Сополимер 3-0-[4-0-( @ -D-маннопиранозил)- @ -L-рамнопиранозил- @ -АЛЛИЛ-D-ГАЛАКТОПИРАНОЗИДА С АКРИЛАМИДОМ,ОБЛАДАЮЩИЙ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ 0-ФАКТОРА 3 БАКТЕРИЙ РОДА САЛЬМОНЕЛЛА,ОТНОСЯЩИХСЯ К СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЕ Е Советский патент 1982 года по МПК C08F216/12 C08F220/56 

форме fi-аллилгликозида) , имеющий химическую структуру 0-фактора 3 специфических полисахаридов Сальм нелла, и осуществлена его радикал ная сополимеризация с акриламидом в воде. Синтез трисахаридного мономера осуществлен по следующей схеме СНгОНCHjOK НО/И оШгСН сН2 р/-йОСНгС снг Гон) ) VY dHjTVr (1) онCHj OR (Иаж-н , 1П5) R-СНзСО, СНгОСОСНзСНоОСОСК ш j-o осн. %сооДоснгШ сн, - Ш1 )(-5 Кон OCOCHj (IV) СНгОСОСГК, .0.,-о I /г I |(ососн5 оа)снэ сн CHjCooV-H Vr . .j ососнэ в. осн, 1гЧ (vra) -.CHjCO (VIS) К--Н Ключевой стадией синтеза трисахар него мономера является гликозилирование 2,4,б-три-0-ацетил-р -аллил -Б-галактопиранозида (1У) с помощь пер-0 ацетилбиозилбромида (V) , полученного из 1,2,3,-три-О-ацетил -4-0-(2 , 3,4,6-тетра-0-ацетил-р)-1 -маннопиранозил) -ТЗ-Ь-рамнопиранозы синтез которой проводится по О1ЩГ санной методике 2 . Синтез. (IVX включает следующие стадии. Конденс ция е(-ацетобромгалактозы с аллиловым спиртом в присутствии окиси се ребра в сухом хлороформе с последу щим омылением О-ацетильных групп приводит к Ь-аллил-ТЬгалактопирано |3иду (1). При ацетонировании (1) в присутствии безводного сульфата меди получается 3,4-0-изопропилиде -р -аллил-1)-галактопиранозид (На) наряду с 4,6-изомером.. (На) ацети лированием переводится в 2,6-ди-0-ацетил-3,4 ,0-изопропйлиден-)-аллил-1)-галактопиранозид (116) , который в условиях гидролиза разба ленной уксусной кислотой превращается в 2 ,6-ди-0-aцeтил-| -aллил-IЗ-гaлaктoпиpaнoзид (111). Реакцие с триэтилортоацетатс в присутстви п-толуолсульфокислоты (111) превращают в 3,4-0-этилортоацетат, который i6e3 выделения гидролизуют 80%ной уксусной кислотой, в результате чего получают 2 , 4,6-три-О-ацетил-у -аллил-1)-галактопиранозид (IV). Положение свободной гидроксильной группы в (1Y) доказано методом метилирования и данными спектроскопии ЯМР- °С. При гликозилировании (IV) в ацетонитриле в присутствии цианида ртути пер-0-ацетилбиозилбромидом (У) из реакционной смеси выделяют кристаллический 2,4,б-три-0-ацетил3-О-1 4-0 (2 , 3, 4 ,б-тетра-0-ацетил-р-Щ-маннопиранозил)-2,3-ди-О-ацетил-о.-Ь-рамнопиранози 13-р-аллил-Ю-галактопиранозид (vi), при омылеНИИ которого метилатом натрия в метаноле получают трисахаридный мономер -3-0-Г4-0 ( -{о- Э-маннопиранозил) -с -Ь-рамнопиранозил1 - } -аллил-1)-гала.ктопиранозид (VIб) . Строение мономера (Via) следуе т из .данных моно-сахаридного анализа и анализа спектра ЯМР- C соединения (VI6) с привлечением литературных данных. Сополимеризация полученного трисахаридного монсмера с акриламидом в воде в присутствии персульфата аммония и тетраметилэтилендиамина приводит к сополимеру приведенной выше формулы, для выделения которого из реакционной смеси использована гель-фильтрация на сефадексе д-100. При гельфильтрации на сефадексах д-50, И на сефароз.е 2В сополимер Также выходит с колонки с холостым объемом,что указывает на принципиальное отличие сополимера в свойствах от полисахаридов и белков. Сополимер содержит 34% углеводов ,и является водорастворимым. Из данных спектроскопии ЯМР- С следует, что олигосахаридный фрагмент включается в сополимер без нарушения структуры и соотнощение углеводного и неуглеводного мономеров в сополимере составляет 1:13. Сополимер достаточно гомогенен, его молекулярный вес колеблется от 160.000 до 235.000 (данные аналитического ультрацентрифугирования 0,5 и 0,7%ных водных растворов сополимера ripH 35,000 об/мин). Молеку.лярный вес сополимера (т.е. ц в общей формуле) можно регулировать, изменяя концентрацию инициатора полимеризации (персульфата аммония) в реакционной смеси .-Однако установлено, что изменения в молекулярном весе не влияют на серологическую активность Полученных препаратов. Получение промежуточных соединений и сополимера трисахаридного мономера с акриламидом осуществлено по следующим методикагЛ. Пример 1. / -Аллил-и-галакт пиранозид (I). 