МОДУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛИ ПУТЕМ ОПОСРЕДОВАННОЙ БЕЛКАМИ ДОСТАВКИ O Российский патент 2020 года по МПК A61K38/16 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 62/134523, зарегистрированной 17 марта 2015 года, описание которой, таким образом, включено в качестве ссылки полностью для всех целей.

ПОДАЧА СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ASCII

[0002] В настоящий документ в качестве ссылки полностью включено содержание следующего поданного текстового файла ASCII: машиночитаемая форма (CRF) списка последовательностей (название файла: 627042000940SeqList.txt, данные записаны: 17 марта 2016 года, размер: 41 KB).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящая заявка относится к модуляции устойчивости опухоли посредством доставки кислорода в опухоль посредством полипептида белка-носителя O₂, например, белка H-NOX.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

[0004] Гипоксическое микроокружение опухоли подавляет противоопухолевый иммунитет хозяина, модулируя несколько путей передачи сигнала, включая в качестве неограничивающих примеров передачу сигнала посредством индуцируемого гипоксией фактора (HIF-1) (Codo et al., 2014 Oncotarget, 5(17), 7651-7662; Lee, Mace, & Repasky, 2010 Int. J. Hyperthermia, 26(3), 232-246; Wei et al., 2011 PLoS One, 6(1), e16195). Основные иммуномодулирующие гипоксию пути обобщенно приведены на фиг.1. В кратком изложении, представлено, что HIF-1: a) активирует пути аденозинэргического A2 и PD-L1, которые ингибируют привлечение и активацию хелперных и киллерных T-клеток и NK клеток, ключевых эффекторов противоопухолевого ответа (Noman et al., 2014 J. Exp. Med., 211(5), 781-790; Ohta et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 103(35), 13132-13137); b) привлекает и активирует ингибирующие регуляторные T-клетки (T_рег), ассоциированные с опухолями макрофаги (TAM) и другие происходящие из миелоидной ткани супрессорные клетки (MDSC) (Chaturvedi et al., 2014 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 111(20), E2120-2129; Corzo et al., 2010 J. Exp. Med., 207(11), 2439-2453; Wei et al., 2011); c) непосредственно ингибирует способность распознавания опухолевых клеток иммунной системой (Siemens et al., 2008 Cancer Res, 68(12), 4746-4753). Кроме того, зависимые и независимые от HIF-1 эпигенетические механизмы участвуют в ингибировании противоопухолевого иммунного ответа и усиливают рост опухоли, ангиогенез и метастазирование (Codo et al., 2014; Mimura et al., 2011 J. Pharmacol. Sci., 115(4), 453-458).

[0005] В моделях метастазирования опухолей на мышах показано, что непрерывная дополнительная оксигенация ингибирует рост опухоли и предотвращает избегание опухолью иммунного ответа посредством ингибирования пути аденозинэргического A2AR (рецептора аденозина A_2A), приводя к активации T- и NK клеток (Hatfield et al., 2015 Sci. Transl. Med., 7(277), 277ra230). Конкретно, непрерывная обработка 60% дыхательным кислородом мышей, несущих легочные метастазы MCA205, B16 или 4T1, приводила более чем к 2-кратному снижению количества метастатических очагов и увеличенному выживанию. Эти данные коррелировали со снижением опухолевой и лимфоцитарной гипоксии, увеличенной инфильтрации опухоли активированными CD8 T-клетками (CD8⁺ CD69⁺ CD44⁺), повышением уровня иммуностимулирующих цитокинов и хемокинов и зависели от передачи сигнала интактных A2AR. Одновременно показано, что респираторная гипероксия снижает количество и подавляет активность T_рег в легочном микроокружении опухоли (TME) вследствие сниженной экспрессии Foxp3, CD39/CD73 (производящие аденозин ферменты выше A2AR) и CTLA-4. Наконец, непрерывная респираторная гипероксия усиливала регресс опухолей, индуцируемый двойной блокадой CTLA-4/PD-1 опухолей легких.

[0006] Несмотря на убедительные преклинические данные, демонстрирующие способность оксигенации опухоли инвертировать иммуносупрессорное TME и ингибировать рост опухоли, клинические испытания у человека с дополнительной оксигенацией с использованием гипербарического или нормобарического кислорода продемонстрировали ограниченное действие (Overgaard, 2007 J. Clin. Oncol., 25(26), 4066-4074). Вероятно, это происходит вследствие неспособности растворимого кислорода к эффективной диффузии далее ≈80 мкм от кровеносных сосудов, что ограничивает его проникновение вглубь гипоксической опухолевой ткани. Таким образом, существует необходимость в средствах доставки кислорода, которые проникают в опухоли пациентов, транспортируя кислород за пределы обычной диффузии, и, таким образом, оксигенируя гипоксическое микроокружения, препятствуя иммуносупрессорным путям. Это приведет к максимальной стимуляции противоопухолевого иммунного ответа, как отдельно, так и в комбинации с другими ингибиторами контрольных точек иммунного ответа и другими способами иммунотерапии злокачественных опухолей.

[0007] Белки H-NOX (названные по домену, связывающему гем с оксидом азота и кислородом) являются представителями высококонсервативного, хорошо охарактеризованного семейства гемсодержащих белков (Iyer, LM et al. (2003) BMC Genomics 4(1):5; Karow, DS et al. (2004) Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, EM et al. (2005) Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, EM et al. (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, EM et al. (2005) J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902; Cary, SP et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(37):13064-9; Karow DS et al. (2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SP et al. (2006) Trends Biochem. Sci. 31(4):231-9; Boon, EM et al. (2006) J. Biol. Chem. 281(31):21892-902; Winger, JA et al. (2007) J. Biol. Chem. 282(2):897-907). Белки H-NOX, в отличие от предшествующих переносчиков кислорода на основе гемоглобина, нейтральны в отношении оксида азота, H-NOX не захватывают циркулирующий оксид азота (NO) и, таким образом, не ассоциированы с гипертензивным или почечным побочным действием. Присущая им низкая реакционноспособность в отношении NO (и высокая стабильность в отношении NO) делает белки H-NOX дикого типа и мутантные белки H-NOX желаемыми заменителями крови вследствие низкой вероятности инактивации белок H-NOX эндогенным NO и низкой вероятности захвата эндогенного NO белками H-NOX. Важно отметить, что присутствие в дистальном кармане некоторых белков H-NOX тирозина (Pellicena, P. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(35):12854-12859) является признаком нежелательной высокой реакционноспособности в отношении NO, что служит противопоказанием для использования в качестве заменителя крови. Например, по аналогии, гемоглобин Mycobacterium tuberculosis со структурно аналогичным тирозином в дистальном кармане крайне быстро реагирует с NO и используется Mycobacterium для эффективного захвата и устранения защитного NO, продуцируемого инфицированным хозяином (Ouellet, H. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):5902-5907). Однако неожиданно выявлено, что белки H-NOX в действительности обладают намного меньшей, чем у гемоглобина, реакционноспособностью в отношении NO, что делает возможным их применение в качестве заменителей крови.

[0008] Белки H-NOX для доставки O₂ и/или NO для терапевтических и других применений описаны в патентах США №№ 8404631 и 8404632; WO 2007/139791, WO 2007/139767 и WO 2014/107171 и патентной заявке США с серийным № 14/530569, содержание каждого из которых полностью включено в качестве ссылки.

[0009] Все цитируемые в настоящем документе ссылки, включая патентные заявки и публикации, полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] Изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли у индивидуума с опухолью, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам усиления иммунного ответа на опухоль. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам увеличения инфильтрации лимфоцитов в опухоль индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль включает увеличение инфильтрации одного или нескольких из CD4 клеток, CD8 клеток или NK клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается ингибированием в опухоли одного или нескольких из T_рег-клеток, ассоциированных с опухолями макрофагов или происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается увеличением экспрессии MHC1 на опухолевых клетках. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает усиление процессирования антигена. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает увеличение презентирующих способностей дендритных клеток (DC).

[0011] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF-1α) и/или индуцируемого гипоксией фактора 2α (HIF-2α) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии лиганда белка программируемой смерти 1 (PD-L1) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии рецептора аденозина A_2A (A2AR) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂.

[0012] В определенных вариантах осуществления из указанных выше вариантов осуществления, опухоль представляет собой опухоль головного мозга, глиобластому, опухоль кости, опухоль поджелудочной железы, опухоль кожи, опухоль головы или шеи, меланому, опухоль легкого, опухоль матки, опухоль яичника, колоректальную опухоль, опухоль печени, печеночноклеточную карциному, опухоль желудка, опухоль яичка, опухоль эндометрия, опухоль шейки матки, опухоль влагалища, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, опухоль пищевода, опухоль кишечника, опухоль щитовидной железы, опухоль надпочечника, опухоль мочевого пузыря, опухоль почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточную опухоль.

[0013] В определенных аспектах изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли у индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль головного мозга, глиобластому, злокачественную опухоль кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланому, рак легких, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ануса, рак печени, печеночноклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак эндометрия, рак шейки матки, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак кишечника, рак щитовидной железы, злокачественную опухоль надпочечника, рак мочевого пузыря, рак почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому, рак ануса или плоскоклеточный рак.

[0014] В определенных вариантах осуществления из указанных выше аспектов и вариантов осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее. В дополнительных вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека (например, являющегося пациентом человека). В других вариантах осуществления млекопитающее представляет собой домашнее животное, лабораторное животное или сельскохозяйственное животное. В определенных вариантах осуществления домашнее животное, лабораторное животное или сельскохозяйственное животное представляет собой собаку, кошку, лошадь, обезьяну, кролика, крысу, мышь, морскую свинку, хомяка, свинью или корову.

[0015] В определенных вариантах осуществления из указанных выше аспектов и вариантов осуществления полипептид-носитель O₂ вводят посредством внутривенного, внутриартериального, внутриопухолевого, внутрипузырного, ингаляционного, интраперитонеального, внутрилегочного, внутримышечного, подкожного, внутритрахеального, трансмукозального, внутриглазного, интратекального или трансдермального введения. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ повторяют. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ повторяют раз в сутки или дважды в сутки приблизительно в течение периода от 4 недель до приблизительно 8 недель. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят каждые четыре, каждые 8, каждые 12 или каждые 24 часа в течение периода приблизительно от одних до приблизительно 10 суток. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят в виде болюсного введения. В других вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят посредством инфузии. В определенных вариантах осуществления инфузию полипептида-носителя O₂ проводят индивидууму в течение периода приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа или более 24 часов.

[0016] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли или лечения злокачественной опухоли у индивидуума, где полипептид-носитель O₂ вводят в комбинации с лучевой терапией. В определенных вариантах осуществления лучевую терапию проводят индивидууму через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часа после введения полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления радиационное облучение представляет собой рентгеновские лучи. В определенных вариантах осуществления облучение рентгеновскими лучами проводят в дозе приблизительно от 0,5 Грей до приблизительно 75 Грей. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или радиационное облучение повторяют. В определенных вариантах осуществления введение повторяют в любом количестве приблизительно большем двух, трех, четырех раз, пяти раз, десяти раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз или 30 раз. В определенных вариантах осуществления введение повторяют через одну неделю, две недели, три недели или четыре недели.

[0017] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли или лечения злокачественной опухоли у индивидуума, где полипептид-носитель O₂ вводят в комбинации с химиотерапевтическим средством или иммунотерапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство содержит цитотоксин. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или введение химиотерапевтического средства повторяют. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой одно или несколько из вакцины против злокачественной опухоли, терапию адоптивными иммуноцитами или средство, мишенью которого является регулятор контрольной точки иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления мишенью иммунотерапии является один или несколько из CTLA-4, PD1, PD-L1 или регулятор контрольной точки иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления адоптивное иммунотерапевтическое средство представляет собой экспрессирующую химерный антигенный рецептор T-клетку или T-клетку со сконструированным TCR. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой онколитический вирус или привлекающий T-клетки биспецифический активатор (BiTE). В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или введение иммунотерапевтического средства повторяют.

[0018] В определенных вариантах осуществления приведенных выше вариантов осуществления полипептид-носитель O₂ находится в фармацевтической композиции. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В определенных вариантах осуществления из любых приведенных выше вариантов осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой белок H-NOX.

[0019] В определенных аспектах изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли у индивидуума с опухолью, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам усиления иммунного ответа на опухоль. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам увеличения инфильтрации лейкоцитов в опухоль индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам увеличения инфильтрации лимфоцитов в опухоль индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль включает увеличение инфильтрации одного или нескольких из CD4 клеток, CD8 клеток или NK клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается ингибированием в опухоли одного или нескольких из T_рег-клеток, ассоциированных с опухолями макрофагов или происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается увеличением экспрессии MHC1 на опухолевых клетках. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает усиление процессирования антигена. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает усиление активации лимфоцитов. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает увеличение презентирующих способностей дендритных клеток (DC).

[0020] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF-1α) и/или индуцируемого гипоксией фактора 2α (HIF-2α) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии лиганда белка программируемой смерти 1 (PD-L1) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии рецептора аденозина A_2A (A2AR) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX.

[0021] В определенных вариантах осуществления приведенных выше вариантов осуществления опухоль представляет собой опухоль головного мозга, глиобластому, опухоль кости, опухоль поджелудочной железы, опухоль кожи, опухоль головы или шеи, меланому, опухоль легкого, опухоль матки, опухоль яичника, колоректальную опухоль, опухоль ануса, опухоль печени, печеночноклеточную карциному, опухоль желудка, опухоль яичка, опухоль эндометрия, опухоль шейки матки, опухоль влагалища, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, опухоль пищевода, опухоль кишечника, опухоль щитовидной железы, опухоль надпочечника, опухоль мочевого пузыря, опухоль почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточную опухоль.

[0022] В определенных аспектах изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли у индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль головного мозга, глиобластому, злокачественную опухоль кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланому, рак легких, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ануса, рак печени, печеночноклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак эндометрия, рак шейки матки, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак кишечника, рак щитовидной железы, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточный рак.

[0023] В определенных вариантах осуществления из указанных выше аспектов и вариантов осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее. В дополнительных вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека (например, являющегося пациентом человека). В других вариантах осуществления млекопитающее представляет собой домашнее животное, лабораторное животное или сельскохозяйственное животное. В определенных вариантах осуществления домашнее животное, лабораторное животное или сельскохозяйственное животное представляет собой собаку, кошку, лошадь, обезьяну, кролика, крысу, мышь, морскую свинку, хомяка, свинью или корову.

[0024] В определенных вариантах осуществления из указанных выше аспектов и вариантов осуществления белок H-NOX вводят посредством внутривенного, внутриартериального, внутриопухолевого, внутрипузырного, ингаляционного, интраперитонеального, внутрилегочного, внутримышечного, подкожного, внутритрахеального, трансмукозального, внутриглазного, интратекального или трансдермального введения. В определенных вариантах осуществления введение белка H-NOX повторяют. В определенных вариантах осуществления введение белка H-NOX повторяют раз в сутки или дважды в сутки приблизительно в течение периода от 4 недель до приблизительно 8 недель. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX вводят каждые четыре, каждые 8, каждые 12, каждые 24 часов или каждые 48 часов в течение периода приблизительно от одних до приблизительно 10 суток. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX вводят в виде болюсного введения. В других вариантах осуществления белок H-NOX вводят посредством инфузии. В определенных вариантах осуществления инфузию белка H-NOX у индивидуума проводят в течение периода приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 1 часа, приблизительно 2 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часов или более 24 часов.

[0025] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли или лечения злокачественной опухоли у индивидуума, где белок H-NOX вводят в комбинации с лучевой терапией. В определенных вариантах осуществления лучевую терапию проводят индивидууму через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часа после введения белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления лучевое воздействие представляет собой рентгеновские лучи. В определенных вариантах осуществления облучение рентгеновскими лучами проводят в дозе приблизительно от 0,5 Грей до приблизительно 75 Грей. В определенных вариантах осуществления введение белка H-NOX и/или радиационное облучение повторяют. В определенных вариантах осуществления введение повторяют в любом количестве большем двух, трех, четырех раз, пяти раз, десяти раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз или 40 раз. В определенных вариантах осуществления введение повторяют через одну неделю, два недели, три недели или четыре недели или более.

[0026] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли или лечения злокачественной опухоли у индивидуума, где белок H-NOX вводят в комбинации с химиотерапевтическим средством или иммунотерапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство содержит цитотоксин. В определенных вариантах осуществления введение белка H-NOX и/или введение химиотерапевтического средства повторяют. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой одно или несколько из вакцины против злокачественной опухоли, терапии адоптивными иммуноцитами или средства, мишенью которого является регулятор контрольной точки иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления мишенью иммунотерапии является один или несколько из CTLA-4, PD1, PD-L1 или регулятора контрольной точки иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления адоптивное иммунотерапевтическое средство представляет собой экспрессирующую химерный антигенный рецептор T-клетку или T-клетку со сконструированным TCR. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой онколитический вирус или привлекающий T-клетки биспецифический активатор (BiTE). В определенных вариантах осуществления введение белка H-NOX и/или введение иммунотерапевтического средства повторяют.

[0027] В определенных вариантах осуществления из указанных выше аспектов и вариантов осуществления белок H-NOX представляет собой H-NOX T. tengcongensis, H-NOX L. pneumophilia 2, β1 H. sapiens, β1 R. norvegicus, H-NOX C. lupus, β1 D. melanogaster, CG14885-PA D. melanogaster, GCY-35 C. elegans, H-NOX N. punctiforme, H-NOX C. crescentus, H-NOX S. oneidensis или H-NOX C. acetobutylicum. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит домен H-NOX, соответствующий домену H-NOX T. tengcongensis, приведенному в SEQ ID NO:2.

[0028] В определенных вариантах осуществления H-NOX содержит одну или несколько мутаций дистального кармана. В определенных вариантах осуществления мутация дистального кармана представляет собой замену аминокислоты в участке, соответствующем L144 H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления H-NOX представляет собой H-NOX T. tengcongensis, содержащий замену аминокислоты в положении 144. В определенных вариантах осуществления замена аминокислоты в положении 144 представляет собой замену L144F.

[0029] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой полимерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX содержит мономеры, где мономеры содержат домен H-NOX и домен полимеризации. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX ковалентно связан с доменом полимеризации. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит один или несколько доменов тримеризации. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где мономеры содержат домен H-NOX и домен тримеризации, где домен тримеризации представляет собой домен тримеризации бактериофага T4. В определенных вариантах осуществления домен тримеризации представляет собой домен сборки. В определенных вариантах осуществления домен сборки содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

[0030] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX слит с Fc-доменом иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX ковалентно связан с полиэтиленгликолем.

[0031] В определенных вариантах осуществления константа диссоциации белка H-NOX с O₂ находится в пределах 2 порядков от константы диссоциации гемоглобина с O₂, и при этом реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 10 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина. В определенных вариантах осуществления константа диссоциации полимерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 нМ до приблизительно 1000 нМ при 20°C. В определенных вариантах осуществления константа диссоциации белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ при 20°C. В определенных вариантах осуществления константа диссоциации белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ при 20°C. В определенных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO составляет менее чем приблизительно 700 сек^-1 при 20°C. В определенных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 100 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина. В определенных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина. В определенных вариантах осуществления k_off белка H-NOX с кислородом составляет меньше или равно приблизительно 0,65 сек^-1 при 20°C. В определенных вариантах осуществления k_off белка H-NOX с кислородом составляет приблизительно от 0,21 сек^-1 до приблизительно 0,65 сек^-1 при 20°C. В определенных вариантах осуществления k_off белка H-NOX с кислородом составляет приблизительно от 1,35 сек^-1 до приблизительно 2,9 сек^-1 при 20°C. В определенных вариантах осуществления скорость самоокисления гема белка H-NOX составляет менее чем приблизительно 1 час^-1 при 37°C.

[0032] В определенных вариантах осуществления приведенных выше вариантов осуществления белок H-NOX находится в фармацевтической композиции. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[0033] В определенных аспектах изобретение относится к применению белка-носителя O₂ для модуляции устойчивости опухоли у индивидуума. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает усиление иммунного ответа на опухоль. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к применению полипептида-носителя O₂ для увеличения инфильтрации лейкоцитов в опухоль индивидуума. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к применению полипептида-носителя O₂ для увеличения инфильтрации лимфоцитов в опухоль индивидуума. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль включает увеличение инфильтрации одного или нескольких из CD4 клеток, CD8 клеток или NK клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается ингибированием в опухоли одного или нескольких из T_рег-клеток, ассоциированных с опухолями макрофагов или происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лейкоцитов в опухоль сопровождается увеличением экспрессии MHC1 на опухолевых клетках. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается увеличением экспрессии MHC1 на опухолевых клетках.

[0034] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к применению полипептида-носителя O₂ для снижения экспрессии HIF-1α и/или HIF-2α в опухоли индивидуума. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к применению полипептида-носителя O₂ для снижения экспрессии PD-L1 в опухоли индивидуума. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к применению полипептида-носителя O₂ для снижения экспрессии A2AR в опухоли индивидуума.

[0035] В определенных вариантах осуществления указанных выше применений опухоль представляет собой опухоль головного мозга, глиобластому, опухоль кости, опухоль поджелудочной железы, опухоль кожи, опухоль головы или шеи, меланому, опухоль легкого, опухоль матки, опухоль яичника, колоректальную опухоль, опухоль ануса, опухоль печени, печеночноклеточную карциному, опухоль желудка, опухоль яичка, опухоль эндометрия, опухоль шейки матки, опухоль влагалища, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, опухоль пищевода, опухоль кишечника, опухоль щитовидной железы, опухоль надпочечника, опухоль мочевого пузыря, опухоль почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточную опухоль.

[0036] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к применению белка-носителя O₂ для лечения злокачественной опухоли у индивидуума. В определенных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль головного мозга, глиобластому, злокачественную опухоль кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланому, рак легких, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ануса, рак печени, печеночноклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак эндометрия, рак шейки матки, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак кишечника, рак щитовидной железы, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточный рак.

[0037] В определенных вариантах осуществления указанных выше применений индивидуум представляет собой млекопитающее. В определенных вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека.

[0038] В определенных вариантах осуществления указанных выше применений полипептид-носитель O₂ представляет собой белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой H-NOX T. tengcongensis, H-NOX L. pneumophilia 2, β1 H. sapiens, β1 R. norvegicus, H-NOX C. lupus, β1 D. melanogaster, CG14885-PA D. melanogaster, GCY-35 C. elegans, H-NOX N. punctiforme, H-NOX C. crescentus, H-NOX S. oneidensis или H-NOX C. acetobutylicum. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит домен H-NOX, соответствующий домену H-NOX T. tengcongensis, приведенному в SEQ ID NO:2. В определенных вариантах осуществления H-NOX содержит одну или несколько мутаций дистального кармана. В определенных вариантах осуществления мутация дистального кармана представляет собой замену аминокислоты в участке, соответствующем L144 H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления H-NOX представляет собой H-NOX T. tengcongensis, содержащий замену аминокислоты в положении 144. В определенных вариантах осуществления замена аминокислоты в положении 144 представляет собой замену L144F.

[0039] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой полимерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX содержит мономеры, где мономеры содержат домен H-NOX и домен полимеризации. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX ковалентно связан с доменом полимеризации. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит один или несколько доменов тримеризации. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где мономеры содержат домен H-NOX и домен тримеризации, где домен тримеризации представляет собой домен тримеризации бактериофага T4. В определенных вариантах осуществления домен тримеризации представляет собой домен сборки. В определенных вариантах осуществления домен сборки содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

[0040] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX слит с Fc-доменом иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX ковалентно связан с полиэтиленгликолем.

[0041] В определенных аспектах изобретение относится к наборам для модуляции устойчивости опухоли у индивидуума, содержащим белок-носитель O₂ для применения в способах, описываемых в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит один или несколько из флаконов, сосудов, ампул, бутылок, банок или гибкой упаковки. В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит один или несколько буферов. В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0042] На фиг. 1A и 1B представлена модель основных иммуносупрессорных путей, стимулируемых гипоксией (фиг. 1A) и точки терапевтического вмешательства, на которые может действовать лечение полипептидом-носителем O₂ (фиг. 1B).

