсульфошшпроизводных , о т личающийся тем, что, с целью упрощения процесса, применяют 2-3 кратный избыток цианэтанола, а в качестве конденсирующего агента стадии цианэтилирования - триизопропилбензолсульфонилхлорида. 2, Способ поп.1, отличающ.и и с я тем, что в качестве фенил (низший); алкилпроизводных применяют тринзопропилбензолсульфонилхлорид или мезитиленсуяьфонилтриазолид, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Бадащкеева А. Г., Берлин Ю. А. и др. Синтез олиго- и полинуклеотидов, ХПС, 1973, № 3, 394 (прототип).