35 мл аллилового спи та, перегнанного над окисью кальци перемешивают 1 ч с 66 г безводного сульфата кальция и 18 г окиси сереб ра в 60 мл сухого хлороформа, зашитая от влаги воздуха. Затем по ка лям добавляют раствор 24,6 rot-ацет бромгалактозы в 60 мл сухого хлороформа и перемешивают еще 2,5 ч. Реа ционную смесь фильтруют через слой активированного угля, осадок промы вают спиртом, объединенный фильтрат упаривают со спиртом и водой для удаления избытка аллилового спирта Полученный при упаривании остаток хроматографируют. на колонке со 100 г силикагеля, вымывая градиентом ацетона в хлороформе (от О до 2% по объему), выделяют 21,7 г 2,3,4,6-тетра-0-ацетил- Ь-аллил-1)-гала1{топиранозида, сироп, /ot/p° 13,75 (с 2, хлороформ), R О,5 (хлороформ-ацетон, 97:3). Полученное вещество растворяют в 150 мл метанола и омыляют 10 мл 1 н, метилата натрия (20, 24 ч), затем смесь нейтрализуют катионитом КУ-2 (Н) и упаривают. Остаток хроматог рафируют на 500 г силикагеля при элюировании градиентом спирта в хло роформе (от 1 до 40%), выделяют 8,9 г (I), выход 67,7%. После перекристаллизации из ацетона при добавлении пентана (или абсолютного эфира) получают 7,1 г (1), т.пл. 101-102С, /cL/%°ll° (с 2, вода). Найдено,%: С 48,72; Н 7,19. Og. Вычислено,%: С 49,08; Н 7,32. Пример 2.3,4-0-изопропили ден-р-аллил-1)-галактопиранозид (На).. .... 1,5 г |Ь-аллил-1)-галактопиранози да перемешивают 24 ч с 6 г безводного сульфата меди и 2-3 мг П-толуолсульфокислоты в 75 мл абсолютного ацетона. Отфильтровывают осадок, фильтрат нейтрализуют несколь кими каплями триэтиламина и упаривают в вакууме. Полученный остаток по данным тонкослойной хроматографии .на силикагеле в смеси бензолацетон 45:55,содержит два компонен главный с R 0,45 и минорный Rf 0,25. При хроматографировании этой смеси на колонке со 100 г силикаге ля при элюировании градиентом смес ацетона в бензоле (от 1 до 60%) вы деляют 1,33 г (На) и 0,31 г второ го изомера. (Г1а) ,выход 75%,т..пл. 91-92 с (абс. ацетон-петролейный эфир) . d.+ 10,3° (с 2,04, хлороформ). Найдено, %: С 55,12; Н 7,68. , вычислено,%: С 55,37; Н 7,75. Пример 3. 2,6-Ди-О-ацетил-3,4,-О-изопропилиден- -аллил-D-галактопиранозид (Иб). 1,61 г 3,4-изопропилиден-р-аллил-1)-галактопиранозида растворяют в 10 мл сухого пиридина и добавляют 5 мл уксусного ангидрида, смесь выдерживают 24 ч при 20 С, после чего упаривают с толуолом и гептаном, получают 2,13 г (116) выход количественный, т.пл.61,563°С (абс. спирт-Петр.эфир) . |а(./-р 24° (с 2, хлороформ). Спектр ПМР (в четыреххлористом углероде), (Гм.д.: 1,31 (синглет, ЗН, СН,.) , 1,54 (синглет ЗН, СН), 2,05 (синглет 6Н, СНзСО), 5,84 (мультиплет, lH,-OCH.) . Найдено,%: С 55,87; Н 6,94. Вычислено,%: С 55,80; Н 7,03. Пример 4. 2,6-Ди-О-ацетил-р-аллил-ЗЗ-галактопиранозид (11 Г) . 1,43 г 2,6-ди-О-ацетил 3,4-0-йзо пропилиден-)аллил-В-галактопиранозида растворяют в 16 МЛ уксусной кислоты и добавляют 8 мл воды, смесь нагревают 35 мин при 95-100 С и упаривают в вакууме, остаток многократно упаривают с толуолом для удаления следов уксусной кислоты. По данным тех в смеси бензол-ацетон 5:5 остаток наряду с основным компонентом с Rf 0,34 содержит менее подвижную примесь с R.f 0,1. Смесь хроматографируют на колонке с 100 г силикагеля при элюировании градиентом ацетона в хлороформе (от О до 35%), выделяют 1,26 г (111), выход 95%, т.пл. 75-76, (абс.эфлрпетр.. эфир). L -9,5° (с 2, хлоре-, форм). Спектр ПМР (в дейтерохлороформе) , (f м.д: 2,10 и 2,13 (2 синглета, 2 X ЗН, ) 5,85 (мультиплет, 1Н,-OCH.2.CH-CH,i) . Найдено,%: С 51,09; Н 6,74; c 3«ioOg- Вычислеио,%: С51,31; Н 6,63. Пример 5. 2,4,6-Три-О-ацетил-р)-аллил-р-галактопиранозид , 1,5 г 2,6-гДИ-0-ацетил- %-аллил-р-галактопиранозида кипятят с 5 мл триэтилортоацетата в 7 мл нитрометана в присутствии 2-3 мл П-толуолсульфокислоты. Через 10 ч реакционную смесь охлаждают, добавляют 0,3 мл триэтиламина, разбавляют 30 мл хлороформа и выливают в воду со льдом, после чего экстрагируют хлороформом ( мл). Объединенный экстракт упаривают к с5статку, содержащему в основном 2,6-ди-О-ацетил-3,4-0-этилopтoaцeтил-p -aллил-D-гaлaктoпиpaнoзид с Rf 0,5 (тех в системе бензол-ацетон, 8:2), добавляоот 25 мл 80%-ной уксусной кислоты и выдерживают 40 мин при

комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают, остаток несколько раз упаривают с толуолом для удаления следов уксусной кислоты и затем хроматографируют на колонке с 200 г силикагеля при элюировании градиентом ацетона в хлороформе (от О до 15%), выделяют 1,35 г (IV), выхо 79%, т.пл. 81-83 С, М/; -12,5 (с 2,19, хлороформ). Спектр ПМР (в дейтерохлороформе) , tf м.д. : 2,07, 2,12 и 2,17 (3 синглета, ЗхЗН, CHjCO),

Найдено, %: С 51,79; Н 6,25, .

Ч 2-2Р9Вычислено,%: С 52,02; Н 6,40.

Пример 6. 3-0-C4-0-( -мaннoпиpaнoзил) -с -Ь-рамнопиранозил -|Ь-аллил-1)-галактопиранозид (У1б) .

а)Раствор 950 мг (1,53 ммоль) 1,2, 3-три-0-ацетил-4-0-(2 ,3,4,6-тетра 0-ацетил-р1-1)-маннопиранозил) -о1.-Ь-рамнопиранозы (2) в 150 мл абсолютного дихлорметана охлаждают до О С и смешивают с растворен

10,5 1ЛЛ бромистого ацетила и 2,55 м во,цы в 15 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 0,7 мл уксусного ангидрида. Смесь выдерживают 3 ч при ОС затем выливают в воду со льдом, органический слой промывают холодным раствором бикарбоната натрия (2-50 мл), холодной водой (2 50 мл) ,. быстро сушат безводным сульфатом магния и упаривают, полученны остаток пер-0-ацетилбиозилбромида (У) 2 ч высушивают в вакууме над твердой натриевой щелочью и сразу используют для гЛикозилирования.