[0043] Фиг. 2A-2C демонстрирует оксигенацию опухоли после одной болюсной дозы пегилированного тримера H-NOX L144F Tt, оцениваемую посредством пимонидазола и ELISA HIF-1. На фиг. 2A представлены уровни пимонидазола, определяемые посредством конкурентного ELISA. На фиг. 2B представлены уровни HIF-1α, определяемые посредством сэндвич-ELISA. Диаграммы демонстрируют количественное определение сигналов пимонидазола и HIF-1α после введения пегилированного тримера H-NOX L144F Tt. Средние значения +/- SEM. *** p<0,001, ** p<0,01 посредством одностороннего ANOVA и апостериорных тестов Бонферрони. На фиг. 2C представлена оценка опухолей по накоплению пегилированного тримера H-NOX L144F Tt посредством сэндвич-ELISA H-NOX и результаты приведены на грамм опухолевой ткани.

[0044] Фиг. 3A-3D демонстрирует прямые измерения оксигенации опухолевой ткани после введения пегилированного тримера H-NOX L144F Tt. Опухоли обрабатывали пегилированным тримером H-NOX L144F Tt (фиг. 3A), нефункциональным контрольным белком H-NOX Tt (фиг. 3C) или 100% кислородом, начиная от pO₂=59 Па (фиг. 3B), 100% кислородом, начиная от pO₂=667 Па (фиг. 3D).

[0045] На фиг. 4 представлено увеличение эффективности радиационного облучения после обработки пегилированным тримером H-NOX L144F Tt мышей, несущих опухоли H460. Мышей, несущих подкожный ксенотрансплантат опухоли H460 (150-300 мм³) предварительно обрабатывали пегилированным тримером H-NOX L144F Tt или обрабатывали только 10 Гр, облучали, выделяли опухоли и обрабатывали для клоногенного анализа. Количества клеток подсчитывали через 7 суток в тройных образцах из каждой опухоли. Каждая точка на диаграмме представляет среднее выжившей фракции одной опухоли.

[0046] Фиг. 5A-5C демонстрируют, что пегилированный тример H-NOX L144F Tt снижает уровни мишеней HIF-1α, вовлеченных в иммуносупрессию. Мышей, несущих подкожный ксенотрансплантат опухоли H460 (150-300 мм³) предварительно обрабатывали пегилированным тримером H-NOX L144F Tt или обрабатывали только носителем, и проводили сбор для анализа кПЦР-РВ. На фиг. 5A представлена экспрессия VEGF. На фиг. 5B представлена экспрессия GLUT1. На фиг. 5C представлена экспрессия PD-L1.

[0047] На фиг. 6A представлены нуклеиновая кислота (SEQ ID NO:5) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6) домена сборки фибритина бактериофага T4, слитого с C-концом последовательности H-NOX L144F Thermoanaerobacter tengcongensis и содержащего метку His₆. На фиг. 6B представлены нуклеиновая кислота (SEQ ID NO:7) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8) мономера H-NOX L144F-домен сборки без метки His₆.

[0048] Фиг. 7A-7C демонстрируют характерные изображения гипоксии опухоли и инфильтрацию T-клетками подкожных опухолей B16F10 (фиг. 7A), подкожных опухолей CT26 (фиг. 7B) и интракраниальных опухолей GL261 (фиг. 7C). Гипоксия (верхний ряд изображений) и инфильтрация T-клетками (средний ряд изображений) представлена посредством иммуногистохимии. В нижнем ряду изображений представлены результаты количественного анализа нескольких срезов опухолей. Гипоксические области опухолей инфильтрирует значимо меньшее количество CD4 и CD8 T-клеток.

[0049] На фиг. 8 представлен количественный анализ CD8 T-клеток в гипоксических областях опухолей после обработки H-NOX (OMX) или обработки контрольным носителем (носитель). Представлены характерные изображения. Гипоксические области метили пимонидазолом при иммуногистохимическом анализе. После обработки OMX наблюдают увеличение инфильтрации CD4 (данные не показаны) и CD8 T-клеток в области опухолей, которые до введения OMX являлись гипоксическими.

[0050] Фиг. 9A и 9B демонстрируют количественный анализ T-клеток в нормоксических и гипоксических областях опухолей после обработки H-NOX (OMX) или обработки контрольным носителем (носитель). Оценивали CD4 и CD8 T-клетки. Оцениваемые области опухолей включали области на периферии опухоли и в центре опухоли. Результаты количественного анализа изображений нескольких срезов приведены на фиг. 9A, а характерные изображения на фиг. 9B. Гипоксические области метили и применением иммуногистохимического анализа экспрессии карбоангидразы IX (CAIX). После обработки OMX наблюдают увеличение инфильтрации CD4 и CD8 T-клеток в области опухолей, которые до введения OMX являлись гипоксическими.

[0051] На фиг. 10 представлен результаты иммуногистохимического анализа на гипоксию (пимонидазол), а транспортерами для CD3 является модель опухоли GL261.

[0052] На фиг. 11 представлен иммуногистохимический анализ прохождения H-NOX в опухоль, гипоксии опухоли и локализации CD8 T-клеток в опухолях оральной меланомы собаки. Ткани окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), интеркалирующим ДНК красителем (DAPI) и антителами к H-NOX (OMX), карбоангидразе IX (CAIX) и CD8 для оценки локализации CD8 лимфоцитов в областях опухоли, которые являлись гипоксическими до обработки H-NOX (OMX). Изображения продемонстрировали положительные по CD8 T-клетки, локализованные по всему пространству областей опухоли, которые являлись гипоксическими до обработки H-NOX (OMX) (положительными по CAIX).

[0053] Фиг. 12A-12K демонстрируют, что больший размер опухоли коррелирует с увеличенной гипоксией и сниженной инфильтрацией лимфоцитов в подкожные опухоли 4T1-Luc сингенных мышей. На фиг. 12A представлены объемы опухолей на сутки 10 и сутки 14 после имплантации. На фиг. 12B представлена фракция лимфоцитов в популяции жизнеспособных клеток. На фиг. 12C представлены абсолютные количества лимфоцитов в жизнеспособной популяции. На фиг. 12D представлена отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом лимфоцитов. На фиг. 12E представлена положительная корреляция между объемом опухоли и процентом гипоксии. На фиг. 12F представлена отрицательная корреляция между процентом гипоксии и процентом лимфоцитов. На фиг. 12G представлена отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом положительных по CD3 T-клеток. На фиг. 12H представлена отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом положительных по CD4 T-клеток. На фиг. 12I представлена отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом положительных по CD8 T-клеток. На фиг. 12J представлена отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом двойных положительных по CD3 и CD4 T-клеток. На фиг. 12K представлена отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом двойных положительных по CD3 и CD8 T-клеток.

[0054] На фиг. 13A-13F продемонстрировано, что гипоксические области опухоли являются иммуносупрессорными и обнаруживают сниженную инфильтрацию T-клетками в подкожных опухолях 4T1-Luc сингенных мышей. Иммунофлуоресцентное окрашивание области опухоли №1 на (фиг. 13A) положительные по пимонидазолу гипоксические области и (фиг. 13B) положительные по CD8 T-клеткам, контрастно окрашенные (фиг. 13C) DAPI для выявления ядер. Иммунофлуоресцентное окрашивание области опухоли № 2 на (фиг. 13D) положительные по пимонидазолу гипоксические области и (фиг. 13E) положительные по CD4 T-клетки, контрастно окрашенные (фиг. 13F) DAPI для выявления ядер.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0055] Настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли у индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂, такого как белок H-NOX. В определенных аспектах изобретение относится к способам модуляции опосредуемой гипоксией устойчивости опухоли у индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂, такого как белок H-NOX. Полипептид-носитель O₂ доставляют в опухоль, где он усиливает иммунный ответ на опухоль. Усиление иммунного ответа на опухоль можно опосредовать направленным воздействием на опосредуемые индуцируемым гипоксией фактором 1α (HIF-1α) пути устойчивости опухоли и/или не опосредуемые HIF-1α пути устойчивости опухоли. В определенных аспектах изобретение относится к способам увеличения инфильтрации лимфоцитов в опухоль индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль включает увеличение инфильтрации одного или нескольких из CD4 клеток, CD8 клеток или NK клеток. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается ингибированием одного или нескольких из T_рег-клеток, ассоциированных с опухолями макрофагов или происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток в опухоли. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается увеличением экспрессии MHC1 на опухолевых клетках. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF-1α) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии лиганда белка программируемой смерти 1 (PD-L1) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии рецептора аденозина A_2A (A2AR) в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX).

Определения

[0056] Если не определено иначе, значения всех технических и научных терминов, используемых в настоящем документе представляют собой значения, обычно понимаемые специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение. Специалисту в данной области также понятно, что для практического осуществления или тестирования изобретения также можно использовать любые способы и материалы, сходные и эквивалентные со способами и материалами, описываемыми в настоящем документе.

[0057] Для применения по настоящему документу, если явно не указано иначе, применение терминов без указания конкретного количества и т.п. означает один или несколько.

[0058] В настоящей заявке, если не указано прямо или не понятно специалисту в данной области, применение "или" означает "и/или". В отношении пункта патентной формулы, зависящего от другого зависимого пункта, применение "или" относится более чем к одному предшествующему независимому или зависимому пункту.

[0059] Указание на "приблизительное" значение или параметр в настоящем документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к самому этому значению или параметру. Например, описание, указывающее на "приблизительно X" включает описание "X".

[0060] Следует понимать, что аспект и варианты осуществления изобретения, описываемые в настоящем документе, включают "содержащие", "состоящие" и "по существу состоящие" аспекты и варианты осуществления.

[0061] Термины "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо для обозначения полимера из остатков аминокислот, и они не ограничены минимальной длиной. Такие полимеры из остатков аминокислот могут содержать природные или неприродные остатки аминокислот и в качестве неограничивающих примеров включают пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и полимеры из остатков аминокислот. В определение включены и полноразмерные белки, и их фрагменты. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Кроме того, для целей настоящего изобретения "полипептид" относится к белку, который содержит модификации природной последовательности, такие как делеции, добавления и замены (как правило, консервативные по характеру), при условии, что белок сохраняет требуемую активность. Эти модификации могут вносить намеренно, как, например, посредством сайт-специфического мутагенеза, или могут являться случайными, например, как в случае мутаций у хозяев, которые приводят к продукции белков, или ошибок вследствие амплификации ПЦР. Как используют в настоящем документе, белок может содержать две или более субъединиц, связанных ковалентно или нековалентно, например, белок может содержать два или более ассоциированных мономера.

[0062] Термины "молекула нуклеиновой кислоты", "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" можно использовать взаимозаменяемо, и они относятся к полимеру из нуклеотидов. Такие полимеры из нуклеотидов могут содержать природные и/или неприродные нуклеотиды и в качестве неограничивающих примеров включают ДНК, РНК и ПНК. "Последовательность нуклеиновой кислоты" относится к линейной последовательности нуклеотидов, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид.

[0063] Как используют в настоящем документе, термин "индуцируемый гипоксией фактор" или "HIF" относится к семейству факторов транскрипции, которые реагируют на снижение кислорода, или гипоксию, в клеточном окружении. Представители семейства HIF человека включают HIF-1α, HIF-1β, HIF-2α, HIF-2β, HIF3α, HIF3β. HIF-1 функционирует как основной регулятор гомеостатического ответа на гипоксию, активируя транскрипцию множества генов, включая гены, вовлеченные в энергетический метаболизм, ангиогенез, апоптоз и другие гены, белковые продукты которых увеличивают доставку кислорода или облегчают метаболическую адаптацию к гипоксии. HIF-1 играет роль в васкуляризации эмбриона, ангиогенезе опухолей и патофизиологии ишемических заболеваний. Альфа субъединица индуцируемого гипоксией фактора 1 человека, или HIF-1α человека, взаимодействует с рядом полипептидов, включая в качестве неограничивающих примеров ARNTL, ARNT, CREBB, EP300, HIF-1AN, Mdm2, NR4A, p53, PSMA7, STAT3, UBC, VH и pVHL. HIF-1α человека кодирует ген HIF-1A. Аминокислотная последовательность HIF-1α человека предоставлена по номеру доступа GeneBank NP_001230013, а нуклеотидная последовательность иРНК HIF-1α человека предоставлена по номеру доступа GenBank NM_001243084. Аминокислотная последовательность HIF-1α мыши предоставлена по номеру доступа GeneBank NP_010431, а нуклеотидная последовательность иРНК HIF-1α мыши предоставлена по номеру доступа GenBank NM_034561.

[0064] Как используют в настоящем документе, "лиганд белка программируемой смерти 1" или "PD-L1" относится к трансмембранному белку, являющемуся частью пути контрольной точки иммунного ответа, который играет роль в подавлении иммунной системы. Взаимодействие PD-L1 с рецептором PD1 или рецептором B7.1 ингибирует опосредуемую T-клеточным рецептором активацию IL-2 и пролиферацию T-клеток. PD-L1 человека кодирует ген CD274. Аминокислотная последовательность PD-L1 человека предоставлена по номеру доступа GeneBank NP_001254635, а нуклеотидная последовательность иРНК PD-L1 человека предоставлена по номеру доступа GenBank NM_001267706. Аминокислотная последовательность PD-L1 мыши предоставлена по номеру доступа GeneBank NP_021893, а нуклеотидная последовательность иРНК PD-L1 мыши предоставлена по номеру доступа GenBank NM_068693.

[0065] Как используют в настоящем документе, "рецептора аденозина A_2A" или "A2AR" относится к рецептору суперсемейства сопряженных с G-белками рецепторов. A2AR представляет собой рецептор аденозина, который играет роль в потреблении кислорода и, как полагают, играет роль в подавление сверхреактивных клеток иммунной системы посредством или повышая уровни цАМФ. A2AR человека кодирует ген ADORA2A. Аминокислотная последовательность A2AR человека предоставлена по номеру доступа GeneBank NP_000666, а нуклеотидная последовательность иРНК A2AR человека предоставлена по номеру доступа GenBank NM_000675. Аминокислотная последовательность A2AR мыши предоставлена по номеру доступа GeneBank NP_033760, а нуклеотидная последовательность иРНК A2AR мыши предоставлена по номеру доступа GenBank NM_09630.

[0066] Как используют в настоящем документе, "белок H-NOX" означает белок, содержащий домен H-NOX (названный по домену, связывающему гем с оксидом азота и кислородом). Белок H-NOX в дополнение к домену H-NOX может содержать или не содержать один или несколько других доменов. В определенных примерах белок H-NOX не содержит гуанилатциклазный домен. Белок H-NOX может содержать или может не содержать домен полимеризации.

[0067] Как используют в настоящем документе, "полимерный белок H-NOX" представляет собой белок H-NOX, содержащий два или более доменов H-NOX. Домены H-NOX могут быть связаны ковалентно или нековалентно.

[0068] Как используют в настоящем документе, "домен H-NOX " представляет собой весь белок или часть белка, которые связывают оксид азота и/или кислород посредством гема. Домен H-NOX может содержать гем, или его можно выявить в виде апопротеина, способного к связыванию гема. В определенных примерах домен H-NOX содержит шесть альфа-спиралей с последующими двумя бета-цепями, с последующей одной альфа-спиралью, с последующими двумя бета-цепями. В определенных примерах домен H-NOX соответствует домену H-NOX H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis, приведенному в SEQ ID NO:2. Например, домен H-NOX может по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% являться идентичным домену H-NOX H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis, приведенному в SEQ ID NO:2. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX может на 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% или 100% являться идентичным домену H-NOX H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis, приведенному в SEQ ID NO:2.

[0069] Как используют в настоящем документе, "домен полимеризации" представляет собой домен (например, полипептидный домен), который обеспечивает ассоциацию мономерных молекул с формированием полимерной структуры. Например, домен полимеризации может обеспечивать ассоциацию мономерных доменов H-NOX с получением полимерного белка H-NOX. Иллюстративный домен полимеризации представляет собой домен сборки бактериофага T4, который обеспечивает формирование тримерных полипептидов. Другие примеры доменов полимеризации в качестве неограничивающих примеров включают Arc, POZ, суперспиральные домены (включая GCN4, лейциновые застежки, Velcro), утероглобин, коллаген, 3-цепочечные суперспирали (матрилин-1), тромбоспорины, TRPV1-C, P53, Mnt, авидин, стрептавидин, Bcr-Abl, COMP, субъединицу B веротоксина, CamKII, RCK и домены чувствительного к N-этилмалеинимиду слитого белка, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, защитный антиген сибирской язвы, аэролизин, α-гемолизин, связывающий C4b белок, Mi-CK, арилсульфатазу A и белки вирусных капсидов.

[0070] Как используют в настоящем документе, "последовательность аминокислотного линкера" или "последовательность аминокислотного спейсера" представляет собой короткую полипептидную последовательность, которую можно использовать для связывания двух доменов белка. В определенных вариантах осуществления длина последовательности аминокислотного линкера составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти аминокислот. Иллюстративные последовательности аминокислотных линкеров в качестве неограничивающих примеров включают последовательность Gly-Ser-Gly и последовательность Arg-Gly-Ser.

[0071] Как используют в настоящем документе, "метка His₆" относится к пептиду, содержащему шесть остатков His, связанных с полипептидом. Метку His₆ можно использовать для облегчения очистки белка, например, с использованием хроматографии, специфичной для метки His₆. После очистки метку His₆ можно отщеплять с использованием экзопептидазы.

[0072] Как используют в настоящем документе, термин "в значительной степени сходный" или "по существу такой же" означает достаточно высокую степень сходства между двумя или более числовыми значениями так, что специалист в данной области может считать различие между двумя или более значениями незначительным или не имеющим биологической и/или статистической значимости в рамках биологической характеристики, определяемой указанным значением. В определенных вариантах осуществления два или более в значительной степени сходных значений отличаются не более, чем приблизительно на одну из величин из 5%, 10%, 15%, 20%, 25% или 50%.

[0073] Как используют в настоящем документе, фраза "в значительной степени снижено" или "в значительной степени отличается" означает достаточно высокую степень различия между двумя числовыми значениями так, что специалист в данной области может считать различие между двумя значениями обладающим статистической значимостью в рамках биологической характеристики, определяемой указанным значением. В определенных вариантах осуществления два в значительной степени различных числовых значения отличаются более, чем приблизительно на одну из величин из 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В определенном варианте осуществления два в значительной степени различных числовых значения различаются приблизительно на одну из величин из 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% или 100%.

[0074] Полипептида с "природной последовательностью" содержит полипептид с той же аминокислотной последовательностью, что и полипептид, выявляемый в природе. Таким образом, полипептид с природной последовательностью может содержать аминокислотную последовательность природного полипептида любого организма. Такой полипептид с природной последовательностью можно выделять из природного источника или можно получать рекомбинантными или синтетическими способами. Термин полипептид с "природной последовательностью" конкретно включает природные укороченные или секретируемые формы полипептида (например, последовательность внеклеточного домена), формы природных вариантов (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты полипептида.

[0075] "Вариант" полипептида означает биологически активный полипептид по меньшей мере приблизительно на 80% идентичный по аминокислотной последовательности с полипептидом с природной последовательностью после выравнивания последовательностей и внесения, если необходимо, пропусков для достижения максимального процента идентичности последовательностей и не рассматривая никакие консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Например, такие варианты включают полипептиды, где на N- или C-концах полипептида добавляют или удаляют один или несколько остатков аминокислот. В определенных вариантах осуществления вариант по меньшей мере приблизительно на любое количество процентов из 80%, 90% или 95% идентичен по аминокислотной последовательности с полипептидом с природной последовательностью. В определенных вариантах осуществления вариант приблизительно на любое количество процентов из 80%-90%, 90%-95% или 95% -99% идентичен по аминокислотной последовательности с полипептидом с природной последовательностью.

[0076] Как используют в настоящем документе, "мутантный белок" означает белок с одной или несколькими мутациями по сравнению с белком, встречающимся в природе. В одном из вариантов осуществления мутантный белок содержит последовательность, которая отличается от последовательностей всех белков, встречающихся в природе. В различных вариантах осуществления аминокислотная последовательность мутантного белка по меньшей мере приблизительно на любое количество процентов из 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% идентична аминокислотной последовательности соответствующей области белка, встречающегося в природе. В определенных вариантах осуществления аминокислотная последовательность мутантного белка по меньшей мере приблизительно на любое количество процентов из 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% или 100% идентична аминокислотной последовательности соответствующей области белка, встречающегося в природе. В определенных вариантах осуществления мутантный белок представляет собой белковый фрагмент, который содержит по меньшей мере приблизительно любое количество из 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 смежных аминокислот полноразмерного белка. В определенных вариантах осуществления мутантный белок представляет собой белковый фрагмент, который содержит приблизительно любое количество из 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 или 300-400 смежных аминокислот полноразмерного белка. Идентичность последовательностей можно определять, например, с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей с параметрами по умолчанию, указанными для него (например, пакет программного обеспечения для анализа последовательностей Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Этот программный продукт сопоставляет сходные последовательности, определяя степени гомологии различных замен, делеций и других модификаций аминокислот.

[0077] Как используют в настоящем документе, "мутация" означает изменение исходной нуклеотидной или аминокислотной последовательности, встречающейся в природе. Иллюстративные мутации нуклеиновых кислот включают вставку, делецию, мутацию сдвига рамки, молчащую мутацию, нонсенс-мутацию или миссенс-мутацию. В определенных вариантах осуществления мутация нуклеиновой кислоты не является молчащей мутацией. Иллюстративные белковые мутации включают вставку одной или нескольких аминокислот (например, вставку 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот), делецию одной или нескольких аминокислот (например, делецию N-концевых, C-концевых и/или внутренних остатков, такую как делеция по меньшей мере приблизительно любого количества из 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или более аминокислот или делецию приблизительно любого количества из 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 или 300-400 аминокислот), замену одной или нескольких аминокислот (например, замену 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) или комбинации двух или более из указанного выше. Номенклатура, используемая при указании мутации конкретной аминокислоты, сначала определяет аминокислоту дикого типа, с последующим указанием номера остатка и, в заключение, замещающей аминокислоты. Например, Y140L означает, что тирозин в остатке с номером 140 замещен лейцином. Подобным образом, вариант белка H-NOX можно указывать посредством вариаций аминокислот белка H-NOX. Например, белок H-NOX Y140L T. tengcongensis относится к белку H-NOX T. tengcongensis, в котором остаток тирозина в положении номер 140 замещен остатком лейцина, а белок H-NOX W9F/Y140L T. tengcongensis относится к белку H-NOX T. tengcongensis, в котором остаток триптофана в положении 9 заменен остатком фенилаланина, и остаток тирозина в положении номер 140 заменен остатком лейцина.

[0078] "Эволюционно консервативная мутация" представляет собой замену аминокислоты в одном белке аминокислотой из соответствующего положения в другом белке того же семейства белков.

[0079] Как используют в настоящем документе, "происходящий из" относится к источнику белка, в который вносят одну или несколько мутаций. Например, белок, который "происходит из белка млекопитающего" относится к представляющему интерес белку, который является результатом внесения одной или нескольких мутаций в последовательность дикого типа (например, последовательность, встречающуюся в природе) белка млекопитающего.

[0080] Как используют в настоящем документе, "процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" и "гомология" в отношении последовательностей пептида, полипептида или антитела определяют как процент остатков аминокислот в последовательности-кандидате, который является идентичным с остатками аминокислот в указанной последовательности пептида или полипептида после выравнивания последовательностей и внесения, если необходимо, пропусков для достижения максимального процента идентичности последовательностей и не рассматривая никакие консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно проводить различными способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или MEGALIGNTM (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых полноразмерных последовательностей.

[0081] Как используют в настоящем документе, "k_off" относится к скорости диссоциации, такой как скорость высвобождения O₂ или NO из белка. Меньшие числовые значения k_off означают меньшую скорость диссоциации.

[0082] Как используют в настоящем документе, "k_on" относится к скорости ассоциации, такой как скорость связывания O₂ или NO с белком. Меньшие числовые значения k_on означают меньшую скорость ассоциации.

