Способ получения препарата иммобилизованного субтилизина Советский патент 1982 года по МПК C08F289/00 C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОГО

I

Иэофетение относится к обпастн химин пога1м юв, а именно к способу попуп чения препарата, вммобилкзованного субтипиэина.

Препарат иммобилизованного субтилизина используют в мед1шине при лечении гнойшлх ран.

Известен способ получения препарата икшобипизованного субтилизнна путем ковалентной иммобилизации субтилИдина на природном полимере til

Для этого к 1ОО мг диазотированного аминоарильного производного крахма ла, суспензированного в 4 мл О,1 М фосфатного буфера (рН 7,8), медленно .прибавляют 3 мл О,5%-нсво раствора субтилизина в том же буфере. Реакцию проводят при п емваив;ании в течение 1в ч при 4 С. Для отделения неиммобипизованного белка нерастворимый препарат отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают раствором КС , а затем оистиллированной водой. Полученные препараСУБТИЛИЗИНА

ты содержат 1-1,5 мг фермента на грамм носителя.

Недостатками этого способа являются сложная технология, невыюкое содерн ание субтилизина в препарате, а также то, что смола на основе крахмала не является пленкообразующей и биоразлагаемой.

Известен способ получения препарата иммобилизованного субтилизина путем ковалентной иммобилизации субтипизина

to на карбоксиметилцеллюлозе Г2 .

Для этого гидразид кислоты, полученной из нерастворимой карбсжсимегшщеплюпозы, содержащей 3,2 миллиэквивалента карбоксильных групп на грамм препаISрата, суспензируют в 0,5 N НС2, а затем к суспензии по каплям при интенсивном перемеишвании добавляют 5%-ный водный раствор NqNOf npH . По прошествии 20 мин реакцию заканчивают,

