Способ идентификации микроорганизмов-вредителей пивоваренного производства Советский патент 1980 года по МПК C12K1/00 

Изобретение относится к пивоваренной промышленности, в частности к способам идентификации микроорганизмоввредителей и может быть использовано в винодельчесжой, дрожжевой, консервной и безалкогольной промыиыенности. Известен способ идентификации -микроорганизмов-вредителей пивоваренного про иаводства, предусматривающий посев исследуемого образца на селективную питательную среду, культивирование микроqpraHB3MoB и их идентификацию 1. Недостатком известного способа явпяетса длительность и сложность процесЦель изобретения - интенсификация и удрощение процесса. Цель достигается тем, что после куль тяв овакия микроорганизмы отделяют от питательной среды центрифугированием, промывают О,85%-ным раствороц хлористого натрия и разводят их до конценсг рашш 1-2 млрд. микробных тел в 1 мл, а идентификацию проводят путем внесении пробы раствора в набор иммунных сывороток, получен1Ш1х иммунизацией животных штаммами микроорганизмов-вредителей и по реакции агглютинации судят о виде или группе мшфоорганизмов, причем перед иммунизацией сыворотки инактивиру1ог pи 56-6О с 4О-45 мин и выделяют из них глобулиновую фракцию путем обработки их насыщенным раствором сернокислого аммония, а перед вдентификещией сыворотки разводят 0,8 5% ным раствором хлористого натрия до 3/4 их титра. Исследуемый образец высевают на жидкие селективные питательные среды и культивируют микроорганизмы, после чего отделявэт их .от питательной среды центрифугированием. Осадок микроорганизмов промывают Os85%-HbiM раствором хлористого натрия (NaC6), разводят его до концентрации 1-2 млрд. микробных тел в 1 мл и проводят идентификацию их. Для чего пробу раствора вносят в набор иммунных (Сывороток, полученных нммунизацией животных штаммами микроорт-а низмов-вредителей, при этом сыворотки разводят 0.,85%-ным раствором хлористого натрия до 3/4 их титра и по реакции агтлютинации судят о виде или группе микроорганизмов, содержаяшхся в исследуемом образце. Перед иммунизацией сыворотки инактивируют при 56-60 С 40-45 мин и выделяют из них глобулиновую фракцию путем обработки их насыщенным раствороМ сернокислого аммония, вводимого в нкх. при перемешивании. Центрифугируют смесь и жидкость отбрасывают; осадок растворяют дистиллированной водой К раствору прибавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и повторяют операции, описанные выше. После этих операций сыворотка содержит очищенный глобулин. Очшяенные сыворотки используют для идентификации микроорганизмов. Пример, Исследуемый образецсусло высевают на яиадкую селективную питательную среду, в котор5ю для подавления дрожжей добавляют антибиотик актидион ИЛЕ нистатин и выращивают при З0с 18 часов до заметнрго изменения жидкой среды (помутнениВ) обраао вание пленки или осадка). Среду центрифугируют, отделяют осадок, промывают его физиологическим рас вором О,85%-ным раствором МаС8 и раз водят до концентрации 2 млрд. микробных тел в 1 мл по бактернальног ;у стандарту мутности Полученные таким образом вазесн одного или нескольких ви.аов млжрооргаши™ мов, находящихся в исследуемом образце готовы к вдентификадини Для обнаружения м11кроорганиаг,1Ог вредителёй и их идектификащгн прнмекгио набор специфических имунных сыварогополученных иммунизацией живот.ных. ан-тигенами соответствующих аидоз гли/фоорганизмов, Антигекы для иммунизации ro-roBsi следующим образом. Типовые культуры мшфооргаавамоввредителёй- рода Uacioboic-iEE.uSjPediotoc CU5, Acexotiacier, toMobacter-iusti, Лспто tviobacier высеивают на -твердые пн татеяьные среды, обеспечнвакядне хоро. шее накопление биомассы, и выращгшагет 48 ч при . Накопленную биомассу бактерий смывают физиологическим раствором и цек1р фугируют,. Осадок тркящы промывают фиаиологичесрсим раствором и разводят с концентрации 1ОО млн/мл. Пол чен-ые сусцеиаии бактерий прогревают при 0°С 4О мин. На этом приготовление нтигена для иммунизации заканчивается Способ иммунизации заключается в пятикратном введении в краевую вену уха кролика (весом 3 кг) возрастающих доз -антигена с интервалом 4 дня в количестве, мл; 0,5, 1,О, Ij5i 2, 4. Имь-гунизациЕО можно проводить и любым Другим известным способом:. Спустя 7 дней после последней инъекции лшвотных обескровливают и отделяют сыворотку кровио Для этого кровь, собранную в стерильные пробирки, ставят на 40 мин В термостат при , а затем в холодильник при на 4 ч. После полного отделешш сыворотки от сгустка крови еэ отсасывают пастеровской пипеткой. Для лучщего хранения сыворотки фильт- рукл- через бактериальный фильтр Зейтца. Honj eHKbie сыворотки содержат антителаэ отличительной особенностью которых является способность образовывать специфйч;еские соединения с соответс1вуюши1«{и антигенами (в данном случае микроорганизм, который использовался для иммуниаагщи). На этом принципе и основаны серологические реакции ацтиген-антитело ; Антитела относятся к глобулиновой фракции сыворотки, поэтому для усиления специфических свойств антисывороток из них выделяют глобулиновую фракцию следующим образом. Готовят насыщенный (раствор сернокислого аммония в дистиллированной воде при комнатной температуре. К определенному количеству сыворотки добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого а.