[0083] Как используют в настоящем документе, "константа диссоциации" относится к "кинетической константе диссоциации" или "рассчитываемой константе диссоциации". "Кинетическая константа диссоциации" или "K_D" представляет собой отношение кинетической константы скорости обратной реакции (k_off) к кинетической константе скорости прямой реакции (k_on), такое как значение K_D, определяемое как абсолютное значение стандартными способами (например, стандартными спектроскопическими способами, способами остановленного потока или способами импульсного фотолиза), включая способы, известные специалисту в данной области и/или описываемые в настоящем документе. "Рассчитываемая константа диссоциации" или "рассчитываемая K_D" относится к аппроксимации кинетической константы диссоциации на основе определяемой k_off. Значение k_on определяют на основе корреляции между кинетической K_D и k_off, как описано в настоящем документе.

[0084] Как используют в настоящем документе, "аффинность к кислороду" представляет собой качественный термин, который относится к силе связывания кислорода с группой гема белка. На эту аффинность влияют k_off и k_on для кислорода. Меньшее числовое значение K_D для кислорода означает более высокую аффинность.

[0085] Как используют в настоящем документе, "аффинность к NO" представляет собой качественный термин, который относится к силе связывания NO с белком (такой как связывание с группой гема или кислородом, связанным с группой гема, ассоциированной с белком). На эту аффинность влияют k_off и k_on для NO. Меньшее числовое значение K_D означает более высокую аффинность.

[0086] Как используют в настоящем документе, "стабильность в отношении NO" относится к стабильности или устойчивости белка к окислению при действии NO в присутствии кислорода. Например, показателем стабильности белка в отношении NO является способность белка не окисляться при связывании с NO в присутствии кислорода. В определенных вариантах осуществления после инкубации в течение приблизительно любого периода из 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 или 20 часов при 20°C окислено менее чем приблизительно любое значение из 50, 40, 30, 10 или 5% белка H-NOX.

[0087] Как используют в настоящем документе, "реакционноспособность в отношении NO" относится к скорости с которой NO окисляет железо в геме гем-связывающего белка в присутствии кислорода. Меньшее числовое значение реакционноспособности в отношении NO в единицах сек^-1 указывает на меньшую реакционноспособность в отношении NO.

[0088] Как используют в настоящем документе, "скорость самоокисления" относится к скорости с которой железо в геме гем-связывающего белка подвергается самоокислению. Меньшее числовое значение скорости самоокисления в единицах сек^-1 указывает на меньшую скорость самоокисления.

[0089] Термин "вектор" используют для описания полинуклеотида, который можно сконструировать так, чтобы он содержал клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, которые можно размножать в клетке-хозяине. Вектор может содержать один или несколько из следующих элементов: участок начала репликации, одна или несколько регуляторных последовательностей (например, таких как промоторы и/или энхансеры), которые регулируют экспрессию представляющего интерес полипептида, и/или один или несколько генов селективных маркеров (например, таких как гены устойчивости к антибиотикам и гены, которые можно использовать в колориметрических анализах, например, ген β-галактозидазы). Термин "экспрессирующий вектор" относится к вектору, который используют для экспрессии представляющего интерес полипептида в клетке-хозяине.

[0090] "Клетка-хозяин" относится к клетка, которая может являться или являлась реципиентом вектора или выделенного полинуклеотида. Клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки или эукариотические клетки. Иллюстративные эукариотические клетки включают клетки млекопитающих, такие как клетки приматов или не являющихся приматами животных; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки растений и клетки насекомых. Иллюстративные прокариотические клетки включают клетки бактерий, например, клетки E. coli.

[0091] Как используют в настоящем документе, термин "выделенный" относится к молекуле, которая отделена по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми она, как правило, находится или продуцируется в природе. Например, полипептид указывают как "выделенный", когда он отделен по меньшей мере от некоторых компонентов клетки, в которой происходила его продукция. Когда клетка секретирует полипептид после экспрессии, физическое отделение супернатанта, содержащего полипептид, от клеток, продуцирующих его, следует считать "выделением" полипептида. Подобным образом, полинуклеотид обозначают как "выделенный", когда он не является частью большего полинуклеотида (например, такого как геномная ДНК или митохондриальна ДНК, в случае полинуклеотида ДНК), в котором он, как правило, находится в природе, или отделен по меньшей мере от некоторых компонентов клеток, в которых его продуцировали, например, в случае полинуклеотида РНК. Таким образом, полинуклеотид ДНК, содержащийся в векторе внутри клетки-хозяина, можно обозначать как "выделенный".

[0092] Термины "индивидуум" используют в настоящем документе для обозначения животного, например, млекопитающего. В определенных вариантах осуществления предоставлены способы лечения млекопитающих, включая в качестве неограничивающих примеров, людей, грызунов, обезьян, кошек, собак, лошадей, жвачных, свиней, овец, коз, лабораторных млекопитающих животных, сельскохозяйственных млекопитающих животных, спортивных млекопитающих животных и домашних млекопитающих. В определенных примерах "индивидуум" относится к индивидууму, нуждающемуся в лечении заболевания или нарушения.

[0093] Как используют в настоящем документе, "заболевание" или "нарушение" относится к состоянию, когда необходимо лечение.

[0094] Термин "злокачественная опухоль" относится к злокачественному пролиферативному нарушению, ассоциированному с неконтролируемой клеточной пролиферацией, неограниченным ростом клеток и сниженной гибелью клеток посредством апоптоза.

[0095] Термин "опухоль" применяют в настоящем документе для обозначения группы клеток, которая демонстрирует аномально высокие уровни пролиферации и роста. Опухоль может являться доброкачественной, предзлокачественной или злокачественной; озлокачествленные опухолевые клетки являются злокачественными. Опухолевые клетки могут представлять собой клетки солидной опухоли или лейкозные опухолевые клетки. Термин "рост опухоли" применяют в настоящем документе для обозначения пролиферации или роста клетки или клеток, составляющих опухоль, что приводит к соответствующему увеличению размера опухоли.

[0096] Как используют в настоящем документе, "лечение" представляет собой способ получения полезных или желательных клинических результатов. Как используют в настоящем документе, "лечение" относится к любому введению или применению терапевтического средства при заболевании у млекопитающего, включая человека. Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты в качестве неограничивающих примеров включают уменьшение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (например, не ухудшающееся) состояние заболевания, предотвращение распространения (например, метастазирования) заболевания, задержка или замедление прогрессирования заболевания, улучшение состояния или временное облегчение болезненного состояния и ремиссия (частичная или полная), детектируемая или недетектируемая. "Лечение" также может означать продление продолжительности жизни по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни при отсутствии лечения. Также "лечение" включает уменьшение патологических последствий пролиферативного заболевания. Способы по изобретению предусматривают любые один или несколько из эти аспектов лечения.

[0097] В отношении злокачественной опухоли термин "лечение" включает любое или все из: ингибирования роста опухолевых клеток или злокачественных клеток, ингибирование репликации опухолевых клеток или злокачественных клеток, снижение общей опухолевой нагрузки и снижение интенсивности одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием.

[0098] Термины "ингибирование" или "ингибировать" относятся к уменьшению или прекращению любой фенотипической характеристики или к уменьшению или прекращению частоты возникновения, степени или вероятности этой характеристики. "Снижение" или "ингибирование" представляет собой уменьшение, снижение или подавление активности, функции и/или количества по сравнению с эталоном. В определенных вариантах осуществления под "снижением" или "ингибированием" подразумевают способность обеспечивать общее уменьшение на 20% или более. В другом варианте осуществления под "снижением" или "ингибированием" подразумевают способность обеспечивать общее уменьшение на 50% или более. В еще одном варианте осуществления под "снижением" или "ингибированием" подразумевают способность обеспечивать общее уменьшение на 75%, 85%, 90%, 95% или 99%.

[0099] Как используют в настоящем документе, "задержка развития заболевания" означает отсрочку, препятствие, замедление, задержку, стабилизацию, подавление и/или отдаление развития заболевания (такого как злокачественная опухоль). Продолжительность этой задержки может быть разной в зависимости от истории заболевания и/или подвергаемого лечению индивидуума. Как очевидно специалисту в данной области, достаточная или значимая задержка по существу может включать предотвращение, в том смысле, что заболевание у индивидуума не развивается. Например, можно задержать наступление поздней стадии злокачественной опухоли, такую как развитие метастазирования.

[0100] Как используют в настоящем документе, "эталон" относится к любому образцу, стандарту или уровню, которые используют в целях сравнения. Эталон можно получать из здорового и/или не подверженному заболеванию образца. В определенных примерах эталон можно получать из необработанного образца. В определенных примерах эталон получают из не подверженного заболеванию или необработанного образца, полученного у индивидуума. В определенных примерах эталон получают у одного или нескольких здоровых индивидуумов, которые не представляют собой индивидуума или пациента.

[0101] Как используют в настоящем документе, "предотвращение" включает проведение профилактики относительно возникновения или рецидива заболевания у индивидуума, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не диагностировано.

[0102] "Эффективное количество" средства относится к количеству, эффективному при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.

[0103] "Терапевтически эффективное количество" вещества/молекулы по изобретению, агониста или антагониста может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса индивидуума, и способности вещества/молекулы, агониста или антагониста обеспечивать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически положительное воздействие перевешивает любое токсическое или неблагоприятное действие вещества/молекулы, агониста или антагониста. Терапевтически эффективное количество можно доставлять посредством одного или нескольких введений.

[0104] "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, так как профилактическую дозу у индивидуумов используют до или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество является меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

[0105] Термины "фармацевтический состав" и "фармацевтическая композиция" относятся к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить эффективную биологическую активность активного ингредиента(ов), и который не содержит дополнительных компонентов с неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому вводят состав. Такие составы могут быть стерильными и по существу не содержать эндотоксинов.

[0106] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к нетоксическому твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному для состава средству или носителю, общепринятым в данной области для применения с терапевтическим средством, который также составляет "фармацевтическую композицию" для введения индивидууму. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и совместим с другими ингредиентами состава. Фармацевтически приемлемый носитель подходит для применяемого состава.

[0107] "Стерильный" состав является асептическим или по существу не содержит жизнеспособных микроорганизмов и их спор.

[0108] Введение "в комбинации с" одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами включает одновременное (совместное) и поочередное или последовательное введение в любом порядке.

[0109] Термин "одновременно" применяют в настоящем документе для обозначения введение двух или более терапевтических средства, когда по меньшей мере часть введения перекрывается по времени, или когда введение одного терапевтического средства находится в пределах небольшого периода времени относительно введения другого терапевтического средства. Например, два или более терапевтических средства вводят с разделением по времени не более чем приблизительно 60 минут, например, не более чем приблизительно любой период из 30, 15, 10, 5 или 1 минуты.

[0110] Термин "последовательно" применяют в настоящем документе для обозначения введение двух или более терапевтических средств, когда введение одного или нескольких средств продолжается после прекращения введения одного или нескольких других средств. Например, введение двух или более терапевтических средств проводят с разделением по времени более чем приблизительно 15 минут, например, приблизительно любой период из 20, 30, 40, 50 или 60 минут, 1 суток, 2 суток, 3 суток, 1 недели, 2 недель или 1 месяца.

[0111] Как используют в настоящем документе, "в сочетании с" относится к проведению одного способа лечения в дополнение к другому способу лечения. По существу "в сочетании с" относится к проведению одного способа лечения до, в течение или после проведения другого способа лечения у индивидуума.

[0112] Термин "вкладыш в упаковку" используют для обозначения инструкций, как правило, включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, где эти инструкции содержат информацию о показаниях, применении, дозировках, введении, комбинированном лечении, противопоказаниях и/или предостережениях о применении таких терапевтических продуктов.

[0113] "Промышленное изделие" представляет собой любое изделие (например, упаковка или контейнер) или набор, содержащие по меньшей мере один реагент, например, лекарственное средство для лечения заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоль), или зонд для специфической детекции биомаркера, описываемого в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления изделие или набор предоставляют, распространяют или продают в виде единицы для проведения способов, описываемых в настоящем документе.

Белки H-NOX

Обзор семейства белков H-NOX

[0114] Если не указано иначе, в композициях, наборах и способах, как описано в настоящем документе, можно использовать любой белок H-NOX дикого типа или мутантный белок H-NOX. Как используют в настоящем документе, "белок H-NOX" означает белок, содержащий домен H-NOX (названный по домену, связывающему гем с оксидом азота и кислородом). В дополнение к домену H-NOX белок H-NOX может содержать один или несколько других доменов или может не содержать их. Белки H-NOX являются представителями высококонсервативного хорошо охарактеризованного семейства гем-содержащих белков (Iyer, L. M. et al. (February 3, 2003). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902). Белки H-NOX также обозначают как белки Pfam 07700 или белки HNOB (Pfam - база данных выравниваний семейств белковых доменов и скрытых марковских моделей, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA). В определенных вариантах осуществления белок H-NOX обладает или теоретически рассчитано, что обладает, вторичной структурой, которая включает шесть альфа-спиралей с последующими двумя бета-цепями с последующей одной альфа-спиралью с последующими двумя бета-цепями. Белок H-NOX может представлять собой апопротеин, который может связывать гем или холопротеин со связанным гемом. С группой гема белок H-NOX может связываться ковалентно или нековалентно. Определенные белки H-NOX связывают NO, но не O₂, а другие связывают и NO, и O₂. Выделенные домены H-NOX факультативных аэробов связывают NO, но не O₂. Белки H-NOX облигатно аэробных прокариотов, C. elegans и D. melanogaster связывают NO и O_2. У млекопитающих представлено два белка H-NOX: β1 и β2. Выравнивание последовательностей H-NOX мыши, крысы, коровы и человека продемонстрировало, что у этих видов идентичность составляет >99%. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX белка H-NOX или весь белок H-NOX по меньшей мере приблизительно на любое количество процентов из 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% идентичен домену H-NOX соответствующей области природного белка H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (например, SEQ ID NO:2) или природного белка sGC (например, природного белка sGC β1). В определенных вариантах осуществления домен H-NOX белка H-NOX или весь белок H-NOX по меньшей мере приблизительно на любое количество процентов из 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99 или 99-99,9% идентичен домену H-NOX соответствующей области природного белка H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (например, SEQ ID NO:2) или природного белка sGC (например, природного белка sGC β1). Как описано далее в настоящем документе, белок H-NOX необязательно может содержать одну или несколько мутаций относительно соответствующего природного белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX в дополнение к домену H-NOX содержит один или несколько доменов. В конкретных вариантах осуществления белок H-NOX содержит один или несколько доменов или всю последовательность другого белка. Например, белок H-NOX может представлять собой слитый белок, который содержит домен H-NOX и часть другого белка или весь другой белок, такой как альбумин (например, сывороточный альбумин человека). В определенных вариантах осуществления присутствует только домен H-NOX. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX не содержит гуанилатциклазного домена. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит метку, например, метку His₆.

Полимерные белки H-NOX

[0115] В определенных аспектах изобретение относится к полимерным белкам H-NOX, содержащим два или более доменов H-NOX. Два или более доменов H-NOX могут быть связаны ковалентно или нековалентно. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX находится в форме димера, тримера, тетрамера, пентамера, гексамера, гептамера, октомера, наномера или декамера. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX содержит гомологичные домены H-NOX. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX содержит гетерологичные домены H-NOX, например, домены H-NOX могут содержать варианты аминокислот конкретных видов домена H-NOX или могут содержать домены H-NOX различных видов. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один из доменов H-NOX полимерного белка H-NOX содержит мутацию, соответствующую мутации L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один из доменов H-NOX полимерного белка H-NOX содержит мутацию, соответствующую мутации W9F/L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления полимерные белки H-NOX содержат один или несколько доменов полимеризации. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX содержит по меньшей мере один домен тримеризации. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит три домена H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления тримерный домен H-NOX содержит три домена H-NOX L144F T. tengcongensis (тримерный H-NOX L144F Tt). В определенных вариантах осуществления тримерный домен H-NOX содержит три домена H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis

[0116] В определенных аспектах изобретения полимерный белок H-NOX содержит два или более ассоциированных мономера. Мономеры могут быть связаны ковалентно или нековалентно. В определенных вариантах осуществления мономерные субъединицы полимерного белка H-NOX продуцируют там, где мономерные субъединицы ассоциируют in vitro или in vivo с формированием полимерного белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления мономеры содержат домен H-NOX и домен полимеризации. В определенных вариантах осуществления домен полимеризации ковалентно связан с доменом H-NOX, например, C-конец домена H-NOX ковалентно связан с N-концом или C-концом домена полимеризации. В других вариантах осуществления N-конец домена H-NOX ковалентно связан с N-концом или C-концом домена полимеризации. В определенных вариантах осуществления между доменом H-NOX и доменом полимеризации находится ковалентно связанный аминокислотный спейсер. "Аминокислотный спейсер" и "аминокислотный линкер" в настоящем документе используют взаимозаменяемо. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна из мономерных субъединиц полимерного белка H-NOX содержит мутацию, соответствующую мутации L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна из мономерных субъединиц полимерного белка H-NOX содержит мутацию, соответствующую мутации W9F/L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления мономер тримерного белка H-NOX содержит домен H-NOX и домен сборки бактериофага T4. В определенных вариантах осуществления мономер тримерного белка H-NOX содержит домен H-NOX T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления мономер тримерного белка H-NOX содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления мономер тримерного белка H-NOX содержит домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX связан с доменом сборки аминокислотным линкером, например, линкером Gly-Ser-Gly. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один домен H-NOX содержит метку. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один домен H-NOX содержит метку His₆. В определенных вариантах осуществления метка His₆ связана с доменом сборки аминокислотным линкером, например, линкером Arg-Gly-Ser. В определенных вариантах осуществления все домены H-NOX содержат метку His₆. В определенных вариантах осуществления тримерный белок H-NOX содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:8.

[0117] Масса иллюстративного домена H-NOX T. tengcongensis составляет приблизительно 26,7 кДа. В определенных вариантах осуществления атомная масса полимерного белка H-NOX составляет более чем любое значение приблизительно из 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 125 кДа, до приблизительно 150 кДа.

[0118] Изобретение относится к полимерным белкам H-NOX, которые после введения белка H-NOX индивидууму демонстрируют большее накопление в одной или нескольких тканях индивидуума по сравнению с соответствующим мономерным белком H-NOX, содержащим один домен H-NOX. Соответствующий белок H-NOX относится к мономерной форме белка H-NOX, содержащей по меньшей мере один из доменов H-NOX полимерного белка H-NOX. Ткани предпочтительного накопления полимерного H-NOX в качестве неограничивающих примеров включают опухоли и ткань с поврежденной сосудистой системой. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX присутствует у млекопитающего в течение по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 6, 12 или 24 часов после введения белка H-NOX индивидууму. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX присутствует у млекопитающего в течение периода приблизительно 1-2, 2-3, 3-4, 4-6, 6-12 или 12-24 часов после введения белка H-NOX индивидууму. В определенных вариантах осуществления после введения белка H-NOX индивидууму в пределах менее чем любой период из приблизительно 1 часа, 2 часов или 3 часов почки у млекопитающего выводят менее чем приблизительно 10% полимерного H-NOX.

Источники белков H-NOX и доменов H-NOX

[0119] В композициях, наборах и способах, описываемых в настоящем документе, можно использовать белки H-NOX и домены H-NOX любого рода или вида. В различных вариантах осуществления белок H-NOX или домены H-NOX полимерного белка H-NOX представляют собой белок или домен млекопитающего (например, примата (например, человека, обезьяны, гориллы, человекообразной обезьяны, лемура и т.д.), жвачного животного, лошади, свиньи, собаки или кошки), насекомого, дрожжей или бактерий, или представляет собой происходящий из него белок. Иллюстративные белки H-NOX млекопитающих включают растворимую гуанилатциклазу человека и крысы дикого типа (такую как субъединица β1). Неограничивающие примеры белков H-NOX включают белки H-NOX млекопитающих дикого типа, например, H. sapiens, M. musculus, C. familiaris, B. Taurus, C. lupus и R. norvegicus, а примеры of прокариотических белков H-NOX дикого типа включают T. tengcongensis, V. cholera, V. fischerii, N. punctiforme, D. desulfuricans, L. pneumophila 1, L. pneumophila и C. acetobutylicum. Примеры белков H-NOX, включая их номера доступа NCBI можно найти в патентах США №№ 8404631 и 8404632, WO 2007/139791 и WO 2007/139767; содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

[0120] Дополнительные белки H-NOX, домены H-NOX полимерных белков H-NOX и нуклеиновые кислоты H-NOX, которые могут быть пригодны для использования в фармацевтических композициях и способах, описываемых в настоящем документе, можно определять стандартными способами. Например, для определения дополнительных белков и нуклеиновых кислот H-NOX на основе сходства их первичной и/или теоретически рассчитанной вторичной структуры белка с первичной и/или вторичной структурами известных белков и нуклеиновых кислот H-NOX можно использовать стандартные выравнивание последовательностей и/или программы прогнозирования структуры. Например, в базе данных Pfam для классификации белков по семействам, таким как семейство белков H-NOX используют определенные алгоритмы выравнивания и скрытые марковские модели (например, Pfam 21,0) (Pfam - база данных выравниваний семейств белковых доменов и скрытых марковских моделей, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA). Для идентификации представителей семейства белков H-NOX также можно использовать стандартные базы данных, такие как база данных Swissprot-Trembl (по адресу во всемирной сети Интернет "expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Switzerland). Вторичную и/или третичную структуру белка H-NOX можно теоретически рассчитывать с использованием настроек стандартных программ прогнозирования структуры, таких как PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA), по умолчанию. Альтернативно, фактическую вторичную и/или третичную структуры белка H-NOX можно определять стандартными способами.

[0121] В определенных вариантах осуществления домен H-NOX в соответствующем положении содержит ту же аминокислоту, что и любой из приведенных ниже остатков дистального кармана в H-NOX T. tengcongensis: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140, Leu144 или любую комбинацию двух или более из указанных выше. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX на основе выравнивания их аминокислотных последовательности в положениях, соответствующих положениям Pro115 или Arg135 H-NOX T. tengcongensis, содержит пролин или аргинин, соответственно. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX содержит гистидин, который соответствует His105 H-NOX β1 R. norvegicus. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX обладает или теоретически рассчитано, что обладает, вторичной структурой, которая содержит шесть альфа-спиралей с последующими двумя бета-цепями с последующей одной альфа-спиралью с последующими двумя бета-цепями. Эта вторичная структура описана для белков H-NOX.

[0122] При желании, вновь идентифицированный белок H-NOX или домен H-NOX стандартными способами можно тестировать для определения связывает ли он гем. Способность домена H-NOX функционировать в качестве носителя O₂ можно тестировать, определяя стандартными способами, такими как описаны в настоящем документе, связывание доменом H-NOX O₂. При желании, в домен H-NOX для оптимизации его характеристик в качестве носителя O₂ можно внести одну или несколько мутаций, описываемых в настоящем документе. Например, можно внести одну или несколько мутаций для изменения его константы диссоциации с O₂, k_off для кислорода, скорости самоокисления гема, реакционноспособности в отношении NO, стабильности в отношении NO или любой комбинации двух или более из указанного выше. Для определения этих параметров можно использовать стандартные способы, такие как способы, описываемые в настоящем документе.

Мутантные белки H-NOX

[0123] Как описано далее в настоящем документе, белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX могут содержать одну или несколько мутаций, таких как мутация, которая изменяет константу диссоциации с O₂, k_off для кислорода, скорость самоокисления гема, реакционноспособность в отношении NO, стабильность в отношении NO или любую комбинацию двух или более из указанного выше по сравнению с этими параметрами соответствующего белка дикого типа. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к полимерному белку H-NOX, содержащему один или несколько доменов H-NOX, которые могут содержать одну или несколько мутаций, таких как мутация, которая изменяет константу диссоциации с O₂, k_off для кислорода, скорость самоокисления гема, реакционноспособность в отношении NO, стабильность в отношении NO или любую комбинацию двух или более из указанного выше по сравнению с этими параметрами соответствующего белка дикого типа. Можно получать панели сконструированных доменов H-NOX посредством случайного мутагенеза с последующим эмпирическим скринингом на необходимые или желаемые константы диссоциации, скорости диссоциации, реакционноспособность в отношении NO, стабильность, физиологическую совместимость или любую комбинацию двух или более из указанного выше на основе указаний, предоставленных в настоящем документе, способами, как описано в настоящем документе и, дополнительно, как известно специалисту в данной области. Альтернативно, мутагенез можно селективно проводить по конкретным областям или остаткам, таким как остатки дистального кармана, наблюдаемые на основе экспериментально определенной или теоретически рассчитанной трехмерной структуры белка H-NOX (см., например, Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59, таким образом, полностью включенную в качестве ссылки, конкретно в отношении последовательностей белков H-NOX дикого типа и мутантных белков H-NOX) или эволюционно консервативных остатков, идентифицированных на основе выравнивания последовательностей (см., например, Boon E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59, таким образом, полностью включенную в качестве ссылки, конкретно в отношении последовательностей белков H-NOX дикого типа и мутантных белков H-NOX).