промывая целлюлозный порошок на фялътре холодной дистиллированной водой. Полученный активированный носитель сразу помешают в 1%-ный раствор субтилизина при рН 8,5. Реакнию проводят в течение 2 ч при перемешивании. Препарат иммобилизованного субтипизина промывают на фильтре раствором NOW и дистиллированной водой. Препарат содержит 60 мг субтилизина на грамм носителя. Недостатками этого способа являются сложная технология, невысокое содержание субтилизина, а также то, что используемый носитель не является плёнкообразующим и биоразлагаемым. I. Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам (базовый объект) является способ получения препарата иммобилизованного субтилизина путедл ковалентной иммобилизации субтилизина на природном полимере диэтиламиноэтилсефадексе t3 . -ДЭАЭ-сефадекс, предварительно активированный бромцианом, помещают в 1%-ный раствор субтилизина при ,рН 10,0 Реакцию проводят в течение 20 час при 4 С и постоянном перемешивании. Полученный продукт промывают IMNqCC, 0,1М НаНСО и дистиллированной водой. Препарат иммобилизованного субтили&ина содержит 23 мг фермента на грамм носителя. Недостатками этого способа являются сложная технология, включающая использование токсичного бромциана, невысокое содержание субтилизина в препарате и то что ДЭАЭ-целлюлоза не является пленкообразующей и биоразлагаемой. Целью изобретения является получени биоразлагаемого пленкообразующего препарата, повышение содержания субтилизина в препарате и упрощение технологии процесса. Цель достигается тем, что в способе получения препарата иммобилизованного .субтипизина путем ковалентной иммобилизации субтилизина на природном полимере О,О2-5%-ный водный раствор субтилизина смешивают с О,5-2,5%-ным . водным раствором коллагена в объемном отношении 0,25-20, воду удаляют испарением при 17-25° С, и полученную плен ку обрабатывают 1-10%-ным водным раствором глутаровогб альдегида в течение 30-60 с при рН 7-8 и 17-25°С. Перед использованием для удаления низкомолекулярных примесей раствор кол лагена отдиализовывают против дистилли рованной воды. Пример 1. 2,5%-ный раствор коллагена, предварительно отдиализованный против дистилл1фованноЙ воды, смешивают с О,0.2%-ным водным раствором субтилизина, шт. 72, в объемном соотношении, равном 0,25. Полученный раствор переносят в кювету из плексиглаза и сушат при в течение 2 дней. Высушенную пленку, содержащую субтилизин, погружают в 1%-ный раствор глутарового альдегида в фосфатном буфере (рН В,О) на 30 с при . Пленку от-. мывают от избытка глутарового альдегида дистиллированной водой. Полученный препарат иммобилизованного субтилизина содержит 1О мг фермента на 1 г коогшагена. Иммобилизованный субтилизин хранят в сухом виде при 4° С. П р и м е р«2. 0,5%-ный раствор коллагена, предварительно отдиализованный против дистиллированной воды, смешивают с 0,32%-ным раствором субтилизина, шт. 72, в объемном соотношении, равном 2О. Полученный раствор переносят в кювету из. плексиглаза и сушат при 17° С в течение 5 дней. Высушенную пленку, содержащую субтилизин, погружают в 10%-ный раствор глутарового альдегида в фосфатном буфере (рН 7,0) на 6О с при . Пленку отмывают от глутарового альдегида дистиллированной водой. Получен1и.1Й препарат иммобилизованного субтилизина содержит 12 мг активного фермента на 1 г коллагена. Иммобилизованный субтилизин хранят в сухом виде при 4°С. П р и м е р 3. 0,6%-ный раствор коллагена, предварительно отдиализованный против дистиллированной воды, смешивают с водным раствором субтили-, зина, шт. 72, в объемном соотношении, равном 4. Полученный раствор переносят в кювету из плексвглаза и сушат при 20®С в течение 3 Ш1ей. Высушенную пленку, содержащую субтипизин, погрузка ют в 10%-ный раствор глутарового аль дегида в фосфатном буфере (рН 7,8) на 30 с при . Пленку отмывают от избытка глутарового альдегида дистиллированной водой. Полученный препарат им мобилизованного субтшшзина содержит 34О мг активного фе(де1гга на 1 г коллагена. Иммобилизованный субтилизин хранят в сухом виде при Полученные препараты иммобилизованного субтилизина используют при лечегНИИ плоскостных кожно-мышечных гнойных ран в межлопаточной области кроликов. Все препараты полностью растворяются в течение одних суток, уменьшая время очищения и заживления раны. Таким образом п, оведение процесса по способу изобретения позволяет ynpocxv тить технологию получения препарата иммобилизованного субтилизина, повысить содержание субтилнзина в прш1аратв к получать биоразпагаемые ппенхообрвзукх ише препараты. Формулаизобретенйя Способ получения Препарата иммобилизованного субтилизина путем ковалеит ной иммобилизации субтилизина на природном полимере, отличающийс я тем, что, с целью получения биоразлагаемого пленкообразующего пр 1арата, повыщения содержания субтилизина в пре парату и упрощения технологии процесса, О,02-5,О%-ный ВОШ1ЫЙ раствор субтилизина смешивают с 0,5-2,5%-ным водным раствором коллагена в объемном соотношении 0,25-20, воду удаляют испарекием при 17-25°С и полученную пленку обработывакуг водным раствором глутарового альдегида в тенённе 30-60 с при рН 7-8 и 17-25 С. Источники информашш, прин51тые во вннмавве прн экспертизе/ KL.Goldstein and others.Water insbluble enzymes. Synthesis of a new cacrier and Us utilization for preparation of insoluble derivatives of papaln, trypsin and subttlopeptldase A, Biochemistry, 1970, 9, 2322233.. 2.W.Bruffiroer and,orhers,Preparat Ipn and properties of carrier-bond enzymes, Eur.J. Blochee., 1972, 25, 129135. 3. E. Svenssoo, Preparation and enzymatic properties of subtMlsIn Novo chemically attached to soluble DEAE-dextran and Insoluble DEAE-sephadex, Biochem. Btophys. Acta, 1978, «92, .