ммония при температуре холодильника. Раствор сернокислого аммония добавляют медленно пипеткой, непрерывно ре1змеш.ивая сыворотку, Цантрифугярз/ют смесь при 4000 об/мин 30 МИН. Надосадочную жидкость отбрв сываюТо Осадок расгворяют медленно добав- jxari дистиллкр она иную воду. Если осадок, содержащий глобулин, плохо растворяетсЯг тогда используют воду с рН 7S.5, К растворуглобулина прибавляют равный объем насыщенного раствора серно кислого а;ммо шя и повторяют операдик описываемые выше После трех осажденш сыворотка обычно содержит очищенный глобулин. Растворенный глобулин диапиз1фуют при против физиологического раство ра, который часто меняют. Диализ продолжают до тех пор, пока внешний раствор, оставленный на 12 ч, не будет содержать следов сернокислого аммония (проба на сульфатные анионы с хлористы барием). Очищенные описанным образом сыворотки титруют. Титром сыворотки считают конечное разведение сыворотки, при котором еще происходит отчетливая реакция , антиген антитело. Для идентификации микроорганизмов д вида разводят сыворотку физиологически раствором 0,85%-ным раствором NaC до 3/4 ее титра, так как при этом буде исключаться возможность неспецифических реакций. Для обнаружения и идентификации микроорганизмов-вредителей используют серологическую реакцию агглютинации. Для постановки реакции агглютинации бе рут ряд стекол (по числу имеющихся сыBqpoTOK и на поверхность хорошо обезжиренного предметного стекла наносят 2 капли сыворотки и каплю физиологичес кого раствора. Затем в каплю физиологического раст вора (контроль антигена) и в одну из капель агглютинирующей сыворотки внося исследуемую бактериальную суспензию (антиген). Ко второй капле (контроль сы воротки) культура не добавляется. Внесенную суспензию тщательно перемешива ют, чтобы капля жидкости сделалась равномерно мутной. Реакция цротекает. при комнатной температуре, но лучше реакция протекает при подогреве до 37°С., Резул тат учитывают с помощью лупы или микроскопа через Ю мин. При положительной реакции в калле С сывороткой отмечается скучивание бактерий в виде зернышек или хлопьев, хорошо видимых при покачивайии стекла. Жидкость в контроле антигена должна быть равномерно мутной, а в контроле сыворотки прозрачной. Положительная реакция агглютинации свидетельствует о присутствии в исследуемых образцах определенных видов или групп микроорганизмов, соответствующих применяемым сывороткам. Использование предлагаемого способа идентификации микроорганизмов-вредителей пивоваренного производства обеспечивает по сравнению с известным способом значительное ускорение и упрощение видовой и родовой идентификации бактерий. Так, для видовой идентификации бактерий по культурально-морфологическим и физиологическим свойствам требуется -3 недели, а для вдентификации серологическим методом антиген-антитело ЗО-4О мин. Формула изобретения Способ идентификации микроорганизмоввредителей пивоваренного производства, предусматривающий посев исследуемого образца на селективную питательнуюсреду, культивирование микроорганизмов и их идентификацию, отличающийс я тем, что, с целью интенсификации и упрощения процесса, после культивирования микроорганизмь отделяют от питательной среды центрифугированием, промь1вают 0,85%-ным раствором хлористого натрия и разводят их до концентрации 1-2 млрд, микробных тел в 1 мл, а идентификацию проводят путем внесения про- , бы раствора в набор иммунных сывороток, полученных иммунизацией животных штаммами микроорганизмов-вредителей и по реакции агглютинации судят о виде или группе микроорганизмов, причем перед иммунизацией сыворотки инактивируют при 56-60 С 4О-45 мин и выделяют из них глобулиновую фракцию путем обработки их насыщенным раствором сернокислого аммония, а перед идентификацией сыворотки разводят О,85%-1 ым раствором хлористого натрия до 3/4 их титра. Источники информации, принятые во Внимание при экспертизе 1. Жвирблянская А. Ю., Бакушинская О. А. Микробиология в пищевой промыщленноси, М., 1975, с. 147-161.