[0124] В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный белок H-NOX или мутантный домен H-NOX полимерного белка H-NOX содержат последовательность, которая отличается от последовательностей всех белков или доменов H-NOX, встречающихся в природе. В различных вариантах осуществления аминокислотная последовательность мутантного белка по меньшей мере приблизительно на любое количество из 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% идентична последовательности соответствующей области белка H-NOX, встречающегося в природе. В различных вариантах осуществления аминокислотная последовательность мутантного белка приблизительно на 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99% или 99,5% идентична последовательности соответствующей области белка H-NOX, встречающегося в природе. В определенных вариантах осуществления мутантный белок представляет собой белковый фрагмент, содержащий по меньшей мере приблизительно любое количество из 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 смежных аминокислот полноразмерного белка. В определенных вариантах осуществления мутантный белок представляет собой белковый фрагмент, содержащий 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 или 300-400 смежных аминокислот полноразмерного белка. Идентичность последовательностей можно определять, например, с использованием программного обеспечение для анализа последовательностей с параметрами по умолчанию, указанными в нем (например, пакет программного обеспечение для анализа последовательностей Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Этот программный продукт сопоставляет сходные последовательности, определяя степени гомологии различных замен, делеций и других модификаций аминокислот.

[0125] В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный белок H-NOX или мутантный домен H-NOX полимерного белка H-NOX содержит вставку одной или нескольких аминокислот (например, вставка 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот). В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный белок H-NOX или мутантный домен H-NOX содержит делецию одной или нескольких аминокислот (например, делецию N-концевых, C-концевых и/или внутренних остатков, такую как делецию по меньшей мере приблизительно любого количества из 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или более аминокислот или делецию 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 или 300-400 аминокислот). В определенных вариантах осуществления изобретения мутантный белок H-NOX или мутантный домен H-NOX содержит замену одной или нескольких аминокислот (например, замену 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) или комбинации двух или более из указанного выше. В определенных вариантах осуществления мутантный белок по сравнению с белком, встречающимся в природе, содержит по меньшей мере одно изменение аминокислоты. В определенных вариантах осуществления мутантная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, который по сравнению с белком, встречающимся в природе, содержит по меньшей мере одно изменение аминокислоты. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота не является вырожденной версией нуклеиновой кислоты, встречающейся в природе, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью, идентичной белку, встречающемуся в природе.

[0126] В определенных вариантах осуществления мутации в белке H-NOX или домене H-NOX полимерного белка H-NOX представляют собой эволюционно консервативные мутации (также обозначаемые как мутации класса I). Примеры мутаций класса I приведены в таблице 1A. В таблице 1A мутации пронумерованы/отмечены в соответствии с последовательностью H-NOX β1 человека, но аналогичны всем последовательностям H-NOX. Таким образом, мутации на идентичный остаток может подвергаться соответствующее положение в любом другом белке H-NOX. Например, можно проводить мутацию Phe4 в H-NOX β1 человека на тирозин, так как другие белки H-NOX содержат в этом положении тирозин. Соответствующий остаток фенилаланина можно заменять на тирозин в любом другом белке H-NOX. В конкретных вариантах осуществления одна или несколько мутаций ограничены эволюционно консервативными остатками. В определенных вариантах осуществления одна или несколько мутаций могут включать по меньшей мере одну эволюционно консервативную мутацию и по меньшей мере одну эволюционно не консервативную мутацию. При желании, эти мутантные белки H-NOX подвергают эмпирическому скринингу на константы диссоциации с NO/O₂, реакционноспособность в отношении NO, стабильность и физиологическую совместимость на основе указаний, предоставленных в настоящем документе.

Таблица 1A. Иллюстративные мутации H-NOX класса I, затрагивающие эволюционно консервативные остатки

F4Y Q30G I145Y F4 л E33P I145H H7G N61G K151E A8E C78H I157F L9W A109F E183F

[0127] В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой мутацию дистального кармана, такую как мутация остатка в альфа-спиралях A, D, E или G (Pellicena, P. et al. (August 31, 2004). Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859). Иллюстративные мутации дистального кармана (также обозначаемые как мутации класса II) приведены в таблице 1B. В таблице 1B мутации пронумерованы/отмечены в соответствии с последовательностью H-NOX β1 человека, но аналогичны всем последовательностям H-NOX. Так как по каждому приведенному остатку жизнеспособные мутации обеспечивают несколько замен, остаток в каждом указанном положении можно заменять на любую другую природную или неприродную кислоту (обозначаемую "X"). Такие мутации могут приводить к получению белков H-NOX с разными желаемыми характеристиками аффинности, стабильности и реакционноспособности.

Таблица 1B. Иллюстративные мутации H-NOX класса II, затрагивающие остатки дистального кармана

V8X M73X I145X L9X F77X I149X F70X C78X

[0128] В конкретных вариантах осуществления мутация представляет собой мутация дистального кармана гема. Как описано в настоящем документе, ключевой молекулярной детерминантой, которая предотвращает связывание O₂ у связывающих NO представителей семейства H-NOX, является отсутствие донора водородной связи в дистальном кармане гема. Таким образом, в определенных вариантах осуществления мутация изменяет образование водородной связи между доменом H-NOX и лигандом в дистальном кармане. В определенных вариантах осуществления мутация разрушает донора водородной связи дистального кармана и/или ухудшает связывание лиганда восстановленного O₂ относительно соответствующего домена H-NOX дикого типа. Иллюстративные остатки дистального кармана включают Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 и Leu144 H-NOX T. tengcongensis и соответствующие остатки в любом другом белке H-NOX. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX содержит одну или несколько мутаций дистального кармана. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX содержит одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти мутаций дистального кармана. В определенных вариантах осуществления мутация дистального кармана соответствует мутации L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления мутация дистального кармана представляет собой мутацию L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX содержит две мутации дистального кармана. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX соответствует мутации W9F/L144F H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX представляет собой мутацию W9F/L144F H-NOX T. tengcongensis.

[0129] Остатки, которые не находятся в дистальном кармане, также влияют на трехмерную структуру группы гема; эта структура в свою очередь влияет на связывание O₂ и NO с железом в группе гема. Таким образом, в определенных вариантах осуществления белок H-NOX или домен H-NOX полимерного белка H-NOX содержат одну или несколько мутаций вне дистального кармана. Примеры остатков, которые можно подвергать мутированию, но которые не находятся в дистальном кармане, включают Pro115 и Arg135 H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой проксимальный карман, который в качестве остатка, которые связывается с железом гема, содержит His105.

[0130] В определенных вариантах осуществления, когда присутствуют две или более мутаций, по меньшей мере одна мутация находится в дистальном кармане, и по меньшей мере одна мутация находится вне дистального кармана (например, мутация в проксимальном карман). В определенных вариантах осуществления все мутации находятся в дистальном кармане.

[0131] Для снижения иммуногенности белка H-NOX или доменов H-NOX, происходящих из источников, отличных от людей, аминокислоты в белке H-NOX или домене H-NOX можно подвергать мутации в соответствующие аминокислоты H-NOX человека. Например, одну или несколько аминокислот на поверхности третичной структуры не принадлежащего человеку белка H-NOX или домена H-NOX можно подвергать мутации в соответствующие аминокислоты белка H-NOX или домена H-NOX человека. В определенных вариантах мутацию одной или нескольких аминокислот на поверхности можно комбинировать с мутацией двух или более остатков дистального кармана, мутацией одного или нескольких остатков вне дистального кармана (например, мутацией в проксимальном кармане) или комбинациями двух или более из указанного выше.

[0132] Изобретение также относится к любой комбинации мутаций, описываемых в настоящем документе, таким как двойные, тройные или множественные мутации более высокого порядка. Например, в одном и том же белке H-NOX можно проводить комбинации любых из мутаций, описываемых в настоящем документе. Следует отметить, что в настоящее изобретении также включены мутации в эквивалентных положениях других белков H-NOX млекопитающих или не принадлежащих млекопитающим. Иллюстративные мутантные белки H-NOX или мутантные домены H-NOX содержат одну или несколько мутаций, которые обеспечивают измененное связывание лиганда O₂ или NO относительно соответствующего домена H-NOX дикого типа и функционируют в качестве физиологически совместимого носителя газообразного O₂ в крови млекопитающих.

[0133] Номер остатка для мутации указывает положение в последовательности конкретного описанного белка H-NOX. Например, I5A T. tengcongensis относится к замене изолейцина на аланин в пятом положение H-NOX T. tengcongensis. Такую же мутацию изолейцина в аланин можно проводить в соответствующем остатке в любом другом белке H-NOX или домене H-NOX (этот остаток в последовательностях других белков H-NOX может являться или может не являться пятым остатком). Так как аминокислотные последовательности доменов H-NOX β1 млекопитающих отличаются самое большое на две аминокислоты, также ожидают, что мутации, приводящие к получению желаемых мутантных белков H-NOX или доменов H-NOX при введении в белки H-NOX β1 дикого типа крысы, приведут к получению желаемых мутантных белков H-NOX или доменов H-NOX при введении в белки H-NOX или домены H-NOX β1 дикого типа других млекопитающих, таких как люди.

[0134] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX L144F T. tengcongensis и три домена сборки. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis и три домена сборки. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX T. tengcongensis дикого типа и три домена сборки.

Модификации белков H-NOX

[0135] Любой из белков H-NOX дикого типа или мутантных белков H-NOX, включая полимерные белки H-NOX, можно стандартными способами модифицировать и/или формулировать для улучшения терапевтических или промышленных применений. Например, и в частности как применяют для гетерологичных сконструированных белков H-NOX, в данной области известен ряд способов для ограждения таких средств от иммунологического надзора, включая образование перекрестных сшивок, пегилирование, декорирование углеводами и т.д. (например, Rohlfs, R. J. et al. (May 15, 1998). J. Biol. Chem. 273(20):12128-12134; Migita, R. et al. (June 1997). J. Appl. Physiol. 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189, каждая из которых, таким образом, полностью включена в качестве ссылки, в частности, в отношении модификации белков), а также другие способы, известные специалисту в данной области. Слияние белка H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, с белком человек, таким как сывороточный альбумин человека, может увеличить время полувывведения из сыворотки, вязкость и коллоидное онкотическое давление. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX модифицируют в течение или после его синтеза, снижая его иммуногенность и/или увеличивая его время удержания в плазме. Также белки H-NOX можно инкапсулировать (например, посредством инкапсуляции в липосомах или наночастицах).

[0136] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит одну или несколько меток, например, для помощи в очистке белка H-NOX. Примеры f меток в качестве неограничивающих примеров включают His₆, FLAG, GST и MBP. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит одну или несколько меток His₆. Одну или несколько меток His₆ до использования полимерного белка H-NOX можно удалять, например, посредством обработки экзопептидазой. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX L144F T. tengcongensis, три домена сборки и три метки His₆. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis, три домена сборки и три метки His₆. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX T. tengcongensis дикого типа, три домена сборки и три метки His₆.

[0137] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит одну или несколько молекул полиэтиленгликоля (PEG) (т.е., является пегилированным). В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX L144F T. tengcongensis, три домена сборки и одну или несколько молекул полиэтиленгликоля (пегилированный тример H-NOX L144F Tt). В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis, три домена сборки и одну или несколько молекул полиэтиленгликоля. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой тример, содержащий три домена H-NOX T. tengcongensis дикого типа, три домена сборки и одну или несколько молекул полиэтиленгликоля. В определенных вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно от 1 кДа до приблизительно 50 кДа. В определенных вариантах осуществления молекулярная масса PEG составляет приблизительно любой из диапазонов от 1 кДа до 50 кДа, от 1 кДа до 40 кДа, от 1 кДа до 30 кДа, от 1 кДа до 25 кДа, от 1 кДа до 20 кДа, от 1 кДа до 15 кДа, от 1 кДа до 10 кДа, от 1 кДа до 5 кДа, от 5 кДа до 50 кДа, от 5 кДа до 40 кДа, от 5 кДа до 30 кДа, от 5 кДа до 25 кДа, от 5 кДа до 20 кДа, от 5 кДа до 15 кДа, от 5 кДа до 10 кДа, от 10 кДа до 50 кДа, от 10 кДа до 40 кДа, от 10 кДа до 30 кДа, от 10 кДа до 25 кДа, от 10 кДа до 20 кДа, от 10 кДа до 15 кДа, от 15 кДа до 50 кДа, от 15 кДа до 40 кДа, от 15 кДа до 35 кДа, от 15 кДа до 30 кДа, от 15 кДа до 25 кДа, от 15 кДа до 20 кДа, от 20 кДа до 50 кДа, от 20 кДа до 40 кДа, от 20 кДа до 30 кДа, от 20 кДа до 25 кДа, от 25 кДа до 50 кДа, от 25 кДа до 40 кДа, от 25 кДа до 30 кДа, от 30 кДа до 50 кДа, от 30 кДа до 40 кДа или от 40 кДа до 50 кДа. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит любое количество из более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 молекул PEG на мономер H-NOX или любое количество между ними. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит в среднем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 молекул PEG на мономер H-NOX или любое количество между ними.

Домены полимеризации

[0138] В определенных аспектах изобретение относится к полимерным белкам H-NOX, содержащим два или более доменов H-NOX и один или несколько доменов полимеризации. Домены полимеризации используют для связывания двух или более доменов H-NOX с формированием полимерного белка H-NOX. Один или несколько доменов полимеризации можно использовать для получения димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров и т.д. белков H-NOX. В данной области известны такие домены полимеризации, как: домен сборки фибритина бактериофага T4, Arc, POZ, суперспиральные домены (включая GCN4, лейциновые застежки, Velcro), утероглобин, коллаген, 3-цепочечные суперспирали (матрилин-1), тромбоспорины, TRPV1-C, P53, Mnt, авидин, стрептавидин, Bcr-Abl, COMP, субъединица B веротоксина, CamKII, RCK и домены чувствительного к N-этилмалеинимиду слитого белка, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, защитный антиген сибирской язвы, аэролизин, α-гемолизин, C4b-связывающий белок, Mi-CK, арилсульфатаза A и белки вирусных капсидов. Домены полимеризации могут связываться с доменами H-NOX ковалентно или нековалентно. В определенных вариантах осуществления домен полимеризации связан с доменом H-NOX с формированием мономерной субъединицы так, что домены полимеризации множества мономерных субъединиц ассоциируют с формированием полимерного домена H-NOX. В определенных вариантах осуществления C-конец домена H-NOX связан с N-концом домена полимеризации. В других вариантах осуществления N-конец домена H-NOX связан с N-концом домена полимеризации. В других вариантах осуществления C-конец домена H-NOX связан с C-концом домена полимеризации. В определенных вариантах осуществления N-конец домена H-NOX связан с C-концом домена полимеризации.

[0139] Для связывания домена полимеризации с доменом H-NOX можно использовать линкеры, например, например, аминокислотные линкеры. В определенных вариантах осуществления между доменом полимеризации и доменом H-NOX можно помещать линкер, содержащий любое количество из одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более десяти аминокислот. Иллюстративные линкеры в качестве неограничивающих примеров включают линкеры Gly-Ser-Gly и Arg-Gly-Ser.

Домен тримеризации фибритина бактериофага T4

[0140] Иллюстративный домен полимеризации представляет собой домен сборки бактериофага T4. Белок фибритин, белок из 486 аминокислот с C-концевым доменом тримеризации (остатки 457-483), кодирует ген wac бактериофага T4 (Efimov, V. P. et al. (1994) J. Mol. Biol. 242:470-486). Домен способен обеспечивать тримеризацию фибритина in vitro и in vivo (Boudko, S. P. et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:833-841; Letarov, A. V., et al., (1999) Biochemistry (Mosc) 64:817-823; Tao, Y., et al., (1997) Structure 5:789-798). Выделенный домен тримеризации из 27 остатков, часто обозначаемый как "домен сборки", использовали для конструирования химерных тримеров в ряде различных белков (включая гликопротеины оболочки ВИЧ (Yang, X. et al., (2002) J. Virol. 76:4634-4642), адгезины аденовирусов (Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K. et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:219-227), коллаген (Zhang, C., et al. (2009) Biotechnol Prog 25:1660-1668), gp26 фага P22 (Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci. 17:1475-1485) и гликопротеин вируса бешенства (Sissoeff, L., et al. (2005) J Gen Virol 86:2543-2552). Иллюстративная последовательность домена сборки представлена на фигуре 1 и предоставлена в SEQ ID NO:4.

[0141] Выделенный домен сборки укладывается в структура одиночной β-шпильки и тримеризуется в структуру β-пропеллера, включающую три шпильки (Guthe, S. et al. (2004) J. Mol. Biol. 337:905-915). Структура одного домена сборки определена ЯМР (Guthe, S. et al. (2004) J. Mol. Biol. 337:905-915), а структуры нескольких белков, тримеризованных с доменом сборки, определена посредством рентгеноструктурной кристаллографии (Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:8991-8998; Stetefeld, J. et al. (2003) Structure 11:339-346; Yokoi, N. et al. (2010) Small 6:1873-1879). Домен быстро укладывается и тримеризуется уменьшая возможность неправильно уложенных промежуточных соединений или побочных продуктов олигомеризации (Guthe, S. et al. (2004) J. Mol. Biol. 337:905-915). Домен сборки является очень стабильным, способным к поддержанию третичной структуры и олигомеризации в >10% SDS, 6,0M гуанидингидрохлориде или 80°C (Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci. 17:1475-1485; Bhardwaj, A., et al. (2007) J. Mol. Biol. 371:374-387) и моет улучшать стабильность последовательностей, слитых с доменом сборки (Du, C. et al. (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 79:195-202.

[0142] В определенных вариантах осуществления C-конец домена H-NOX связан с N-концом домена сборки. В других вариантах осуществления N-конец домена H-NOX связан с N-концом домена сборки. В других вариантах осуществления C-конец домена H-NOX связан с C-концом домена сборки. В определенных вариантах осуществления N-конец домена H-NOX связан с C-концом домена сборки.

[0143] В определенных вариантах осуществления для связывания домена сборки с доменом H-NOX используют линкеры. В определенных вариантах осуществления между доменом полимеризации и доменом H-NOX можно помещать линкер, содержащий любое количество из одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более десяти аминокислот. Иллюстративные линкеры в качестве неограничивающих примеров включают линкеры Gly-Ser-Gly и Arg-Gly-Ser. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к тримерному белку H-NOX, содержащему от N-конца к C-концу: домен H-NOX T. tengcongensis, аминокислотный линкер Gly-Ser-Gly и домен сборки. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к тримерному белку H-NOX, содержащему от N-конца к C-концу: домен H-NOX T. tengcongensis, аминокислотный линкер Gly-Ser-Gly, домен сборки, аминокислотный линкер Arg-Gly-Ser и метку His₆. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX T. tengcongensis содержит мутацию L144F. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX T. tengcongensis содержит мутацию W9F и мутацию L144F. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX T. tengcongensis представляет собой домен H-NOX дикого типа.

Мономерные субъединицы домена H-NOX

[0144] В одном из аспектов изобретение относится к рекомбинантным мономерным белкам H-NOX (т.е. мономерным субъединицам H-NOX полимерных белков H-NOX), которые могут ассоциировать с формированием полимерных белков H-NOX. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к рекомбинантным белкам H-NOX, содержащим домен H-NOX, как описано в настоящем документе, и домен полимеризации. Домен H-NOX и домен полимеризации могут связываться ковалентно или нековалентно. В определенных вариантах осуществления C-конец домена H-NOX рекомбинантного мономерного белка H-NOX связан с N-концом домена полимеризации. В других вариантах осуществления N-конец домена H-NOX рекомбинантного мономерного белка H-NOX связан с N-концом домена полимеризации. В других вариантах осуществления C-конец домена H-NOX рекомбинантного мономерного белка H-NOX связан с C-концом домена полимеризации. В определенных вариантах осуществления N-конец домена H-NOX рекомбинантного мономерного белка H-NOX связан с C-концом домена полимеризации. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный мономерный белок H-NOX не содержит гуанилатциклазного домена.

[0145] В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX содержит домен H-NOX дикого типа. В определенных вариантах осуществления изобретения мономерный белок H-NOX содержит одну или несколько мутаций в домене H-NOX. В определенных вариантах осуществления одна или несколько мутаций изменяют константу диссоциации с O₂, k_off для кислорода, скорость самоокисления гема, реакционноспособность в отношении NO, стабильность в отношении NO или любую комбинацию двух или более из указанного выше по сравнению с указанными характеристиками соответствующего домена H-NOX дикого типа. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой мутацию дистального кармана. В определенных вариантах осуществления мутация включает мутацию, которая не находится в дистальном кармане. В определенных вариантах осуществления мутация дистального кармана соответствует мутации L144 T. tengcongensis (например, мутации L144F). В определенных вариантах осуществления рекомбинантный мономерный белок H-NOX содержит две мутации дистального кармана, соответствующие мутациям W9 и L144 T. tengcongensis (например, мутацию W9F/L144F).

[0146] В определенных аспектах изобретение относится к рекомбинантным мономерным белкам H-NOX, которые ассоциируют с формированием тримерных белков H-NOX. В определенных вариантах осуществления рекомбинант белок H-NOX содержит домен H-NOX и домен тримеризации. В определенных вариантах осуществления домен тримеризации представляет собой домен сборки, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX T. tengcongensis. В определенных вариантах осуществления C-конец домена H-NOX T. tengcongensis ковалентно связан с N-концом домена сборки. В определенных вариантах осуществления C-конец домена H-NOX T. tengcongensis ковалентно связан с C-концом домена сборки. В определенных вариантах осуществления домен T. tengcongensis представляет собой домен H-NOX L144F. В определенных вариантах осуществления домен T. tengcongensis представляет собой домен H-NOX W9F/L144F. В определенных вариантах осуществления домен T. tengcongensis представляет собой домен H-NOX дикого типа.

[0147] В определенных вариантах осуществления домен H-NOX ковалентно связан с доменом полимеризации с использованием последовательности аминокислотного линкера. В определенных вариантах осуществления длина последовательности аминокислотного линкера составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти аминокислот. Иллюстративные последовательности аминокислотных линкеров в качестве неограничивающих примеров включают последовательность Gly-Ser-Gly и последовательность Arg-Gly-Ser. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX, содержащий три домена H-NOX и три последовательности тримеризации, где домен H-NOX ковалентно связан с доменом тримеризации последовательностью аминокислотного линкера. В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX от N-конца к C-концу содержит следующее: домен H-NOX L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly и домен сборки. В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX от N-конца к C-концу содержит следующее: домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly и домен сборки. В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX от N-конца к C-концу содержит следующее: домен H-NOX дикого типа T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly и домен сборки.

[0148] В определенных вариантах осуществления рекомбинантный мономерный белок H-NOX содержит метку, например, метку His₆, FLAG, GST или MBP метка. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный мономерный белок H-NOX содержит метку His₆. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный мономерный белок H-NOX не содержит метки. В определенных вариантах осуществления метка (например, метка His₆) ковалентно связана с доменом полимеризации с использованием последовательности аминокислотного спейсера. В определенных вариантах осуществления длина последовательности аминокислотного линкера составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти аминокислот. Иллюстративные последовательности аминокислотных линкеров в качестве неограничивающих примеров включают последовательность Gly-Ser-Gly и последовательность Arg-Gly-Ser. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX, содержащий три домена H-NOX, три последовательности тримеризации и три метки His₆, где домен H-NOX ковалентно связан с доменом тримеризации последовательностью аминокислотного линкера, и домен тримеризации ковалентно связан с меткой His₆ последовательностью аминокислотного линкера. В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX от N-конца к C-концу содержит следующее: домен H-NOX L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, домен сборки, последовательность линкера Arg-Gly-Ser и метку His₆. В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX от N-конца к C-концу содержит следующее: домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, домен сборки, последовательность линкера Arg-Gly-Ser и метку His₆. В определенных вариантах осуществления мономерный белок H-NOX от N-конца к C-концу содержит следующее: домен H-NOX дикого типа T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, домен сборки, последовательность линкера Arg-Gly-Ser и метку His₆.

