IV .Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве ферментных првпаратов глюкоамилазы на основе глу . бинного спосйба культивирования,
Известны способы получения фермен тов., позволяющие интенсифицировать процесс культивирования продуцентов путем дробной подачи питательных веществ.
При получении цефалоспорина культ турой Streptomyces clavuligerus установлено, что аммонийный азот усиливает рост микроорганизма, но ингиби ует антибиотикообразование l. Ингибирующее действие солей аммония на образование антибиотика сказывается лишь при добавлении их к средам в начале ферментации или через 2А ч, а более позднее добавление не сказывается на продуцирующую способность микроорганизма, т.е. соЛИ аммония не связаны непосредствен но с механизмом биосинтеза.
Известен способ получения глюкоамилазы при глубинном культивировании продуцентов из рода Asperg i BEus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и стимуляторы биосинтеза ферментов, где предусматривается добавление э процессе роста продуцента
10 аммонийного азота в виде газообразного или водного раствора аммиака, количество которого регулируется поддержанием величины рН культуральной жидкости в пределах 5)510,2. При
15 этом конечная активность в культуральной жидкости повышается на BQ% по сравнени|р с подачей аммонийного азота в виде (МН4.)(НР04. в количестве 1,0% непосредственно в питательную
20 .среду перед началом культивирования t2. Недостатки известного способа заключаются в том, что основное воздей3 91 ствие аммонийного азота на культуру осуществляется только в стадии актив ного роста культурыJ не учитываются оптимальные концентрации азога на разных стадиях роста и развития продуцента) не обеспечивается оптимальное соотношение углерода и азота в начальном периоде образования биомассы{ не создаются условия для максимального накопления глюкоамилазы в конце культивирования. Цель изобретения - увеличение выхода и активности глюкоамилазы и сокращение срока культивирования продуцента. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения глюкоамилазы, предусматривающему глубинное культивирование продуцентов и рода AspergiFtus на питательной ереде, содержащей источник углерода, ис точник аммонийного азота, минеральны соли и стимуляторы биосинтеза фермам тов, в процессе культивирования концентрацию аммонийного азота в сре де изменяют постадийно: источник аммонийного азота вводят в количестве 0,1-0, г/л на стадии экспоненциального роста культуры до начали активного синтеза глюкоамилазы, в период активного синтеза фермента концентра цию аммонийного азота увеличивает до 0,25-1,0 г/л, а по окончании синтеза фермента до начала автолиза культуры снижают до 0,,5 г/л пу тем разбавления культуральной жидкое ти стерильной водой. В качестве источника аммонийного азота используют двузамещенный фосфорнокислый аммоний или трехзамещенный фосфорнокислый аммоний, или гидро окись аммония, или аммониевые соли молочной или лимонной кислот, или аммонийные поликарбоновые кислоты,которые вводят в культуральную жидкость в виде стерильных растворов. Способ осуществляется следующим образом. Готовят питательную среду, содержащую,: кукурузная мука 7, кукурузный крахмал 5, БВК 2,0 и (NN4) «i НР04 0,05-0,2. После стерилизации и охлаждения среду, в которой содержится 0,1-0, г/л аммонийного азота, засееают посевн1 1м материалом грибов из рода AspergiiFus. После 2k ч культивйрования в культуральную жидкость вводят источники аммонийного азота в виде стерильного раствора в количест 4 вах, обеспечивающих концентрацию аммонийного азота на стадии активного биосинтеза, в пределах 0,25 1,0 г/л. После 60-90 ч культивирования к культуральной жидкости добавляют 20-301 стерильной воды, снижая таким образом концентрацию аммонийного азота в среде до 0,05-0,5 г/л. Культивирование продолжают до макси.мальиого накопления .