б)530 мг (1,53 ммоль) 2,4,6-три-О-ацетил- -аллил-Б-галактопиранозида перемешивают с описанным вЕлше пер-0- ацетилбиозилбромидом

(V) в 10 мл абс.ацетонитрила в присутствии 385 мг (1,53 ммоль) цианида ртути, через 12 ч реакционную смесь упаривают, остаток экстрагируют хлороформом, Экстракт промываю 1 Н, раствором йодистого калия, содержащим 1% бикарбоната натрия (250 мл), водой (2-50 мл), сушат безводным .сульфатом магния и упаривают, Из полученного остатка, имею1цего сложную хроматографическую картину (данные ТСХ в системе хлороформ - ацетон 87:13), хроматографией на колонке с 100 г силикагеля в градиенте смеси ацетона в хлороформе (от О до 11%) выделяют фракцию, обогащенную продуктом конденсации с RJ 0,42. При концентрации этой фракции и добавлении спирта осаждается 350 мг кристаллов 2,4,6-три-0-ацетил-3-0- 4-0-(2,3,4,6тотра-О-ацетил-р-Э-маннсииранозил) -2 , З-ди-О-лцетил-с -Ь-рамнопираноэилЗ-р лпил-В-галактопиранозида

(via), выход 25,4%, т.пл. 201-203С (спирт) ,/ei/- o -18,4° (с 1,47, хлороформ), Спектр ПМР (в дейтерохлороформе) , (f м . д. : 1,31 (дублет с 5 Гц, С-СН остатка рамнозы) Г 2 ,03-2 ,2Cl (мультиплет, 27 Н, СН5,СО) , 5,82 (мультиплет, 1Н-, ОСН2.) .

Найдено,%: С 52,03; Н 6,38.

С 9 54°24. Вычислено,%: С 51,65; Н 6,00.

330 мл соединения (Via) растворяйт Б 300 мл 3%-ного раствора триэтиламина . в метаноле и выдерживают 16 ч при комнатной температуре, затем смесь упаривают, полученный остаток упаривают с абс.метанолом (7 2О мл), и высушивают в вакууме, после чего суспендируют в 50 мл абс. метанола и добавляют 3 мл 1 Н. метилата натрия в метаноле. Полученную смесь перемешивают 12 ч при 20 С, затем нейтрализуют катионитом КУ-2 (Н ), упаривают и с количественным выходим выделяют (VI6), кристаллизующийся при добавлении . спирта,.тсПЛ. 232-235 С (водный спирт) . ,5° (с 1,7, вода), вещество однородно по данным хроматографии на бумаге в системе бутанол-пиридин-вода, 6;4i:3, R галактоза -1,

Найдено,%; С 48,27; Н 7,09, Ci-,

Вычислено,%: С 47,72; Н 6,86.

Пример 7. Сополимер 3-0-4 0- (fb-D-маннрпиранозил) -с1-Ь-рамнопиранозил - р-аллил-Б-галактопиранозида с акриламидом. Раствор 70 мл трисахаридного мономера (VI6)и 35 м акриламида в 0,7 мл дистиллированной воды деаэрируют в вакууме водоструйного .насоса в течение 30 мин затем в смесь добавляют 2 мл тетраметилэтилендиамина и 1 мг персульфата аммония. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре, затем разбавляют 0,2 М/0,1 м пиридин-ацетатным буфером (1 мл) и наносят на колонку (2-35 см) с сефадексом (-100 и элюируют пиридинацетатным буфером со скоростью 14 мл/ч, собирая фракции по 3,5 мл. Фракции 16-25, содержащие сополимеры,объединяют и упаривают, остаток упаривают с водой (10-5 мл) и лиофилизуюх из раствора в 1 мл воды. После высушивания в вакууме над фосфорным ангидридом получают 55,8 мг сополимера указанной выше формулы )° 16,5 (с 1, вода).

В гидролизате сополимера (2 н соляная кислота, 100 С, 4 ч) с помощью а.нализатора углеводов Техникой (США) обнаружены рамноза, манноза и галактоза в соотношении is 1:1. Суммарное содержание

углеводов в сополимере 33,6% (результаты аЕ1ализа гидролизата на анализаторе Техникой). По данным аналитического ультрацентрифугирования препарат сополимера имеет коэффициент седиментации ,вОАа 3,95 у молекулярный вес оценивается в 160.000 дальтон. С приведенной выше общей формулой полностью согласуются данные спектра ЯМР- С позволяющие установить соотношение обоих мономеров (трисахаридного мономера и акриламида) в сополимере, равное 1:13.