[0149] В определенных вариантах осуществления рекомбинантный мономерный белок H-NOX содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:8.

Характеристики белков H-NOX дикого типа и мутантных белков H-NOX

[0150] Настоящее изобретение относится к применению полипептидов-носителей O₂ для применения в усилении иммуногенности в отношение опухолей, например, ингибируя иммуносупрессорное действие, ассоциированное с гипоксией опухолей. Неограничивающее иллюстративное семейство полипептидов-носителей O₂ представляет собой семейство полипептидов-носителей O₂ H-NOX. Как описано в настоящем документе, получено большое количество разнообразных мутантных белков H-NOX, включая полимерные белки H-NOX, обеспечивающих различные диапазоны констант диссоциации с NO и O₂, k_off для O₂, реакционноспособность в отношении NO и стабильность. Для обеспечения функциональных носителей газов крови, белки H-NOX можно использовать для функциональной замены или дополнения эндогенных носителей O₂, таких как гемоглобин. В определенных вариантах осуществления белки H-NOX, такие как полимерные белки H-NOX, используют для доставки O₂ в гипоксическую опухолевую ткань (например, глиобластому) в качестве вспомогательного средства для лучевой терапии или химиотерапии. Таким образом, в определенных вариантах осуществления белок H-NOX по сравнению с эндогенным носителем O₂, таким как гемоглобин, обладает сходными или улучшенными скоростью ассоциации с O₂, скоростью диссоциации с O₂, константой диссоциации для связывания с O₂, стабильностью в отношении NO, реакционноспособностью в отношении NO, скоростью самоокисления, временем удержания в плазме или любой комбинацией двух или более из указанного выше. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой полимерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX представляет собой тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки.

[0151] В различных вариантах осуществления k_off для O₂ белка H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, составляет приблизительно от 0,01 до приблизительно 200 сек^-1 при 20°C, например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 200 сек^-1, приблизительно от 0,1 до 100 сек^-1, приблизительно от 1,0 до приблизительно 16,0 сек^-1, приблизительно от 1,35 до приблизительно 23,4 сек^-1, приблизительно от 1,34 до приблизительно 18 сек^-1, приблизительно от 1,35 до приблизительно 14,5 сек^-1, приблизительно от 0,21 до приблизительно 23,4 сек^-1, приблизительно от 1,35 до приблизительно 2,9 сек^-1, приблизительно от 2 до приблизительно 3 сек^-1, приблизительно от 5 до приблизительно 15 сек^-1 или приблизительно от 0,1 до приблизительно 1 сек^-1. В определенных вариантах осуществления k_off для кислорода белка H-NOX составляет меньше или равно приблизительно 0,65 сек^-1 при 20°C (например, приблизительно от 0,21 сек^-1 до приблизительно 0,65 сек^-1 при 20°C).

[0152] В различных вариантах осуществления k_on для O₂ белка H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, составляет приблизительно от 0,14 до приблизительно 60 мкМ^-1сек^-1 при 20°C, например, приблизительно от 6 до приблизительно 60 мкМ^-1сек^-1, приблизительно от 6 до 12 мкМ^-1сек^-1, приблизительно от 15 до приблизительно 60 мкМ^-1сек^-1, приблизительно от 5 до приблизительно 18 мкмM^-1сек^-1 или приблизительно от 6 до приблизительно 15 мкМ^-1сек^-1.

[0153] В различных вариантах осуществления кинетическая или рассчитываемая K_D для связывания O₂ белком H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, составляет приблизительно от 1 нМ до 1 мМ, приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ или приблизительно от 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ. В определенных вариантах осуществления рассчитываемая K_D для связывания O₂ составляет любую величину из приблизительно от 2 нМ до приблизительно 2 мкМ, приблизительно 2 мкM до приблизительно 1 мМ, приблизительно от 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, приблизительно от 9 мкМ до приблизительно 50 мкМ, приблизительно от 100 мкМ до приблизительно 1 мМ, приблизительно от 50 нМ до приблизительно 10 мкМ, приблизительно от 2 нМ до приблизительно 50 мкМ, приблизительно от 100 нМ до приблизительно 1,9 мкМ, приблизительно от 150 нМ до приблизительно 1 мкМ или приблизительно от 100 нМ до приблизительно 255 нМ, приблизительно от 20 нМ до приблизительно 2 мкМ, 20 нМ до приблизительно 75 нМ, приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 2 мкМ, приблизительно от 2 мкМ до приблизительно 10 мкМ, приблизительно от 2 мкМ до приблизительно 9 мкМ или приблизительно 100 нМ до 500 нМ при 20°C. В определенных вариантах осуществления кинетическая или рассчитываемая K_D для связывания O₂ составляет менее чем приблизительно любая из величин 100 нМ, 80 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ или 10 нМ при 20°C.

[0154] В различных вариантах осуществления кинетическая или рассчитываемая K_D для связывания O₂ белком H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, находится в диапазоне приблизительно от 0,01 до приблизительно 100 кратной от K_D гемоглобина в тех же условиях (например, при 20°C), например приблизительно от 0,1 до приблизительно 10 кратной или приблизительно от 0,5 до приблизительно 2 кратной от K_D гемоглобина в тех же условиях (например, при 20°C). В различных вариантах осуществления кинетическая или рассчитываемая K_D для связывания NO белком H-NOX находится в диапазоне приблизительно от 0,01 до приблизительно 100 кратной от K_D гемоглобина в тех же условиях (например, при 20°C), например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 10 кратной или приблизительно от 0,5 до приблизительно 2 кратной от K_D гемоглобина в тех же условиях (например, при 20°C).

[0155] В определенных вариантах осуществления после инкубации в течение приблизительно любого периода из 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 или 20 часов при 20°C окисляется менее чем приблизительно любое значение из 50, 40, 30, 10 или 5% белка H-NOX, включая полимерный белок H-NOX.

[0156] В различных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO, включая полимерный белок H-NOX, составляет менее чем приблизительно 700 сек^-1 при 20°C, например, менее чем приблизительно 600 сек^-1, 500 сек^-1, 400 сек^-1, 300 сек^-1, 200 сек^-1, 100 сек^-1, 75 сек^-1, 50 сек^-1, 25 сек^-1, 20 сек^-1, 10 сек^-1, 50 сек^-1, 3 сек^-1, 2 сек^-1, 1,8 сек^-1, 1,5 сек^-1, 1,2 сек^-1, 1,0 сек^-1, 0,8 сек^-1, 0,7 сек^-1 или 0,6 сек^-1 при 20°C. В различных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO составляет приблизительно от 0,1 до приблизительно 600 сек^-1 при 20°C, например, приблизительно от 0,5 до приблизительно 400 сек^-1, приблизительно от 0,5 до приблизительно 100 сек^-1, приблизительно от 0,5 до приблизительно 50 сек^-1, приблизительно от 0,5 до приблизительно 10 сек^-1, приблизительно от 1 до приблизительно 5 сек^-1, или приблизительно от 0,5 до приблизительно 2,1 сек^-1 при 20°C. В различных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX по меньшей мере приблизительно в 10, 100, 1000 или 10000 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина в тех же условиях, например, при 20°C.

[0157] В различных вариантах осуществления скорость самоокисления гема белка H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, составляет менее чем приблизительно 1,0 час^-1 при 37°C, например, менее чем приблизительно любое значение из 0,9 час^-1, 0,8 час^-1, 0,7 час^-1, 0,6 час^-1, 0,5 час^-1, 0,4 час^-1, 0,3 час^-1, 0,2 час^-1, 0,1 час^-1 или 0,05 час^-1 при 37 C. В различных вариантах осуществления скорость самоокисления гема белка H-NOX составляет приблизительно от 0,006 до приблизительно 5,0 час^-1 при 37°C, например, приблизительно от 0,006 до приблизительно 1,0 час^-1, от 0,006 до приблизительно 0,9 час^-1 или приблизительно от 0,06 до приблизительно 0,5 час^-1 при 37°C.

[0158] В различных вариантах осуществления мутантный белок H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, обладает (a) константой диссоциации, скоростью ассоциации (k_on для O₂ или NO) или скоростью диссоциации (k_off для O₂ или NO) с O₂ или NO в пределах 2 порядков от константы диссоциации гемоглобина с O₂, (b) обладает более слабой аффинностью к NO (например, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, 100 раз или 1000 раз более слабой), чем аффинность sGC β1, соответственно, (c) реакционноспособностью в отношении NO со связанным O₂ по меньшей мере в 1000 раз меньшей, чем гемоглобин, (d) временем удержания в плазме in vivo по меньшей мере в 2, 10, 100 или 1000 раз большим, чем время удержания в плазме in vivo гемоглобина или (e) любой комбинацией двух или более из указанного выше.

[0159] Иллюстративные подходящие носители O₂ обеспечивают константы диссоциации в пределах двух порядков от константы диссоциации гемоглобина с O₂, например, приблизительно от 0,01 до 100 кратной, например, приблизительно от 0,1 до 10 кратной или приблизительно от 0,5 до 2 кратной от константы диссоциации гемоглобина. Для количественного определения констант диссоциации можно использовать ряд общепризнанных способов, таких как способы, описываемые в настоящем документе (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189, каждая из которых, таким образом, полностью включена в качестве ссылки, в частности, в отношении определения констант диссоциации), а также способы, известные специалисту в данной области. Иллюстративные носители O₂ обеспечивают низкую или минимизированную реакционноспособность белка H-NOX со связанным O₂ в отношении NO, например, реакционноспособность в отношении NO более низкую, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина. В определенных вариантах осуществления реакционноспособность в отношении NO является намного более низкой, например, по меньшей мере приблизительно в 10, 100, 1000 или 10000 раз более низкой, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина. Для количественного определения реакционноспособности в отношении NO можно использовать ряд общепризнанных способов (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189, каждая из которых, таким образом, полностью включена в качестве ссылки, в частности, в отношении определения реакционноспособности в отношении NO), а также способы, известные специалисту в данной области. Так как H-NOX T. tengcongensis дикого типа обладает такой низкой реакционноспособностью в отношении NO, другие белки H-NOX дикого типа и мутантные белки H-NOX могут обладать сходной низкой реакционноспособностью в отношении NO. Например, H-NOX Y140H T. tengcongensis обладает реакционноспособностью в отношении NO, сходной с реакционноспособностью H-NOX T. tengcongensis дикого типа.

[0160] Кроме того, подходящие носители O₂ обеспечивают высокую или максимизированную стабильность, особенно стабильность in vivo. Можно использовать ряд показателей стабильности, такие как устойчивость к окислению (например, стабильность в отношении самоокисления или окисления NO), термостабильность и стабильность in vivo. Можно использовать ряд общепризнанных способов для количественного определения стабильности, такие как способы, описываемые в настоящем документе, (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), а также способы, известные специалисту в данной области. Для стабильности in vivo в плазме, крови или ткани, иллюстративные показатели стабильности включают время удержания, скорость выведения и время полужизни. Ожидают, что при высоких температурах стабильными являются белки H-NOX термофильных организмов. В различных вариантах осуществления время удержания в плазме является по меньшей мере приблизительно в 2, 10, 100 или 1000 раз большим, чем время удержания гемоглобина (например, Bobofchak, K. M. et al. (August 2003). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2):H549-H561). Как понятно специалисту в данной области, основанные на гемоглобине заменители крови ограничены быстрым выведением бесклеточного гемоглобина из плазмы вследствие присутствия рецепторов гемоглобина, которые удаляют бесклеточный гемоглобин из плазмы. Так как рецепторов для белков H-NOX в плазме не существует, ожидают, что белки H-NOX дикого типа и мутантные белки H-NOX будут обладать большим временем удержания в плазме, чем время удержания в плазме гемоглобина. При желании время удержания в плазме можно увеличивать посредством пегилирования или перекрестного сшивания белка H-NOX или слияния белка H-NOX с другим белком стандартными способами (такими как способы, описываемые в настоящем документе, и способы, известные специалисту в данной области).

[0161] В различных вариантах осуществления белок H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, обладает константой диссоциации с O₂ приблизительно от 1 нМ до приблизительно 1 мМ при 20°C и реакционноспособностью в отношении NO по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньшей, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина в тех же условиях, например, при 20°C. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX обладает константой диссоциации с O₂ приблизительно от 1 нМ до приблизительно 1 мМ при 20°C и реакционноспособностью в отношении NO менее чем приблизительно 700 сек^-1 при 20°C (например, менее чем приблизительно 600 сек^-1, 500 сек^-1, 100 сек^-1, 20 сек^-1 или 1,8 сек^-1 при 20°C). В определенных вариантах осуществления белок H-NOX обладает константой диссоциации с O₂ в пределах 2 порядков от константы диссоциации гемоглобина с O₂ и реакционноспособностью в отношении NO по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньшей, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина в тех же условиях, например, при 20°C. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX обладает k_off для кислорода приблизительно от 0,01 до приблизительно 200 сек^-1 при 20°C и реакционноспособностью в отношении NO по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньшей, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина в тех же условиях, например, при 20°C. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX обладает k_off для кислорода, которая составляет менее чем приблизительно 0,65 сек^-1 при 20°C (например, приблизительно от 0,21 сек^-1 до приблизительно 0,64 сек^-1 при 20°C) и реакционноспособностью в отношении NO по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньшей, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина в тех же условиях, например, при 20°C. В определенных вариантах осуществления изобретения константа диссоциации белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 нМ до приблизительно 1 мкМ (1000 нМ), приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ, или приблизительно от 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ. В конкретных вариантах осуществления константа диссоциации белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 2 нМ до приблизительно 50 мкМ, приблизительно от 50 нМ до приблизительно 10 мкМ, приблизительно от 100 нМ до приблизительно 1,9 мкМ, приблизительно от 150 нМ до приблизительно 1 мкМ или приблизительно от 100 нМ до приблизительно 255 нМ при 20°C. В различных вариантах осуществления константа диссоциации белка H-NOX с O₂ составляет менее чем приблизительно 80 нМ при 20°C, например, приблизительно от 20 нМ до приблизительно 75 нМ при 20°C. В определенных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO является по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньшей или приблизительно в 1000 раз меньшей, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина в тех же условиях, например, при 20°C. В определенных вариантах осуществления реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO составляет менее чем приблизительно 700 сек^-1 при 20°C, например, менее чем приблизительно 600 сек^-1, 500 сек^-1, 400 сек^-1, 300 сек^-1, 200 сек^-1, 100 сек^-1, 75 сек^-1, 50 сек^-1, 25 сек^-1, 20 сек^-1, 10 сек^-1, 50 сек^-1, 3 сек^-1, 2 сек^-1, 1,8 сек^-1, 1,5 сек^-1, 1,2 сек^-1, 1,0 сек^-1, 0,8 сек^-1, 0,7 сек^-1 или 0,6 сек^-1 при 20°C. В определенных вариантах осуществления k_off белка H-NOX с кислородом составляет от 0,01 до 200 сек^-1 при 20°C, например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 200 сек^-1, приблизительно от 0,1 до 100 сек^-1, приблизительно от 1,35 до приблизительно 23,4 сек^-1, приблизительно от 1,34 до приблизительно 18 сек^-1, приблизительно от 1,35 до приблизительно 14,5 сек^-1, приблизительно от 0,21 до приблизительно 23,4 сек^-1, приблизительно от 2 до приблизительно 3 сек^-1, приблизительно от 5 до приблизительно 15 сек^-1 или приблизительно от 0,1 до приблизительно 1 сек^-1. В определенных вариантах осуществления константа диссоциации белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 100 нМ до приблизительно 1,9 мкМ при 20°C, и k_off белка H-NOX с кислородом составляет приблизительно от 1,35 сек^-1 до приблизительно 14,5 сек^-1 при 20°C. В определенных вариантах осуществления скорость самоокисления гема белка H-NOX составляет менее чем приблизительно 1 час^-1 при 37°C, например, менее чем приблизительно любая величина из 0,9 час^-1, 0,8 час^-1, 0,7 час^-1, 0,6 час^-1, 0,5 час^-1, 0,4 час^-1, 0,3 час^-1, 0,2 час^-1 или 0,1 час^-1. В определенных вариантах осуществления k_off белка H-NOX с кислородом составляет приблизительно от 1,35 сек^-1 до приблизительно 14,5 сек^-1 при 20°C, и скорость самоокисления гема белка H-NOX составляет менее чем приблизительно 1 час^-1 при 37°C. В определенных вариантах осуществления k_off белка H-NOX с кислородом составляет приблизительно от 1,35 сек^-1 до приблизительно 14,5 сек^-1 при 20°C, и реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO составляет менее чем приблизительно 700 сек^-1 при 20°C (например, менее чем приблизительно 600 сек^-1, 500 сек^-1, 100 сек^-1, 20 сек^-1 или 1,8 сек^-1 при 20°C). В определенных вариантах осуществления скорость самоокисления гема белка H-NOX составляет менее чем приблизительно 1 час^-1 при 37°C, и реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO составляет менее чем приблизительно 700 сек^-1 при 20°C (например, менее чем приблизительно 600 сек^-1, 500 сек^-1, 100 сек^-1, 20 сек^-1 или 1,8 сек^-1 при 20°C).

[0162] В определенных вариантах осуществления вязкость раствора белка H-NOX, включая раствор полимерного белка H-NOX, составляет от 1 до 4 сантипуаз (сП). В определенных вариантах осуществления коллоидное онкотическое давление раствора белка H-NOX составляет от 2,7 до 6,7 кПа.

Определение связывания O₂ и/или NO

[0163] Специалист в данной области может легко определять характеристики связывания кислорода и оксида азота любым белком H-NOX, включая полимерный белок H-NOX, такой как тримерный белок H-NOX, известными в данной области способами и неограничивающими иллюстративными способами, описанными ниже.

Кинетическая K_D:: отношение k_off к k_on

[0164] Значение кинетической K_D для белков H-NOX дикого типа и мутантных белков H-NOX, включая полимерные белки H-NOX, определяют по существу, как описано в Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59, таким образом, полностью включенной в качестве ссылки, в частности, в отношении определения скоростей ассоциации с O₂, скоростей диссоциации с O₂, констант диссоциации для связывания O₂, скоростей самоокисления и скоростей диссоциации с NO.

k_on (Скорость ассоциации с O₂)

[0165] Ассоциацию O₂ с гемом определяют с использованием импульсного фотолиза при 20°C. Подвергнуть фотолизу комплекс Fe^II-O₂ является невозможным ввиду очень быстрой кинетики парной рекомбинации, таким образом, импульсному фотолизу подвергают комплекс Fe^II-CO при длине волны лазера 560 нм (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA), получая 5-координатное промежуточное соединение Fe^II, за связыванием молекулярного O₂ с которым следят при различных длинах волн. Получают образцы белка посредством анаэробного восстановления 10 мМ дитионитом с последующим обессоливанием на колонке PD-10 (Millipore, Inc., Billerica, MA). Затем образцы разбавляют до 20 мкМ гема в буфере 50 мМ TEA, 50 мМ NaCl, pH 7,5 в кварцевой кювете с контролируемой атмосферой с размером от 100 мкл до 1 мл и длиной пути 1 см. В свободном пространстве этой кюветы в течение 10 минут пропускают газообразный CO с формированием комплекса Fe^II-CO, формирование которого подтверждают посредством спектроскопии в УФ-видимом свете (максимум Соре 423 нм). Затем этот образец используют для определения кинетики обратного связывания CO после импульсного фотолиза при поддержании 101,3 кПа газообраного CO, или его открывают и перемешивают на воздухе в течение 30 минут до полной оксигенации буфера с последующим импульсным фотолизом для наблюдения за событиями обратного связывания O₂. За ассоциацией O₂ с гемом наблюдают при нескольких длинах волны с течением времени. Эти зарегистрированные данные аппроксимируют посредством однократного экспоненциального сглаживания с использованием программного обеспечения Igor Pro (Wavemetrics, Inc., Oswego, OR; последняя версия 2005 года). Эта скорость не зависит от длины волны наблюдения, но зависит от концентрации O₂. Для подтверждения всех комплексов и промежуточных соединений всегда используют спектроскопию в УФ-видимом свете (Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA). Данные нестационарного поглощения собирают с использованием устройств, описанных в Dmochowski, I. J. et al. (August 31, 2000). J. Inorg. Biochem. 81(3):221-228, таким образом, полностью включенной в качестве ссылки, в частности в отношении устройства. Устройство обладает временем реакции 20 нсек и данные оцифровывают при 200 мегаимпульсов сек^-1.

k_off (O₂ скорость диссоциации)

[0166] Для измерения k_off комплексы Fe^II-O₂ белка (5 мкМ гем), разбавляют в анаэробном буфере 50 мМ TEA, 50 мМ NaCl, pH 7,5 и быстро смешивают с равным объемом того же буфера (анаэробного), содержащим различные концентрации дитионита и/или различное насыщение газообразным CO. Данные получают на спектрофотометре остановленного потока HI-TECH Scientific SF-61, оборудованном баней с постоянной температурой Neslab RTE-100, установленной на 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom). За диссоциацией O₂ из гема наблюдают как увеличение оптической плотности при 437 нм, максимум разностного спектра сFe^II - Fe^II-O₂, или при 425 нм, максимум разностного спектра Fe^II - Fe^II-CO. Конечные зарегистрированные данные аппроксимируют посредством однократного экспоненциального сглаживания с использованием программного обеспечения, которое является частью устройства. Каждый эксперимент проводят минимум шесть раз, и полученные скорости усредняют. Определяемые скорости диссоциации не зависят от концентрации дитионита и не зависят от насыщения CO в качестве ловушки для восстановленных молекул, оба при наличии и в отсутствии 10 мМ дитионита.

Кинетическая K_D

[0167] Кинетическую K_D определяют, рассчитывая отношение k_off к k_on, используя определения k_off и k_on, описанные выше.

Рассчитываемая K_D

[0168] Для определения рассчитываемой K_D значения k_off и кинетической K_D, получаемые, как описано выше, наносят на график. Определяют линейную зависимость между k_off и кинетической K_D посредством уравнения (y=mx+b). Затем значения k_off интерполируют вдоль линии для получения рассчитываемой K_D, с использованием Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA). В отсутствие измеряемой k_on, эта интерполяция обеспечивает способ установить связь k_off и K_D.

Скорость самоокисления

[0169] Для определения скорости самоокисления образцы белка анаэробно восстанавливают, затем разбавляют 5 мкМ гема в аэробном буфере 50 мМ TEA, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Затем эти образцы инкубируют в спектрофотометре Cary 3E, оборудованном баней с постоянной температурой Neslab RTE-100, установленной на 37°C и периодически сканируют (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA). Скорость самоокисления определяют по разнице между максимумом и минимумом разностного спектра Fe^III - Fe^II нанесенного на график зависимости от времени и посредством однократного экспоненциального сглаживания с использованием Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA).

Скорость реакции с NO

[0170] Реакционноспособность в отношении NO определяют с использованием очищенных белков (H-NOX, полимерного H-NOX, гемоглобина Homo sapiens (Hs Hb) и т.д.), получаемых при 2 мкМ в буфере A, и NO, получаемом при 200 мкМ в буфере A (буфер A: 50 мМ Hepes, pH 7,5, 50 мМ NaCl). Данные получают на спектрофотометре остановленного потока HI-TECH Scientific SF-61, оборудованном баней с постоянной температурой Neslab RTE-100, установленной на 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom). Белок быстро смешивают с NO в отношении 1:1 с временем накопления 0,00125 сек. Длины волн максимума изменения аппроксимируют до однократного экспоненциального сглаживания с использованием программного обеспечения, которое является частью спектрометра, по существу измеряя скорость-лимитирующий этап окисления NO. Конечные продукты реакции представляют собой нитрозилированное железо для белков H-NOX и комплекс железо-вода для Hs Hb.