тлюкоамилазной акг i тивности (72-110 ч pocta). Пример 1 (контроль). В биолафит емкостью 50 л загружают при коэффициенте заполнения 0,5 питательную среду с оптимальными соотношением компонентовД: мука кукурузная 7, крахмал кукурузный 5 БВК 2,0, (NH),HPO 0,1. После стерилизации и охлаждения среды, в которой содержится 0,2 г/л аммонийного азота,производят засев посевйым материалом гриба Aspergl BEus nlger Т-ЗЗ- Культи - вирорание продуцента глюкоамилазы сэсуществляют в течение ч с подачей раствора аммиака(NH40H) до поддер- жания рН в процессе культивирования на уровне 5,5i 0,2. Активность глю- ; коамилазы в конце культивирования составляет 80 ед/мл. П р и м е р 2. Подготовку и за-.) сев питательной среды осуществляют как в примере 1, но начальная концентрация аммонийного азота в среде составляет 0,1 г/л за счет добавления 0,5% ()oPO. В качестве продуцентй используют посевной материал Aspergi Eus awamori-122. После 2k ч культивирования в культуральную жидкость вводят стерильный раствор C4H50HNH4 в количестве, поддерживающем концентрацию аммонийного азота в пределах 0,25 /л до 60 ч роста, затем в культуральную жидкость добавляют 20 стерильной воды до содержания аммонийного ; азота 0,05 г/л и культивирование продолжают до 72 ч роста. Конечная активность в культуральной жидкости 126 ед/мл. Пример 3- Подготовку и засев питательной среды проводят аналогично примеру 2 за исключением начальной концентрации аммонийного азота в среде , которая составляет 0,k г/л за счет добавления 0,2% (j JtiWQ. После 2k ч культивирования,когда концентрация аммонийного азота снижается до 0,2 г/л, в культуральную жидкость добавляют стерильный раствор С НфОуМН в количестве, обеспечивающем содержание аммонийного азота 0,6 г/л. После 60 ч культивирования в культуральную жидкость добавляют 30 стерильной воды и культивировани продолжают до 90 ч роста. Конечная активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет 138 ед/м Таким образом, предложенный способ получения глюкоамилазы позволяет сократить срок выращивания продуцен тов глюкоам илазы на 30-бЭ ч за счет ускорения роста биомассы в начале процесса, повысить глюкоамилазную ак тивность в культуралвной жидкости на 17-58 ед/мл и, соответственно, ,выход целевого продукта на 8-29 усл.к за счет интенсификации накопления глюкоамилазы в период активного биосинтезаJ снизить удельный расход компонентов питательной среды в .1,2-1,3 раза за счет увеличения продуктивности процесса. Ожидаемый экономический эффект составляет ,55 тыс. руб. Формула изобретения 1. Способ получения глюкоамилазы путем глубинного культивирования прю дуцентов из рода AspergiBBus на пита тельной среде, содержащей источник у лерода, источник аммонийного азота, минеральные соЛи и .стимуляторы биоси теза ферментов, отличающийс я тем, что, с целью увеличения выхода и активности глюкоамилазы и сокращения срока культивирования про дуцента, в процессе культивирования концентрацию аммонийного азота в среде изменяют постадийно: источник аммонийного азота вводят в количестве О, 1-0, А г/л на стадии экспоненциального роста культуры до начала активного синтеза глюкоамилазы, в период активного синтеза фермента концентрацию аммонийного азота увеличивают до 0,25-1 г/л, а по окончании синтеза фермента до начала автолиза культуры снижают до 0,,5 Г/ путем разбавления культуральной жидкости стерильной водой. 2. Способ по п. 1, о т л и.ч а ющ и и с я тем, что в качестве источника аммонийного азота используют двузамещенный фосфорнокислый аммоний или трехзамещенный фосфорнокислый аммоний, или гидроокись аммония, или аммониевые соли молочной или лимонной кислот, или аммонийные поликарбоновые кислоты, при этом в культуральную жидкость их вносят в виде стерильных растворов. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Canadian GournaB of Microbiology. 1979, 25, № 1, 61-67. г. Патент США № 3660236, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1972 (прототип) ,