Обнаружено, что полученные препараты сополимера трисахаридного мономера с акриламидом указанной общей формулы имеют серологическую специфичность 0-фактора 3 бактерий рода Сальмонелла и обладают существенно большей чувствительностью в двух иммунологических реакциях (двойная радиальная иммунодиффуэия по Ухтерлони; реакция ингибирования пассивной гемагглютинации) в сравнении с липополисахаридами Сальмонелла, относящимися к серологической группе Е. Появление этих свойст (в частности, монофакторной серологической специфичности) связано с включением в сополимер не моносахаридного мономера, как это имеет место в случае аналогов по структуре, а трисахаридного мономера, обладающего химическим строением 0-фактора 3 специфических полисахаридов бактерий рода Сальмонелла группы Е.

Полученный препарат изучен в дву иммунологических реакциях, используемых в практике научных исследований: двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони (в микроварианте) - реакция 1; реакция ингибирования пассивной гемагглютинации (в микроварианте) - реакция 2.

В реакции 1 при взаимодействии с монофакторной сывороткой анти-4 сополимер не давал полос преципитации, в то время, как при взаимодействии с иммунными сыворотками анти-3,10 и анти-3,15 были зафиксированы четкие и гомогенные дуги преципитации, что подтверждает наличие монофакторной специфичности3 в сополимере. В контрольной реакции проверяли липополисахариды группы Е - липополисахарид Сальмонелла ньюингтон (О - факторы 3 и 15) и липополисахарид Сальмонелла анатум (0-факторы 3 и 10), исходные концентрации препаратов составляли 1,8 мг/мл. При взаимодействии с сыворотками анти-3,10 и анти-3,15 сополимер давал дуги преципитации до разведения 1:1024 (т.е. до концентрации 0,035 мкг/0,02 мл), в

то время как для липополисахаридов Сальмонелла анатум и Сальмонелла ньюингтон видимые дуги преципитации обнаруживались до разведения 1:16 и 1;8 соответственно (конечные концентрации 2,25 мкг/0,02 мл и

4,5 мкг/0,02 мл), причем наблюдалась некоторая гетерогенность полос преципитации, что свидетельствует

0меньшей специфичности препаратов 0 липополисахаридов. Таким образом,

в реак.ции 1 синтетический сополимер оказался примерно на 2 пор5щка более чувствительным,чем липополисахариды Сальмонелла группы Е, являющиеся

5 аналогами по свойствам к предлагаемому соединению.

В реакции 2 липополисахарид Сальмонелла анатум ингибировал 1 гемагглютинирующую единицу сыворотQ ки анти-3,10 при концентрации

0,005 мкг/0,05 мл, а сополимер при концентрации 0,0006 мкг/0,05 мл. При использовании сыворотки анти3,15 в случае липополисахарида Сальr монелла анатум для ингибирования

1гемагглютинирующей .единицы необходима концентрация 0,0025 мкг/ 0,05 мл, а в случае препарата сополимера - 0,00015 мкг/0,05 мл.

Таким образом, использование изобретения позволяет, повысить чувствительность препаратов, используемых в иммунологических исследованиях при изучении антигенной структуры бактерий рода Сальмонелла, а 5 также иметь контрольный препарат, обладающий только серологической специфичностью фактора 3 (групповая специфичность Е).

Формула изобретения

Сополимер. 3-0- t4-0- (|Ъ-3)-маннопиранозил) -cL- Ь-рамнопиранозил - -ал45 лил-В-галактопиранозида с акриламидом формулы

/TOHjCONJIt

i ICHj-CHtjc-CHf CH-f СЛгЛн)у -ц СНг

.ад

щт.HO/--QO

..

HOvH vr он55НО ОН

где , ii fnp-i6D j

обладающий серологической специфичностью 0-фактора 3 бактерий рода 60 Сальмонелл,а, относящихся к серологической группе Е.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. V., SiTOiek P., Koceu65 rek I., Studies on Lectins.XXXV.

1187997012

Woter-soluble o-glycosyl .polyacry-Klimov E.M., Bayramova N.E.i, Torlamide derivatives for specific; gov V.I., Synthesis of 0- p-Dprecipitation of lectins , Biochi--mannopyrano6yI-4-0-ol-L-rhamK:)pyramica e Biophysica Acta, v. 538,nosyP-3-D-gaIactopyranose, the

2, 1978, p. 293-298.trisaccharide repeating unit of the

2. Koehetkov N.K., Dmitriev B.A.,Salmonella anatum, CarbohydTate

MjilyBheva N.N., Chernyak A. J.a,Reseach, № 45, 1975, p. 283-290.

5o-specific polysaccharide from