Определения p50

[0171] При желании можно определять значение p50 для мутантных белков H-NOX или белков H-NOX дикого типа, как описано в Guarnone, R. et al. (September/October 1995). Haematologica 80(5):426-430, таким образом, полностью включенной в качестве ссылки, в частности, в отношении определения значений p50. Значение p50 определяют с использованием анализатора HemOx. В измерительной камере вначале находится 0% кислорода и постепенно проводят медленный подъем до 100% кислорода. Кислородный зонд в камере определяет насыщение кислородом%. Второй зонд (УФ-видимый свет) определяет две длины волны поглощения, настроенные на альфа и бета пики спектров УФ-видимого света гем-содержащего белка (например, такого белка, как H-NOX в комплексе с гемом). Эти пики поглощения линейно растут по мере связывания кислорода гем-содержащим белком. Затем процент изменения от несвязанного до 100% связанного наносят на график в зависимости от % значения кислород с получением кривой. p50 представляет собой точку на кривой, где 50% гем-содержащего белка связано с кислородом.

[0172] Конкретно, на Hemox-Analyzer (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA) определяют кривую диссоциации окисленного гем-содержащего белка (ODC), подвергая 50 мкл крови или гем-содержащего белка воздействию увеличивающегося парциального давления кислорода и восстанавливая его газообразным азотом. Изменение давления кислорода детектируют кислородным электродом Кларка, что наносят на ось x регистратора x-y. Одновременно посредством двухволновой спектрофотометрии при 560 нм и 576 нм регистрируют получаемое увеличение фракции окисленного гем-содержащего белка и наносят на ось y. Образцы крови получают из антемедиальной вены, предотвращают свертывание гепарином и до анализа содержат при 4°C на льду. Пятьдесят мкл цельной крови разбавляют в 5 мкл раствора Hemox, предоставляемого производителем буфера, который сохраняет pH раствора при значении 7,4±0,01. Образец-буфер вносят в кювету, которая является частью анализатора Hemox и температура смеси уравновешивают и доводят 37°C; затем образец окисляют до 100% воздухом. После доведения значения pO₂ образец восстанавливают азотом; в ходе восстановления записывают кривую на миллиметровой бумаге. Значение p50 экстраполируют на ось x как точку, в которой насыщение O₂ составляет 50%, с использованием программного обеспечения, которое является частью анализатора Hemox. Время, необходимое для проведения записи, составляет приблизительно 30 минут.

Нуклеиновые кислоты H-NOX

[0173] Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим любой из мутантных белков H-NOX, полимерных H-NOX или рекомбинантных мономерных белковых субъединиц H-NOX, как описано в настоящем документе.

[0174] В конкретных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит участок или всю последовательность нуклеиновой кислоты любых нуклеиновых кислот, кодирующих белок H-NOX или домен H-NOX. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере приблизительно 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или более смежных нуклеотидов нуклеиновой кислоты H-NOX и по сравнению с нуклеиновой кислотой H-NOX, из которой она получена, содержит одну или несколько мутаций (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мутаций). В различных вариантах осуществления мутантная нуклеиновая кислота H-NOX по сравнению с нуклеиновой кислотой H-NOX, из которой она получена, содержит менее чем приблизительно 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 мутаций. Изобретение также относится к вырожденным вариантам любой нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный белок H-NOX.

[0175] В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает нуклеиновые кислоты, кодирующие два или более домена H-NOX. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, содержащие два или более домена H-NOX, связаны так, что с нуклеиновой кислоты экспрессируется полимерный белок H-NOX. В дополнительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько доменов полимеризации. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, содержащие два или более доменов H-NOX и один или несколько доменов полимеризации, связаны так, что с нуклеиновой кислоты экспрессируется полимерный белок H-NOX.

[0176] В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит участок или полную последовательность нуклеиновой кислоты любой нуклеиновой кислоты, кодирующей домен полимеризации. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую домен H-NOX и домен полимеризации. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая домен H-NOX, и нуклеиновая кислота, кодирующая домен полимеризации, связаны так, что продуцируемый полипептид представляет собой слитый белок, содержащий домен H-NOX и домен полимеризации.

[0177] В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько меток His₆. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие линкерные последовательности, расположенные между нуклеиновыми кислотами, кодирующими домен H-NOX, домен полимеризации и/или метку His₆.

[0178] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей домен H-NOX и домен сборки. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX T. thermoanaerobacter. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX T. thermoanaerobacter дикого типа. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX L144F T. thermoanaerobacter. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX W9F/L144F T. thermoanaerobacter.

[0179] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим в направлении от 5' к 3' следующее: домен H-NOX L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly и домен сборки. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим в направлении от 5' к 3' следующее: домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly и домен сборки. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим в направлении от 5' к 3' следующее: домен H-NOX дикого типа T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly и домен сборки.

[0180] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим в направлении от 5' к 3' следующее: домен H-NOX L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, домен сборки, последовательность линкера Arg-Gly-Ser и метку His₆. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим в направлении от 5' к 3' следующее: домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, домен сборки, последовательность линкера Arg-Gly-Ser и метку His₆. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим в направлении от 5' к 3' следующее: домен H-NOX дикого типа T. tengcongensis, последовательность аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, домен сборки, последовательность линкера Arg-Gly-Ser и метку His₆.

[0181] В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7.

[0182] Изобретение также относится к клетке или популяции клеток, содержащих по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантн белок H-NOX, описываемый в настоящем документе. Иллюстративные клетки включают клетки насекомых, растений, дрожжей, бактерий и млекопитающих. Эти клетки пригодны для получения мутантных белков H-NOX стандартными способами, такими как способы, описываемые в настоящем документе.

[0183] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к клетке, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую домен H-NOX и домен сборки. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX T. thermoanaerobacter. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX T. thermoanaerobacter дикого типа. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX L144F T. thermoanaerobacter. В определенных вариантах осуществления домен H-NOX представляет собой домен H-NOX W9F/L144F T. thermoanaerobacter. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к клетке, содержащей нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7.

Составы белков H-NOX

[0184] Настоящее изобретение относится к составам полипептидов-носителей O₂ для применения в усилении иммуногенности в отношении опухолей, например, ингибируя подавляющую иммунитет активность, ассоциированную с гипоксией опухоли. Неограничивающее иллюстративное семейство полипептидов-носителей O₂ представляет собой семейство полипептидов-носителей O₂ H-NOX. Для составления фармацевтических или нефармацевтических композиций можно использовать любой белок H-NOX дикого типа или мутантный белок H-NOX, включая полимерные белки H-NOX, описываемые в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления составы содержат мономерный белок H-NOX, содержащий домен H-NOX и домен полимеризации, такие, что мономерные белки H-NOX in vitro или in vivo ассоциируют с получением полимерного белка H-NOX. Как дополнительно описано ниже, эти составы пригодны в ряде терапевтических и промышленных применений.

[0185] В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит один или несколько белков H-NOX дикого типа или мутантных белков H-NOX, описываемых в настоящем документе, включая полимерные белки H-NOX, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Примеры фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов в качестве неограничивающих примеров включают любой из стандартных фармацевтических носителей или эксципиентов, таких как растворы фосфатно-солевого буфера, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода и различные типы средств для смачивания. Иллюстративные разбавители для аэрозольного или парентерального введения представляют собой фосфатно-солевой буфер или нормальный (0,9%) солевой раствор. Композиции, содержащие такие носители, формулируют хорошо известными общепринятыми способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000, каждая из которых, таким образом, полностью включена в качестве ссылки, в частности, в отношении составов). В определенных вариантах осуществления составы являются стерильными. В определенных вариантах осуществления составы по существу не содержат эндотоксинов.

[0186] Хотя в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно использовать любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области, тип носителя варьирует в зависимости от способа введения. Композиции можно формулировать для любого подходящего способа введения, включая, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрипузырное, внутриопухолевое, ингаляционное, интраперитонеальное, внутрилегочное, внутримышечное, подкожное, интратрахеальное, трансмукозальное, внутриглазное, интратекальное или трансдермальное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель может включать, например, воду, солевое раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из указанных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза или карбонат магния. Также в качестве носителей можно использовать биоразлагаемые микросферы (например, полилактатполигликолят).

[0187] В определенных вариантах осуществления фармацевтические или нефармацевтические композиции включают буфер (например, нейтральный забуференный солевой раствор, фосфатно-солевой буфер и т.д.), углевод (например, глюкозу, маннозу, сахарозу, декстран и т.д.), антиоксидант, хелатирующее средство (например, ЭДТА, глутатион и т.д.), консервант, другое соединение, пригодное для связывания и/или транспорта кислорода, неактивный ингредиент (например, стабилизатор, наполнитель и т.д.) или комбинации двух или более из указанного выше. В определенных вариантах осуществления композицию формулируют в виде лиофилизата. Белки H-NOX также можно инкапсулировать в липосомы или наночастицы с использованием хорошо известной технологии. Другие иллюстративные составы, которые можно использовать для белков H-NOX, описаны, например, в патентах США №№ 6974795 и 6432918, каждый из которых, таким образом, полностью включен в качестве ссылки, в частности, в отношении составов белков.

[0188] Композиции, описываемые в настоящем документе, можно вводить как часть состава с длительным высвобождением (например, такого состава, как капсула или губка, которые обеспечивают замедленное высвобождение соединения после введения). Как правило, такие составы можно получать с использованием хорошо известной технологии и вводить, например, посредством пероральной, ректальной или подкожной имплантации или посредством имплантации в желаемый участок-мишень. Составы с длительным высвобождением может содержать белок H-NOX, диспергированный в несущем матриксе и/или содержащийся в резервуаре, окруженном контролирующей скорость высвобождения мембраной. Носители для применения с такими составами являются биосовместимыми, а также могут являться биоразлагаемыми. В определенных вариантах осуществления состав обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения белка H-NOX. Количество белка H-NOX, содержащееся в составе с длительным высвобождением зависит от участка имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и характера состояния, подлежащего лечению или предотвращению.

[0189] В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит эффективное количество белка H-NOX дикого типа или мутантного белка H-NOX. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит эффективное количество полимерного белка H-NOX, содержащего два или более доменов H-NOX дикого типа или мутантных доменов H-NOX. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит эффективное количество рекомбинантного мономерного белка H-NOX, содержащего домен H-NOX дикого типа или мутантный домен H-NOX и домен полимеризации, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления состав содержит тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления состав содержит тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления состав содержит тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления состав содержит пегилированный тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) в количестве, эффективном для модуляции устойчивости опухоли (например, усиления иммунного ответа на опухоль).

[0190] В определенных вариантах осуществления эффективное количество белка H-NOX для введения человеку составляет от нескольких грамм до более чем приблизительно 350 грамм. Другие иллюстративные дозы белка H-NOX включают приблизительно любое количество из 4,4, 5, 10 или 13 г/дл (где г/дл представляет собой концентрацию раствора белка H-NOX до инфузии в систему кровообращения) с подходящей скоростью инфузии, например, приблизительно 0,5 мл/мин (см., например, Winslow, R. Chapter 12 In Blood Substitutes). Следует понимать, что содержание активных ингредиентов в единице, содержащееся в индивидуальной дозе каждой лекарственной формы, не обязательно должно само составлять эффективное количество, так как необходимое эффективное количество можно достичь посредством суммарного действия нескольких введений. Выбор количества белка H-NOX для включения в фармацевтическую композицию зависит от используемой лекарственной формы, подвергаемого лечению состояния и конкретной цели для достижения по определению специалиста в данной области.

[0191] Иллюстративные композиции содержат генетически сконструированные рекомбинантные белки H-NOX, которые можно выделять или очищать, содержащие одну или несколько мутаций, которые совместно обеспечивают измененное связывание лиганда O₂ или NO относительно соответствующего белка H-NOX дикого типа, и функционируют в качестве физиологически совместимого носителя газов в крови млекопитающих. Например, мутантные белки H-NOX, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой полимерный белок H-NOX. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX представляет собой рекомбинантный мономерный белок H-NOX, содержащий домен H-NOX дикого типа или мутантный домен H-NOX и домен полимеризации, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления композиция содержит тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления композиция содержит тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX W9F/L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления композиция содержит тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки. В определенных вариантах осуществления композиция содержит пегилированный тримерный белок H-NOX, содержащий три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX L144F T. tengcongensis и домен сборки.

[0192] Для снижения или предотвращения иммунного ответа у людей, которым вводят фармацевтическую композицию, можно использовать белки H-NOX или домены человека (белки человека дикого типа или белки человека, в которые внесена одна или несколько мутаций) или другие неантигенные белки или домены H-NOX (например, белки H-NOX млекопитающих). Для снижения или устранения иммуногенности белков H-NOX, происходящих из источников, отличных от людей, аминокислоты в белке H-NOX или домене H-NOX можно подвергать мутации в соответствующие аминокислоты в H-NOX человека. Например, в соответствующую аминокислоту в белке H-NOX человека можно подвергать мутации одну или несколько аминокислот на поверхности третичной структуры не принадлежащего человеку белка H-NOX.

Способы модуляции устойчивости опухоли

[0193] В определенных аспектах изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли и, таким образом, его можно использовать при противоопухолевых терапевтических средствах. Гипоксическое микроокружение опухоли подавляет противоопухолевый иммунитет хозяина, модулируя несколько путей передачи сигнала (фиг. 1), включая в качестве неограничивающих примеров передачу сигнала индуцируемым гипоксией фактором (HIF-1) (Codo et al., 2014 Oncotarget, 5(17), 7651-7662; Lee, Mace, & Repasky, 2010 Int. J. Hyperthermia, 26(3), 232-246; Wei et al., 2011 PLoS One, 6(1), e16195), эпигенетическую регуляцию противоопухолевых T-клеток мкРНК, экспрессию MHC1 на опухолевых клетках и привлечение ассоциированных с опухолями макрофагов и происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток (MDSC). Показано, что гипоксическая активация пути HIF-1 активирует пути аденозинэргических A2 и PD-L1, которые в свою очередь подавляют привлечение и накопление хелперных и киллерных T-клеток и NK клеток (Noman et al., 2014 J. Exp. Med., 211(5), 781-790; Ohta et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 103(35), 13132-13137). Также гипоксическая активация пути HIF-1 может приводить к привлечению и активации ингибирующих регуляторных T-клеток (T_рег), ассоциированных с опухолями макрофагов (TAM) и других происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток (MDSC) (Chaturvedi et al., 2014 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 111(20), E2120-2129; Corzo et al., 2010 J. Exp. Med., 207(11), 2439-2453; Wei et al., 2011). Также активация пути HIF-1 может непосредственно подавлять способность распознания опухолевых клеток иммунной системой, увеличивая удаление рецепторов MHC1 опухолью (Siemens et al., 2008 Cancer Res, 68(12), 4746-4753).

[0194] В определенных аспектах изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли у индивидуума с опухолью, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает усиление иммунного ответа на опухоль. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам увеличения инфильтрации лейкоцитов в опухоль индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам увеличения инфильтрации лимфоцитов в опухоль индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль включает увеличение инфильтрации одного или нескольких из CD4 клеток, CD8 клеток или NK клеток. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает усиление процессирования антигена. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает увеличение презентирующих способностей дендритных клеток (DC). В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает один или несколько из увеличения инфильтрации лимфоцитов в опухоль, усиления процессирования антигена или увеличение презентирующих способностей DC. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает активацию лимфоцитов. В определенных вариантах осуществления модуляция устойчивости опухоли включает секрецию цитокинов. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0195] В определенных вариантах осуществления изобретения увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается ингибированием одного или нескольких из T_рег-клеток, ассоциированных с опухолями макрофагов или происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток в опухоли. В определенных вариантах осуществления увеличение инфильтрации лимфоцитов в опухоль сопровождается увеличением экспрессии MHC1 на опухолевых клетках.

[0196] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии HIF-1α в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии HIF-1α. В определенных вариантах осуществления экспрессия HIF-1α снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией HIF-1α в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления экспрессия HIF-1α снижается по сравнению с экспрессией HIF-1α в отсутствие обработки белком-носителем O₂ в течение периода более чем приблизительно любой период из 1 час, 2 час, 3 час, 4 час, 5 час, 6 час, 8 час, 10 час, 12 час, 16 час, 20 час, 24 час, 30 час, 36, час 42 час или 48 час. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0197] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии HIF-1α в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX), где снижение экспрессии HIF-1α определяют как снижение экспрессии фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF). В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии VEGF. В определенных вариантах осуществления экспрессия VEGF снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией VEGF в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления экспрессия VEGF снижается по сравнению с экспрессией VEGF в отсутствие обработки белком-носителем O₂ в течение периода более чем приблизительно любой период из 1 час, 2 час, 3 час, 4 час, 5 час, 6 час, 8 час, 10 час, 12 час, 16 час, 20 час, 24 час, 30 час, 36, час 42 час или 48 час. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0198] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии HIF-1α в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) в настоящем документе снижение экспрессии HIF-1α определяют как снижение экспрессии переносчика глюкозы типа 1(Glut1). В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии Glut1. В определенных вариантах осуществления экспрессия Glut1 снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией Glut1 в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления экспрессия Glut1 снижается по сравнению с экспрессией Glut1 в отсутствие обработки белком-носителем O₂ в течение периода более чем приблизительно любой период из 1 час, 2 час, 3 час, 4 час, 5 час, 6 час, 8 час, 10 час, 12 час, 16 час, 20 час, 24 час, 30 час, 36, час 42 час или 48 час. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0199] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии PD-L1 в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии PD-L1. В определенных вариантах осуществления экспрессия PD-L1 снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией PD-L1 в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению взаимодействия PD-L1 с PD-1. В определенных вариантах осуществления взаимодействие PD-L1 с PD1 снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению со взаимодействием PD-L1 с PD1 в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления экспрессия PD-L1 снижается по сравнению с экспрессией PD-L1 в отсутствие обработки белком-носителем O₂ в течение периода более чем приблизительно любой период из 1 час, 2 час, 3 час, 4 час, 5 час, 6 час, 8 час, 10 час, 12 час, 16 час, 20 час, 24 час, 30 час, 36, час 42 час или 48 час. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0200] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии A2AR в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии A2AR. В определенных вариантах осуществления экспрессия A2AR снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией A2AR в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению взаимодействия A2AR с аденозином. В определенных вариантах осуществления взаимодействие A2AR с аденозином снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению со взаимодействием A2AR с аденозином в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления экспрессия A2AR снижается по сравнению с экспрессией A2AR в отсутствие обработки белком-носителем O₂ в течение периода более чем приблизительно любой период из 1 час, 2 час, 3 час, 4 час, 5 час, 6 час, 8 час, 10 час, 12 час, 16 час, 20 час, 24 час, 30 час, 36, час 42 час или 48 час. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0201] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам снижения экспрессии HIF-2α в опухоли индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX). В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии HIF-2α. В определенных вариантах осуществления экспрессия HIF-2α снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией HIF-2α в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления введение эффективного количества полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) индивидууму приводит к снижению экспрессии HIF-2α. В определенных вариантах осуществления экспрессия HIF-2α снижается более чем приблизительно на любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с экспрессией HIF-2α в отсутствие обработки полипептидом-носителем O₂. В определенных вариантах осуществления экспрессия HIF-2α снижается по сравнению с экспрессией HIF-2α в отсутствие обработки белком-носителем O₂ в течение периода более чем приблизительно любой период из 1 час, 2 час, 3 час, 4 час, 5 час, 6 час, 8 час, 10 час, 12 час, 16 час, 20 час, 24 час, 30 час, 36, час 42 час или 48 час. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой тримерный полипептид H-NOX L144F Tt. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ представляет собой пегилированный тримерный полипептид H-NOX L144F Tt.

[0202] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли (например, усилению иммунного ответа на опухоль) у индивидуума любым из способов, описываемых в настоящем документе. Примеры опухолей в качестве неограничивающих примеров включают опухоль головного мозга, глиобластому, опухоль кости, опухоль поджелудочной железы, опухоль кожи, опухоль головы или шеи, меланому, опухоль легкого, опухоль матки, опухоль яичника, колоректальную опухоль, опухоль ануса, опухоль печени, печеночноклеточную карциному, опухоль желудка, опухоль яичка, опухоль эндометрия, опухоль шейки матки, опухоль влагалища, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, опухоль пищевода, опухоль кишечника, опухоль щитовидной железы, опухоль надпочечника, опухоль мочевого пузыря, опухоль почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточную опухоль.

[0203] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли (например, усилению иммунного ответа на опухоль) у индивидуума любым из способов, описываемых в настоящем документе, таким образом, предоставляя способы лечения злокачественной опухоли у индивидуума. Примеры злокачественных опухолей, которые можно лечить способами по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают злокачественную опухоль головного мозга, глиобластому, злокачественную опухоль кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, меланому, рак легких, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ануса, рак печени, печеночноклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак эндометрия, рак шейки матки, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак кишечника, рак щитовидной железы, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак почки, рак молочной железы, множественную миелома, саркому или плоскоклеточный рак.

[0204] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам модуляции устойчивости опухоли у индивидуума любым из способов, описываемых в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее, например, человека. В определенных вариантах осуществления млекопитающее представляет собой домашнее животное, лабораторное животное или сельскохозяйственное животное. Неограничивающие примеры домашних животных, лабораторных животных или сельскохозяйственных животных включают собак, кошек, лошадей, обезьян, кроликов, крыс, мышей, морских свинок, хомяков, свиньей и коров.

[0205] Полипептиды-носители O₂ можно вводить любым маршрутом, включая в качестве неограничивающих примеров внутривенное, внутриартериальное, внутриопухолевое, внутрипузырное, ингаляционное, интраперитонеальное, внутрилегочное, внутримышечное, подкожное, интратрахеальное, трансмукозальное, внутриглазное, интратекальное или трансдермальное введение.

[0206] В определенных аспектах необходима длительная доставка кислорода в опухоль для ингибирования опосредуемой гипоксией устойчивости опухоли и усиления иммунного ответа на опухоль. В определенных вариантах осуществления изобретения введение полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) повторяют. Введение полипептида-носителя O₂ можно повторять до установления устойчивого иммунного ответа на опухоль. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ повторяют по меньшей мере приблизительно любое количество из двух раз, трех раз, четырех раз, пяти раз, шести раз, семи раз, восьми раз, девяти раз, десяти раз, двенадцати раз, четырнадцати раз, двадцати раз, тридцати раз, сорока раз, пятидесяти раз или ста раз. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ повторяют приблизительно от двух раз до приблизительно двадцати раз. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ повторяют в любом количестве из приблизительно от двадцати раз до приблизительно сорока раз, любом количестве от приблизительно сорока раз до приблизительно шестидесяти раз, любом количестве от приблизительно шестидесяти раз до приблизительно восьмидесяти раз, любом количестве от приблизительно восьмидесяти раз до приблизительно ста раз или в любом количестве раз между ними. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ повторяют раз в сутки или дважды в сутки в течение периода приблизительно от 42 до приблизительно 84 введения.

[0207] Иллюстративные частоты дозирования в качестве неограничивающих примеров включают по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 раз (например, ежесуточно) в неделю. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) вводят по меньшей мере 2, 3, 4 или 6 раз в сутки. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят каждые четыре, каждые 8, каждые 12, каждые 24 часов, каждые 48 часов или два раза в неделю или три раза в неделю. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят любое количество от одного часа до двух часов, от двух часов до четырех часов, от четырех часов до восьми часов, от восьми часов до двенадцати часов или от двенадцати часов до 24 часов. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят каждые четыре, каждые 8, каждые 12 или каждые 24 часов в течение периода приблизительно от одних до приблизительно 10 суток. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ можно вводить, например, в течение периода нескольких суток или недель. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят в течение более длительного периода, такого как несколько месяцев или лет. Частоту дозирования композиций можно регулировать в течение курса лечения на основе решения осуществляющего введение врача.

[0208] В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) вводят в виде болюсного введения. В определенных вариантах осуществления объем болюсного препарата составляет более чем приблизительно любое количество из 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл, 20 мл, 25 мл, 50 мл, 75 мл или 100 мл. В определенных вариантах осуществления введение болюсную дозу повторяют, как указано выше.

[0209] В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) вводят посредством инфузии. В определенных вариантах осуществления инфузии проводят в течение периода большего, чем приблизительно любой период из 15 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 16 часов, 20 часов или 24 часов. В определенных вариантах осуществления инфузии проводят в течение любого периода приблизительно от 15 минут до 30 минут, от 30 минут до 1 часа, от 1 часа до 2 часов, от 2 часов до 3 часов, от 3 часов до 4 часов, от 4 часов до 5 часов, от 5 часов до 6 часов, от 6 часов до 7 часов, от 7 часов до 8 часов, от 8 часов до 9 часов, от 9 часов до 10 часов, от 10 часов до 12 часов, от 12 часов до 16 часов, от 16 часов до 20 часов или от 20 часов до 24 часов. В определенных вариантах осуществления скорость инфузии является большей чем любое значение приблизительно из 1 мл/час, 2 мл/час, 3 мл/час, 4 мл/час, 5 мл/час, 6 мл/час, 7 мл/час, 8 мл/час, 9 мл/час, 10 мл/час, 20 мл/час, 30 мл/час, 40 мл/час, 50 мл/час, 60 мл/час, 70 мл/час, 80 мл/час, 90 мл/час, 100 мл/час, 200 мл/час, 300 мл/час, 400 мл/час, 500 мл/час, 600 мл/час, 700 мл/час, 800 мл/час, 900 мл/час, 1000 мл/час, 2000 мл/час, 3000 мл/час, 4000 мл/час, 5000 мл/час, 6000 мл/час, 7000 мл/час, 8000 мл/час, 9000 мл/час, 10000 мл/час или любая скорость между ними. В определенных вариантах осуществления инфузию повторяют, как указано выше.

[0210] В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) вводят в дозе, большей чем приблизительно любое значение из 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 35 мг/кг, 40 мг/кг, 45 мг/кг, 50 мг/кг, 55 мг/кг, 60 мг/кг, 65 мг/кг, 70 мг/кг, 75 мг/кг, 80 мг/кг, 85 мг/кг, 90 мг/кг, 95 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/кг, 400 мг/кг, 500 мг/кг, 600 мг/кг, 700 мг/кг, 800 мг/кг, 900 мг/кг, 1000 мг/кг или любая доза между ними. В определенных вариантах осуществления дозу вводят в виде одного или нескольких болюсных введений. В определенных вариантах осуществления дозу вводят в виде одной или нескольких инфузий. В определенных вариантах осуществления дозу вводят в виде более чем одного введения (например, дозу 100 мг/кг можно вводить двумя дозами по 50 мг/кг).

[0211] В определенных вариантах осуществления изобретения полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) используют в комбинации с лучевой терапией. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму за любой период по меньшей мере из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 часов перед радиационным облучением. В определенных вариантах осуществления радиационное облучение представляет собой рентгеновское облучение. В определенных вариантах осуществления доза рентгеновского облучения представляет собой любую дозу приблизительно от 0,5 Гр до приблизительно 75 Гр. В определенных вариантах осуществления цикл введения полипептида-носителя O₂ и проведения радиационного облучения повторяют любое количество из одного, двух, трех, четырех, пяти или шести раз. В определенных вариантах осуществления цикл введения полипептида-носителя O₂ и проведения радиационного облучения повторяют после любого периода приблизительно из одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель, пяти недель или шести недель. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и лучевую терапию используют в сочетании с другой терапией, например, химиотерапией и/или иммунотерапией.

[0212] В определенных вариантах осуществления изобретения полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) используют в комбинации с химиотерапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой цитотоксин. Химиотерапевтические средства, включающие цитотоксины, известны в данной области. В определенных вариантах осуществления цитотоксин представляет собой алкилирующее средство. В определенных вариантах осуществления цитотоксин представляет собой циклофосфамид или темозоломид. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят перед введением химиотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят совместно с введением химиотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят после введения химиотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму в течение любого периода по меньшей мере из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 часов или вводят раз в сутки или дважды в сутки в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток перед введением химиотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму через любой период по меньшей мере из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 или 24 часов после введения химиотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или введение химиотерапевтического средства повторяют любое количество из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти раз или более десяти раз. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или введение химиотерапевтического средства повторяют после любого периода приблизительно из одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель, пяти недель или шести недель. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и химиотерапевтического средства проводят в одном и том же цикле дозирования. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и химиотерапевтического средства проводят в разных циклах дозирования. В определенных вариантах осуществления введение H-NOX и проведение лучевой терапии используют в сочетании с другой терапией, например, лучевой терапией и/или иммунотерапией.

[0213] В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ (например, белок H-NOX) вводят пациентам со злокачественными опухолями до и/или в сочетании с иммунотерапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой одно или несколько из вакцины против злокачественной опухоли, терапии адоптивными иммуноцитами, средства, мишенью которого является регулятор контрольной точки иммунного ответа, онколитического вируса или BiTE. В определенных вариантах осуществления мишенью иммунотерапии являются один или несколько из CTLA-4, PD1, PD-L1 или регулятора контрольной точки иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой двойное блокирующее PD1/CTLA-4 терапевтическое средство. В определенных вариантах осуществления иммунотерапия представляет собой обработку PDL-1 для пациентов с опухолями PD-L1+ или двойную блокаду PD1/PD-L1. Неограничивающие примеры в качестве неограничивающих примеров включают антагонисты PD-1 и PDL-1, такие как антитела (например, ниволумаб). В определенных вариантах осуществления ингибитор контрольной точки представляет собой антагонист CTLA4, такой как антитело (например, ипилимумаб). В определенных вариантах осуществления иммунотерапия представляет собой терапию адоптивными T-клетками, включая в качестве неограничивающих примеров T-клетки с химерным антигенным рецептором (например, CAR-T-клетки) или T-клетки со сконструированным TCR. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой привлекающие T-клетки биспецифические активаторы (BiTE). В определенных вариантах осуществления иммунотерапия включает одно или несколько из терапии против гена активации лимфоцитов 3 (LAG-3), терапию против T-клеточного содержащего иммуноглобулиновый и муциновый домены белка 3 (TIM-3), терапию против киллерных иммуноглобулин-подобных рецепторов (KIR), терапию агонистами/стимуляторами против 4-1BB (CD137) или терапию агонистами/стимуляторами индуцируемого глюкокортикоидами родственного с семейством TNFR гена (GITR) - каждую по-отдельности или в комбинации друг с другом и/или в комбинации с одним или несколькими из PD1, PDL-1, CTLA-4 или другими терапевтическими средствами.

[0214] Неограничивающие примеры терапевтических средств, мишенью которых являются белки контрольных точек, отличные от негативных регуляторов PD-1/PDL-1 и CTLA4, включают позитивные и негативные (ингибиторы контрольных точек) регуляторы иммунного ответа и могут представлять собой антитела или низкомолекулярные соединения, такие как ингибиторы пути IDO (индоламин-2,3-диоксигеназы), такие как прямые ингибиторы ферментативной активности IDO (например, NLG919), ингибиторы пути эффекторов IDO (например, D-1-метилтриптофан, индоксимод, NLG8189), ингибиторы TDO (триптофан-2,3-диоксигеназы) или двойные ингибиторы IDO-TDO; антагонисты антител к гену активации лимфоцитов 3 (LAG-3, CD223) (например, IMP321, BMS-986016); антагонисты киллерных иммуноглобулин-подобных рецепторов (KIR), такие как антитела (например, лирилумаб, IPH2101); антагонисты T-клеточного содержащего иммуноглобулиновый и муциновый домены белка 3 (TIM-3), такие как антитела; антагонисты аттенюатора B- и T-клеток (BTLA, CD272), такие как антитела; агонисты OX40 (CD134), такие как активирующие/стимулирующие антитела; агонисты 4-1BB (CD137), такие как стимулирующие антитела (например, BMS-663513); агонисты индуцируемого глюкокортикоидами родственного с семейством TNFR гена (GITR), такие как стимулирующие антитела (например, TRX518) и онколитические вирусы.

[0215] В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят перед введением иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят совместно с введением иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят после введения иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму за любой период по меньшей мере из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 или 48 часов перед введением иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму за любой период по меньшей мере из 3, 4, 5, 6, 7 или более суток перед введением иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму через любой период по меньшей мере из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 или 48 часов после введения иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления полипептид-носитель O₂ вводят индивидууму через любой период по меньшей мере из 3, 4, 5, 6, 7 или более суток после введения иммунотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или введение иммунотерапевтического средства повторяют любое количество из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти раз или более десяти раз. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и/или введение иммунотерапевтического средства повторяют через любой период из приблизительно одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель, пяти недель или шести недель. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и иммунотерапевтического средства проводят в одном и том же цикле дозирования. В определенных вариантах осуществления введение полипептида-носителя O₂ и иммунотерапевтического средства проводят в различных циклах дозирования. В определенных вариантах осуществления введение H-NOX и проведение лучевой терапии используют в сочетании с другой терапией, например, лучевой терапией и/или химиотерапией.

[0216] В определенных вариантах осуществления эффективность введения полипептида-носителя O₂ (например, белка H-NOX) контролируют, например, но не ограничиваясь, по гипоксии опухоли, экспрессии ассоциированных с гипоксией опухолевых супрессоров и/или активаторов, присутствию ассоциированных с опухолью иммуноцитов и/или иммуноцитов, направленных к опухолевым клеткам, и/или локальным (опухолевая биопсия, биопсия лимфоузлов) или системным (например, периферическая кровь) профилями цитокинов и иммуноцитов. Способы определения уровня гипоксии опухоли известны в данной области. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают определения любого из захвата опухолью ¹⁸F-фтормизонидазола (FMISO), захвата пимидазола, захвата ¹⁸F-фторазомицинарабинозида (FAZA), захвата нитроимидазола, захвата медь(II)-диацетил-бис(N4-метилтиосемикарбазона (Cu-ATSM), захвата гексафторбензола (C₆F₆) посредством ¹⁹F магнитно-резонансной томографии, захвата гексаметилдисилоксана посредством ¹H MRI, экспрессии опухолью HIF-1α, экспрессии опухолью HIF-2α, экспрессии опухолью HIF-3α, экспрессии опухолью Glut-1, pH опухоли (pH-взвешенная MRI) qBOLD, OE-MRI, MOBILE MRI экспрессии LDHA опухолью, экспрессии опухолью карбоангидразы IX (CA-9), экспрессии VEGF или уровней лактата и/или пирувата. В определенных вариантах осуществления способы мониторинга, лечения и оптимизации терапии, описанные выше, гипоксию опухоли измеряют посредством захвата ¹⁸F-FMISO. В определенных вариантах осуществления захват ¹⁸F-FMISO измеряют посредством проведения позитронно-эмиссионной томографии (PET), компьютерной томографии (CT) или компьютерной аксиальной томографии (CAT). Способы детекции экспрессии генов, таких как HIF-1α, PD-L1 и A2AR, известны в данной области, например, посредством иммунологического анализа, иммуногистохимии, количественной ПЦР, гибридизации (например, на генном чипе) и т.п.

Наборы с белками H-NOX

[0217] Также предоставлены промышленные изделия и наборы для модуляции устойчивости опухоли у индивидуума. В определенных вариантах осуществления промышленное изделие или набор содержит любой из полипептидов-носителей O₂, включая любой из белков H-NOX, описываемых в настоящем документе, включая полимерные белки H-NOX и пегилированные полимерные белки H-NOX, и подходящую упаковку. В определенных вариантах осуществления изобретение включает набор с (i) белком H-NOX (таким как белок H-NOX дикого типа или мутантный белок H-NOX, описываемые в настоящем документе, или их составы, как описано в настоящем документе) и (ii) инструкции по применению набор для доставки O₂ индивидууму.

[0218] Подходящие упаковки для композиций, описываемых в настоящем документе, известны в данной области и включают, например, флаконы (например, запаянные флаконы), сосуды, ампулы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, запаянные майларовые или пластиковые пакеты) и т.п. Эти промышленные изделия можно дополнительно стерилизовать и/или герметизировать. Также предоставлены стандартные лекарственные формы, содержащие композиции, описываемые в настоящем документе. Эти стандартные лекарственные формы можно хранить в подходящей упаковке в одной или нескольких единицах дозирования, а также можно дополнительно стерилизовать и герметизировать. Инструкции, предоставляемые в наборах по изобретению, как правило, представляет собой письменные инструкции на ярлыке или вкладыше в упаковку (например, лист бумаги, включенный в набор), но также допустимы машиночитаемые инструкции (например, инструкции на магнитном или оптическом дисковом запоминающем устройстве). Как правило, инструкции, относительно применения белков H-NOX включают информацию о дозировках, схеме дозирования и маршруте введения для назначенного введения или промышленного применения. Дополнительно набор может содержать описание выбора индивидуума, подходящего для лечения.

[0219] Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, упаковка партиями (например, упаковки нескольких доз) или субъединичные дозы. Например, наборы также можно предоставлять так, чтобы они содержали достаточные дозы белков H-NOX, описываемых в настоящем документе, для обеспечения эффективного лечения индивидуума в течение длительного периода, например, приблизительно любого периода из недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 6 недель, 8 недель, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев или более. Наборы также могут включать несколько стандартных доз белков H-NOX и инструкции по применению и могут быть упакованы в количествах, достаточных для хранения и применения в фармацевтических учреждениях, например, больничных аптеках и производственных аптеках. В определенных вариантах осуществления набор содержит сухую (например, лиофилизированную) композицию, которую можно восстанавливать, ресуспендировать или разводить водой, как правило, с формированием стабильной водной суспензии белка H-NOX.

Иллюстративные способы получения белков H-NOX

[0220] Как указано выше, известны последовательности нескольких белков и нуклеиновых кислот H-NOX дикого типа и их можно использовать для получения мутантных доменов и нуклеиновых кислот H-NOX по настоящему изобретению. Способы мутирования, экспрессии и очистки рекомбинантных белков H-NOX описаны, например, в Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59 и Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211, патентах США №№ 8404631 и 8404632, WO 2007/139791 и WO 2007/139767, которые, таким образом, полностью включены в качестве ссылки, в частности в отношении мутирования, экспрессии и очистки рекомбинантных белков H-NOX. Эти способы или другие стандартные способы можно использовать для получения любого мутантного белка H-NOX.

[0221] Мутантную нуклеиновую кислоту H-NOX можно стандартными способами встраивать в вектор, такой как экспрессирующий вектор. Например, для расщепления мутантной нуклеиновой кислоты H-NOX и вектора можно использовать рестрикционные ферменты. Затем, совместимые концы расщепленной мутантной нуклеиновой кислоты H-NOX и расщепленного вектора можно лигировать. Полученный вектор для экспрессии кодируемого белка H-NOX можно стандартными способами (например, электропорацией) вводить в клетку (например, клетку насекомого, клетку растения, дрожжевую клетку или бактериальную клетка).

[0222] В частности, гетерологичные белки экспрессировали в ряде биологических экспрессирующих систем, таких как клетки насекомых, клетки растений, дрожжевые клетки и бактериальные клетки. Таким образом, для получения больших количеств рекомбинантного белка H-NOX можно использовать любую подходящую экспрессирующую белки биологическую систему. В определенных вариантах осуществления белок H-NOX (например, мутантный белок H-NOX или белок H-NOX дикого типа) представляет собой выделенный белок.

[0223] При желании, белки H-NOX можно очищать стандартными способами. В определенных вариантах осуществления белок по меньшей мере приблизительно на 60% по массе, очищен от других компонентов, которые присутствуют при получении белка. В различных вариантах осуществления белок является по меньшей мере приблизительно на 75%, 90% или 99% по массе чистым. Очищенный белок можно получать, например, посредством очистки (например, экстракции) из природного источника, рекомбинантной экспрессирующей системы или реакционной смеси после химического синтеза. Иллюстративные способы очистки включают иммунопреципитацию, хроматографию на колонке, такую как иммуноаффинная хроматография, иммуноаффинную очистку на магнитных гранулах и пэннинг со связанным на планшете антителом, а также другие способы, известные специалисту в данной области. Чистоту можно оценивать любым подходящим способом, например, посредством хроматографии на колонке, электрофореза в полиакриламидном геле или анализа ВЭЖХ. В определенных вариантах осуществления очищенный белок добавляют в фармацевтическую композицию по изобретению или используют в способе по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению в дополнение к очищенному белку может содержать добавки, носители или другие компоненты.

[0224] В определенных вариантах осуществления полимерный белок H-NOX содержит одну или несколько меток His₆. Белок H-NOX, содержащий по меньшей мере одну метка His₆ можно очищать с использованием хроматографии, например, с использованием Ni²⁺-аффинной хроматографии. После очистки метку His₆ можно удалять, например, с использованием экзопептидазы. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к очищенному полимерному белку H-NOX, где полимерный белок H-NOX очищали посредством использования метки His₆. В определенных вариантах осуществления очищенный белок H-NOX обрабатывают экзопептидазой с удалением метки His₆.

[0225] В определенных вариантах осуществления белок H-NOX содержит одну или несколько молекул полиэтиленгликоля (например, является пегилированным). Способы получения пегилированных белков известны в данной области.

ПРИМЕРЫ

[0226] В примерах, которые предназначены исключительно для иллюстрации изобретения и которые, таким образом, не следует рассматривать, как каким-либо образом ограничивающие изобретение, также описаны и подробно изложены аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные выше. Примеры не предназначены для представления того, что описанные ниже эксперименты являются всеми проведенными экспериментами или только проведенными экспериментами. Если не указано иначе, температура приведена в градусах Цельсия, а давление являлось атмосферным или близким к нему.

Пример 1. H-NOX обеспечивает эффективную оксигенацию гипоксического микроокружения опухоли

[0227] Пегилированный тримерный H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (Tt.) с заменой L144F в дистальном кармане (фиг. 6B) оценивали на способность оксигенировать микроокружение опухоли и увеличивать чувствительность к радиационному облучению. Введение пегилированного тримерного H-NOX L144F Tt мышам, несущим гипоксические опухоли, индуцирует быструю и длительную оксигенацию опухолей, как непосредственно определяли посредством внешнего маркера гипоксии, пимонидазола, индуцируемого гипоксией фактора транскрипции 1 альфа, HIF-1-α и чувствительного к кислороду нановолокна OxyLite (фиг. 2 и 3, соответственно).

[0228] Мышам, несущим подкожный ксенотрансплантат опухоли H460, когда объем опухоли достигал ≈300-350 мм³ (через ≈10-14 суток после подкожной имплантация опухолевых клеток) в/в инъецировали пегилированный тример H-NOX (L144F) при концентрации 650 мг/кг. Перед умерщвлением мышам инъецировали экзогенный маркер гипоксии пимонидазол при концентрации 60 мг/кг и выделяли опухоли. Уровни пимонидазола (фиг. 2A) (Hypoxyprobe-1) и HIF-1α (фиг. 2B) определяли посредством конкурентного (пимонидазол) и сэндвич (HIF-1α, Abcam) ELISA, соответственно. Диаграммы демонстрируют количественный анализ сигналов пимонидазола и HIF-1α после введения пегилированного H-NOX (L144F). Носитель, 1 час и 4 час: n=22, 7 час: n=18, 12 час: n=16, 24 час: n=6. Результаты 4 независимых экспериментов. Средние значения +/- SEM. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p<0,01, * p<0,05 посредством одностороннего ANOVA и апостериорных тестов Бонферрони. (фиг. 2C) Опухоли оценивали по накоплению пегилированного H-NOX (L144F) посредством сэндвич-ELISA H-NOX через 1, 4, 7, 16 и 24 часов после инъекции и результаты приводят на грамм опухолевой ткани. Самкам мышей Nu/Nu в возрасте семи-восьми недель подкожно имплантировали 3 × 10⁶ клеток рака легкого человека H460 и наблюдали до достижения опухолью среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток). Мышам, несущим ксенотрансплантат опухоли объемом 200-350 мм³, в/в инъецировали болюсную дозу носителя (состав буфера: 50 мМ сукцинат, 50 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 10 мМ восстановленный глутатион при pH 7) или состав буфера, содержащий containing 650 мг/кг пегилированного тримера H-NOX (L144F). Для определения гипоксии опухоли перед умерщвлением мышам инъецировали экзогенный маркер гипоксии пимонидазол при концентрации 60 мг/кг. Опухоли выделяли и гомогенизировали в буфере для экстракции (набор Abcam № ab117996), дополненном антипротеазами. Концентрацию белка в каждой опухоли количественно определяли посредством анализа по Брэдфорду. Образцы оценивали на количество пимонидазола (Hypoxyprobe-1) с использованием конкурентного ELISA, разработанного Omniox, а на HIF-1α с использованием набора для ELISA Abcam (ab117996).

[0229] в модели H460 карциномы легкого на мышах максимальной оксигенации достигали через период от 4 час до 8 час и это коррелировало с пиком накопления H-NOX (L144F) в опухоли по оценкам ELISA (фиг. 2C).

[0230] Для оценки накопления H-NOX (L144F) в опухоли, опухоли после инъекции выделяли в различные моменты времени. Опухоли гомогенизировали в буфере для экстракции (набор Abcam № ab117996), дополненном антипротеазами, и концентрацию белка в каждой опухоли количественно определяли посредством анализа по Брэдфорду. Концентрацию пегилированного H-NOX (L144F) количественно определяли посредством сэндвич-ELISA для H-NOX, разработанного Omniox и нормализовали на массу опухоли.

[0231] Хотя дополнительная оксигенация животных успешно увеличивала оксигенацию опухолевой ткани мыши при концентрации кислорода 0,67-1,33 Па, она не влияла на области с более низкими уровнями кислорода (<0,67 Па). В отличие от этого, пегилированный тример H-NOX L144F Tt способен увеличивать оксигенацию даже в очень гипоксической опухолевой ткани (<0,67 Па). Вероятно это происходит вследствие превосходного проникновения пегилированного тримера H-NOX L144F Tt в ткани, что обеспечивает доставку кислорода в области, вне пределов диффузии кислорода по градиенту. Кроме того, хотя максимума дополнительной оксигенации опухолей мышей достигали, непрерывно подвергая животных дыханию 95%-100% кислородом [увеличивая риск гипероксического и воспалительного повреждения нормальных тканей (Kallet & Matthay, 2013 Respir Care, 58(1):123-141; Thiel et al., 2005 PLoS Biol, 3(6), e174)], единственная болюсная в/в доза пегилированного тримера H-NOX L144F Tt может поддерживать оксигенацию ткани в течение периода более 7 часов без повышения уровней кислорода в нормальных тканях. Контрольный белок H-NOX Tt (вариант дикого типа), который не способен к высвобождению кислорода при концентрациях кислорода, присутствующих в гипоксических тканях, не оказывал никакого влияния на оксигенацию опухолей (фиг. 3C).

[0232] Самкам мышей Nu/Nu в возрасте семи-восьми недель подкожно имплантировали 3 × 10⁶ клеток рака легкого человека H460 и наблюдали до достижения опухолям среднего размера ≈500 мм³ (10-18 суток после имплантации опухолевых клеток). Мышей, несущих опухоли H460 анестезировали изофлураном, смешанным с 20% кислорода и в подкожный ксенотрансплантат опухоли H460 имплантировали зонд OxyLite™ (Oxford Optronix, UK) с использованием микроманипулятора. OxyLite™ состоит из красителя хлорида рутения, находящегося в полимерном матриксе 230 мкм в диаметре на конце. После уравновешивания в течение ≈20-30 минут измеряли pO₂ с использованием оптических флуоресцентных датчиков, присоединенных к четырехканальному блоку. Низкий начальный pO₂ подтвердил проникновение в гипоксическую ткань из близлежащих кровеносных сосудов (≈26,7 Па; за исключением фиг. 3D, где наблюдали 0,67 Па). После имплантации зонда зонд оставляли на период ≈20-30 мин для стабилизации измерений pO₂, и мышам давали вдыхать 100% O₂ (фиг. 3B, фиг. 3D) или им инъецировали пегилированный H-NOX (L144F на фиг. 3A, дикого типа на фиг. 3C) и регистрировали гашение флуоресценции.

[0233] Превосходную способность пегилированного тримера H-NOX L144F Tt доставлять кислород в гипоксические области опухоли относительно введения гипероксического газа дополнительно демонстрировали более эффективным радиационным уничтожением опухолевых клеток (фиг. 4).

[0234] Мышей, несущим подкожный ксенотрансплантат опухоли H460 (200-350 мм³) обрабатывали 10 Гр отдельно или в комбинации с 650 мг/кг пегилированного тримера H-NOX (L144F), в/в инъецируемого за 7 часов перед облучением. После облучения опухоли выделяли и обрабатывали для клоногенного анализа. Через 10-14 суток подсчитывали количества клеток в тройных образцах из каждой опухоли. Каждая точка на диаграмме представляет среднее жизнеспособной фракции для одной опухоли. Средние значения +/- SEM (n=3 на эксперимент). Самкам мышей Nu/Nu в возрасте семи-восьми недель подкожно имплантировали 3 × 10⁶ клеток рака легкого человека H460 и наблюдали до достижения опухолям среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток). Мышей, несущим ксенотрансплантат опухоли объемом 200-350 мм³, облучали 10 Гр отдельно или в комбинации с внутривенной доставкой болюсного носителя (состав буфера: 50 мМ сукцинат, 50 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 10 мМ восстановленный глутатион при pH 7) или состава буфера, содержащего 650 мг/кг пегилированного H-NOX (L144F). После облучения мышей умерщвляли и опухоли выделяли и обрабатывали для клоногенного анализа ex vivo. В кратком изложении, клеточный опухоли разрезали на небольшие фрагменты скальпелем и проводили расщепление в течение ≈30 минут с использованием ферментативной смеси, содержащей смесь коллагеназы (200 Ед/мл), гиалуронидазы (200 Ед/мл) и ДНКазы (10 мл смеси/г опухоли). Затем выделенные клетки подсчитывали и высевали при 500/125/25 клеток на лунку для необработанных образцов и 2000/500/100 клеток на лунку для облученных образцов в 6-луночный планшет в двух повторениях. Через 10-12 суток клеточные колонии фиксировали PFA и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Количество клонов (более 50 клеток) подсчитывали и рассчитывали эффективность посева в необработанных образцах (количество подсчитанных клеток в лунке ÷ количество высеянных клеток × 100). Во всех образцах рассчитывали жизнеспособную фракцию (количество подсчитанных клеток ÷ эффективность посева × 100).

[0235] После введения пегилированного тримера H-NOX L144F Tt во всех обработанных пегилированным тримером H-NOX L144F Tt опухолях выявили увеличение эффективность радиационной обработки >15 раз, что снижало жизнеспособную фракцию опухолевых клеток с 30% в обработанной только 10 Гр группе до <2% в предварительно обработанной H-NOX (L144F) опухоли. В том же эксперимента обработка мышей, несущих опухоли, 100% кислородом продемонстрировала переменное увеличение радиационной эффективности (≈3 раза), вероятно являющееся результатом неравномерной оксигенация опухоли в отдельных опухолях, вероятно вследствие неравной плотности сосудов в опухолях.

Пример 2. H-NOX действует в качестве иммуноактиватора, усиливая противоопухолевый ответ хозяина

[0236] Индуцированная пегилированным тримером H-NOX L144F Tt оксигенация ингибирует путь HIF-1α (фиг. 2B) и снижает зависимую от HIF-1α и независимую от HIF-1α иммуносупрессию опухоль. Мышей, несущих подкожный ксенотрансплантат опухоли H460 (200-350 мм³) обрабатывали только носителем или пегилированным тримером H-NOX (L144F) и проводили сбор через 7, 16 или 24 часов после инъекции для анализа кПЦР-РВ. Средние значения +/- SEM. N=5-6 в группе, * p<0,05 посредством t-критерия. Обработка однократной дозой H-NOX приводила к значимому ингибированию HIF-1α и его эффекторов, включая прямые и непрямые модуляторы иммунного ответа хозяина: передачу сигнала PD/PDL-1 и VEGF, регуляторов метаболического и фактора роста (фиг. 5).

[0237] Самкам мышей Nu/Nu в возрасте семи-восьми недель подкожно имплантировали 3 × 10⁶ клеток рака легкого человека H460 и наблюдали до достижения опухолям среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток). Мышам, несущим ксенотрансплантат опухоли объемом 200-350 мм³, инъецировали болюсный носитель (состав буфера: 50 мМ сукцинат, 50 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 10 мМ восстановленный глутатион при pH 7) или состав буфера, содержащий 650 мг/кг пегилированного тримера H-NOX (L144F). Для получения образцов для анализа кПЦР-РВ, мышей умерщвляли и вырезали опухоли. из образцов опухолей выделяли тотальную РНК с использованием набора RNeasy (QIAGEN) по инструкциям производителя. Обратную транскрипцию и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили в системе StepOnePlus™ Real-Time PCR (Applied Biosystems), как описано. Получали 25 мкл реакционной смеси с использованием 2 мкл матричной кДНК, 12,5 мкл готовой смеси для ПЦР SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и 1 мкл следующих смысловых и антисмысловых праймеров: VEGF: прямой, 5'-CAATCGAGACCCTGGTGGA-3' (SEQ ID NO:23); обратный, 5'-GCACACACTCCAGGCCCT-3' (SEQ ID NO:24); Glut1: прямой, 5'-CAACCAGACATGGGTCCAC-3' (SEQ ID NO:25); обратный, 5'-GTTAACGAAAAGGCCCACAGA-3' (SEQ ID NO:26); PD-L1: прямой, 5'-GTTGTGGATCCAGTCACCTCT-3' (SEQ ID NO:27); обратный, 5'-GATTCTCAGTGTGCTGGTCAC-3'(SEQ ID NO:28); L7: прямой, 5'-CAAGGAGGAAGCTTATCTATGAA-3'(SEQ ID NO:29); обратный, 5'-ATTTGACGAAGGCGAAGAAGCT-3' (SEQ ID NO:30). Условия термоциклирования являлись следующим: начальный этап представлял собой 10 мин при 95°C, затем 40 циклов по 15 сек денатурации при 95°C с последующей 1 мин отжига и удлинения при 60°C. Результаты анализировали с использованием программного обеспечения StepOne v2.0 с использованием сравнительного способа CT. Транскрипты представляющих интерес генов нормализовали по транскриптам гена домашнего хозяйства рибосомального белка L7 мыши, и представляли в виде кратности изменения относительно содержания транскрипта L7.

[0238] Например, опосредованное пегилированным тримером H-NOX L144F Tt ингибирование HIF-1α и передачу сигнала аденозинэргических A2AR может приводить к активации и привлечению эффекторных T-клеток в опухолевой ткани, что приводит к увеличенной инфильтрации опухоли лимфоцитами, снижению метастатического роста опухоли и регрессу опухоли. Кроме того, индуцируемая H-NOX оксигенация опухолей может снижать уклонение опухолевых клеток от иммунной системы, ингибируя несколько зависимых от гипоксии механизмов, включая снижение уровня MHC1 и активацию экспрессии PDL-1 на поверхности клеток опухоли, и активацию и привлечение происходящих из миелоидной ткани супрессорных клеток (MDSC), включая TAM, которые прямо подавляют иммунные эффекторные клетки, а также стимулируют ангиогенез и метастазирование (см. фиг. 1B). Обработка H-NOX может ингибировать привлечение макрофагов в TME, снижая передачу сигнала VEGF, CSF1 и других зависимых от HIF-1 цитокинов (Chaturvedi et al., 2014 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111(20):E2120-2129; Lewis & Hughes, 2007 Breast Cancer Res, 9(3):209), а также опосредованную HIF-1 и HIF-2 активацию макрофагов (Fang et al., 2009 Blood, 114(4):844-859; Takeda et al., 2010 Genes Dev., 24(5):491-501).

[0239] Наконец, при стимуляции противоопухолевого иммунного ответа хозяина H-NOX может действовать в качестве коактиватора, усиливая действие других направленных на злокачественные опухоли иммунотерапевтических средств, в качестве неограничивающих примеров, таких как, антитела к PD1 (белок программируемой гибели клеток 1), антитела к PDL-1 (лиганд белка программируемой гибели клеток 1), антитела к CTLA-4 или терапевтические средства, направленные на другие регуляторы контрольных точек иммунного ответа, вакцины против злокачественных опухолей, терапию адоптивными иммуноцитами или их сочетания. Например, H-NOX можно вводить пациентам со злокачественными опухолями до и в сочетании с двойной блокирующей PD1/CTLA-4 терапией или в комбинации с обработкой PDL-1 пациентов с опухолями PD-L1+. Также он может действовать в качестве вспомогательного средства для других способов лечения злокачественных опухолей, включая в качестве неограничивающих примеров химиотерапию, лучевую терапию или другие не направленные на иммунную систему или не основанные на клетках способы лечения, которые могут выигрывать от активной противоопухолевой иммунной защиты. Фактически, H-NOX может синергически действовать с радиационным облучением, одновременно стимулируя противоопухолевый иммунный ответ в отношении подвергнутых радиационному облучению опухолеспецифичных антигенов из поврежденной опухолевой ткани (Demaria et al., 2005 Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 63(3), 655-666) и зависимого от кислорода уничтожения опухолевых клеток (Brown, 2010 Int. J. Radiat. Biol., 86(11), 907-917). При лучевой терапии H-NOX также может действовать в качестве радиопротектора нормальной ткани снижая гипоксию, являющуюся результатом индуцированного радиационным облучением повреждения сосудов.

Пример 3. Определение гипоксии и T-клеток в подкожных опухолях B16F10 и CT26 и внутричерепных опухолях GL261-люцифераза.

[0240] Получение подкожных опухолей B16F10 и CT26 и внутричерепных опухолей GL261-люцифераза. Самкам мышей C57BL/6J в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ злокачественных клеток меланомы мыши B16F10 (фиг. 7A). Самкам мышей BALB/c в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ клеток опухоли толстой кишки CT26 (фиг. 7B). Самцам C57BL/6J массой 20 г интракраниально в правое хвостатое ядро инъецировали 3 × 10⁵ клеток GL261-luc (+0,5 мм A/P, +2,3 ммM/л и -3,2 мм D/V) (фиг. 7C). Внутричерепным опухолям перед умерщвлением позволяли расти в течение 21 суток. Подкожные опухоли измеряли 3 раза в неделю с использованием циркуля и размер опухоли рассчитывали по формуле: (длина × ширину²) ÷ 0,5. После достижения опухолями среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток) начинали обработку.

[0241] Обработка. Мышам, несущим подкожные опухоли объемом 200-400 мм³ или на сутки 21 внутричерепных опухолей, за 1-8 часов до умерщвления в./б. инъецировали экзогенный маркер гипоксии пимонидазол. (60 мг/кг, Hypoxyprobe, Burlington Massachusetts).

[0242] Иммуногистохимия. Грызунов умерщвляли и вырезали опухоли для иммуногистохимического (IHC) анализа. Опухоли замораживали в OCT и получали срезы 12 мкМ для IHC обработки. Срезы фиксировали 4% PFA в течение 15 минут при 4°C, затем блокировали и пропитывали 5% BSA, 5% сывороткой козы и 0,1% Tween 20 в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с антителами кролика к пимонидазолу (Hypoxyprobe, 1:100) (фиг. 7A, 7B, 7C, верхний ряд изображений) и антителами крысы к CD3, антителами крысы к CD4 (Biolegend, 1:50) или антителами крысы к CD8 (Biolegend, 1:50) в течение ночи при 4°C (фиг. 7A, 7B, 7C, средний ряд изображений) с последующими вторичными антителами к антителам кролика или крысы (1:1000, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы закрепляли в SlowFade DAPI (Invitrogen). Получали изображение срезов с использованием микроскопа HD AxioImager Zeiss, оборудованного цифровой камерой CCD. Количественный анализ. У каждого животного подсчитывали количество CD3+, CD4+ или CD8+ T-клеток в пимонидазол-положительных и пимонидазол-отрицательных областях в 2-4 изображениях на срез в 5 срезах опухоли, охватывающих толщину опухоли 1-1,5 мм. Сумму CD4+ и CD8+ клеток в каждой области делили на сумму пимонидазол-положительных и пимонидазол-отрицательных областей с получением общего количества T-клеток на мм² опухолевой ткани (фиг. 7A, 7B, и 7C, нижний ряд изображений). В гипоксических областях опухолей (H) выявляли от 2,5 до более 10 раз меньшее количество T-клеток, чем в нормоксических областях (N).

Пример 4. Обработка H-NOX гипоксических опухолей.

[0243] Получение подкожных опухолей B16F10. Самкам мышей C57BL/6J в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ злокачественных клеток меланомы мыши B16F10. Опухоли измеряли 3 раза в неделю с использованием циркуля и размер опухоли рассчитывали по формуле: (длина × ширину²) ÷ 0,5. После достижения опухолями среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток) начинали обработку.

[0244] Обработка. Мышей, несущих 200-400 мм³ опухоли, по размеру опухоли случайно распределяли в каждую из групп обработки и инъецировали им внутрь опухоли носитель (состав буфера: 50 мМ сукцинат, 50 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 10 мМ восстановленный глутатион при pH 7) или 100 мкл состава буфера, содержащего 2 мг пегилированного H-NOX (L144F). За час до обработки носителем или H-NOX мышам в./б. инъецировали экзогенный маркер гипоксии пимонидазол (60 мг/кг, Hypoxyprobe, Burlington Massachusetts).

[0245] Иммуногистохимия. Через 6 часов после инъекции H-NOX, грызунов умерщвляли и вырезали опухоли для иммуногистохимического (IHC) анализа. Опухоли замораживали в OCT и получали срезы 12 мкМ для IHC обработки. Срезы фиксировали 4% PFA в течение 15 минут при 4°C, затем блокировали и пропитывали 5% BSA, 5% сывороткой козы и 0,1% Tween 20 в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с антителами кролика к пимонидазолу (Hypoxyprobe, 1:100) или антителами кролика к карбоангидразе IX (CAIX, Novus Biological 1:1000) и крысы к CD4 (Biolegend, 1:50) или крысы к CD8 (Biolegend, 1:50) в течение ночи при 4°C с последующими вторичными антителами к антителам кролика или крысы (1:1000, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы закрепляли в SlowFade DAPI (Invitrogen). Получали изображение срезов с использованием микроскопа HD AxioImager Zeiss, оборудованного цифровой камерой CCD (фиг. 8 и 9B).

[0246] Количественный анализ. У каждого животного подсчитывали количество CD4+ и CD8+ T-клеток в пимонидазол-положительных, пимонидазол-отрицательных, CAIX-положительных и CAIX-отрицательных областях для 4 изображений на срез в 5 срезах опухоли, охватывающих толщину опухоли 1-1,5 мм. Сумму CD4+ и CD8+ клеток в каждой области делили на сумму пимонидазол-положительных, пимонидазол-отрицательных, CAIX-положительных и CAIX-отрицательных областей с получением общего количества T-клеток на мм² опухолевой ткани. Результаты, представленные на фиг. 8 и 9A, демонстрируют, что обработка OMX по сравнению с контрольным носителем (состав буфера) увеличивает накопление CD4+ и CD8+ лимфоцитов в ранее пимонидазол-отрицательных (фиг. 8) или CAIX-отрицательных (фиг. 9B) меченых гипоксических областях опухолей.

Пример 5. Определение гипоксии опухолей и транспортеров опухолей.

[0247] Получение подкожных опухолей H460, B16F10 и CT26 и внутричерепных опухолей GL261-люцифераза. Самкам мышей Nu/Nu в возрасте семи-восьми недель в заднюю конечность подкожно имплантировали 3 × 10⁶ клеток рака легкого человека H460. Самкам мышей C57BL/6J в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ злокачественных клеток меланомы мыши B16F10. Самкам мышей BALB/c в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ клеток опухоли толстой кишки CT26. Самцам C57BL/6J массой 20 г интракраниально в правое хвостатое ядро инъецировали 3 × 10⁵ клеток GL261-luc (+0,5 мм A/P, +2,3 ммM/л и -3,2 мм D/V). Перед умерщвлением внутричерепным опухолям позволяли расти в течение 21 суток. Подкожные опухоли измеряли 3 раза в неделю с использованием циркуля и размер опухоли рассчитывали по формуле: (длина × ширину²) ÷ 0,5. После достижения опухолями среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток) начинали обработку. Обработка. Мышам, несущим подкожные опухоли объемом 200-400 мм³ или на сутки 21 внутричерепных опухолей, за 1-8 часов до умерщвления в./б. инъецировали экзогенный маркер гипоксии пимонидазол. (60 мг/кг, Hypoxyprobe, Burlington Massachusetts).

[0248] Иммуногистохимия и ELISA. Грызунов умерщвляли и вырезали опухоли для иммуногистохимических (IHC) анализов и анализов ELISA. Для ELISA опухоли B16F10, CT26 и H460 гомогенизировали в буфере для экстракции (набор Abcam № ab117996), дополненном антипротеазами. Концентрацию белка в каждой опухоли количественно определяли посредством анализа по Брэдфорду и образцы анализировали на уровни гипоксии с использованием конкурентного анализа ELISA пимонидазола (Hypoxyprobe-1, Hypoxyprobe, Burlington Massachusetts). Для IHC опухоли GL261 замораживали в OCT и получали срезы 12 мкМ для IHC обработки. Срезы фиксировали 100% метанолом в течение 20 минут при -20°C, затем блокировали и пропитывали 5% BSA, 5% сывороткой козы и 0,1% Tween 20 в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с антителами кролика к пимонидазолу (Hypoxyprobe, 1:100) и крысы к CD31 (BD Bioscience, 1:50) в течение ночи при 4°C с последующими вторичными антителами к антителам кролика или крысы (1:1000, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы закрепляли в SlowFade DAPI (Invitrogen). Получали изображение срезов с использованием микроскопа HD AxioImager Zeiss, оборудованного цифровой камерой CCD (фиг. 10).

[0249] Количественный анализ. Для ELISA пимонидазола количественный анализ значений IC₅₀ ("Kd") проводили с 5-параметрическим сглаживанием стандартной кривой и значения нормализовали по концентрации белка в каждом образце. Для IHC GL261 у каждого животного определяли процент пимонидазол-положительной области в опухолевой ткани с использованием ImageJ (1-2 изображения на срез в 5 срезах опухоли, охватывающих 1 мм толщины опухоли) (фиг. 10). Эти данные демонстрируют, что хотя у различных животных и в различных типах опухолей наблюдают определенный диапазон уровней гипоксии, ее присутствие значимо в большинстве опухолей исследуемых размеров.

Пример 6. Определение накопления H-NOX в опухолях.

[0250] Получение подкожных опухолей B16F10 и CT26 и внутричерепных опухолей GL261-люцифераза. Самкам мышей C57BL/6J в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ злокачественных клеток меланомы мыши B16F10. Самкам мышей BALB/c в возрасте шести-восьми недель в бок подкожно имплантировали 1 × 10⁶ клеток опухоли толстой кишки CT26. Самцам C57BL/6J массой 20 г интракраниально в правое хвостатое ядро инъецировали 3 × 10⁵ клеток GL261-luc (+0,5 мм A/P, +2,3 мм M/л и -3,2 мм D/V). Перед умерщвлением внутричерепным опухолям позволяли расти в течение 21 суток. Подкожные опухоли измеряли 3 раза в неделю с использованием циркуля и размер опухоли рассчитывали по формуле: (длина × ширину²) ÷ 0,5. После достижения опухолями среднего размера ≈300 мм³ (10-14 суток после имплантации опухолевых клеток) начинали обработку.

[0251] Обработка. Мышей, несущих подкожные опухоли объемом 200-400 мм³, случайно распределяли в каждую из групп обработки по размеру опухоли и внутривенно (650 мг/кг), подкожно (650 мг/кг) или внутрь опухоли (2 мг, 100 мкл) инъецировали носителей (состав буфера: 50 мМ сукцинат, 50 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 10 мМ восстановленный глутатион при pH 7) или состав буфера, содержащий пегилированный H-NOX (L144F). Мышей, несущих внутричерепные опухоли, на сутки 21 случайно распределяли в каждую из групп обработки по биолюминесцентному сигналу, определяемому с использованием Xenogen IVIS Spectrum и внутривенно инъецировали только состав буфер или состав буфера, содержащий 750 мг/кг H-NOX (L144F).

[0252] Определение накопления пегилированного H-NOX (L144F) в ткани подкожной опухоли. Опухоли выделяли через 6 час (B16F10) или 8 час (CT26) после инъекции H-NOX или носителя. Опухоли гомогенизировали в буфере для экстракции (набор Abcam № ab117996), дополненном антипротеазами и концентрацию белка в каждой опухоли количественно определяли посредством анализа по Брэдфорду. Концентрацию пегилированного H-NOX (L144F) количественно определяли посредством сэндвич-ELISA (чувствительность детекции при 1 нг/мл) для H-NOX и нормализовали на массу опухоли, выражая количество H-NOX в мкг/г опухолевой ткани. Количественный анализ уровней H-NOX в опухолевых лизатах проводили посредством 5-параметрического сглаживания стандартной кривой.

[0253] Биораспределение H-NOX (L144F) в GL261, определяемое посредством IHC. Через 2 часа после инъекции H-NOX грызунов умерщвляли и вырезали опухоли для иммуногистохимического (IHC) анализа. Опухоли замораживали в OCT и получали срезы 12 мкМ для IHC обработки. Срезы фиксировали 100% метанолом в течение 20 минут при -20°C, затем блокировали и пропитывали 5% BSA, 5% сывороткой козы и 0,1% Tween 20 в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с антителами кролика к H-NOX (1:500, изготовленные по заказу поликлональные антитела кролика, производимые AnaSpec Inc, Fremont, CA) и антителами крысы к CD31 (BD Bioscience, 1:50) в течение ночи при 4°C с последующими вторичными антителами к антителам кролика или крысы (1:1000, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы закрепляли в SlowFade DAPI (Invitrogen). Получали изображение срезов с использованием микроскопа HD AxioImager Zeiss, оборудованного цифровой камерой CCD. У каждого у каждого животного определяли процент H-NOX-положительной области в опухолевой ткань с использованием ImageJ (1-2 изображения на срез в 5 срезах опухоли, охватывающих 1 мм толщины опухоли).

Пример 7. Определение гипоксии и T-клеток в опухолях оральной меланомы собаки.

[0254] Оральная меланома собаки. Домашних собак с опухолью оральной меланомы набирали для исследования с согласия владельцев и за 4 часа до хирургической операции внутривенно инъецировали им (медленная инфузия) пегилированный H-NOX (L144F). Полученную после хирургической операции ткань анализировали посредством IHC.

[0255] Иммуногистохимия. Через 4 часа после инъекция H-NOX, опухоли вырезали, замораживали в OCT и получали срезы 12 мкМ для IHC обработки. Срезы фиксировали 4% PFA в течение 15 минут при 4°C, затем блокировали и пропитывали 5% BSA, 5% сывороткой козы и 0,1% Tween 20 в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с антителами кролика к карбоангидразе IX (CAIX, Novus Biological 1:1000) или кролика к H-NOX (1:500, полученные по заказу поликлональные антитела кролика, производимые AnaSpec Inc, Fremont, CA) и крыса к CD4 (Abd Serotech, 1:50) или крысы к CD8 (Abd Serotech, 1:50) в течение ночи при 4°C с последующими вторичными антителами к антителам кролика или крысы (1:1000, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы закрепляли в SlowFade DAPI (Invitrogen). Получали изображение срезов с использованием микроскопа HD AxioImager Zeiss, оборудованного цифровой камерой CCD (фиг. 11). Изображения выявили присутствие в областях опухолей большого количества лимфоцитов, которые экспрессировали маркер гипоксии CAIX, свидетельствующий о гипоксическом состоянии до введения OMX, указывая на то, что обработка OMX ослабляла иммуносупрессорное микроокружение и обеспечивала инфильтрацию лимфоцитов.

Пример 8. Корреляция объема опухоли, гипоксии опухоли и сниженной инфильтрации T-клетками.

[0256] Модель опухоли 4T1-Luc. Самок мышей BALB/c в возрасте восьми недель приобретали в Charles River Labs. Экспрессирующие люциферазу клетки рака молочной железы мыши 4T1 (4T1-Fluc-Neo; Imanis Life Sciences) выращивали в среде RPMI, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 1× пенициллином/стрептомицином и 0,7 мг/мл G-418 (InvivoGen). Клетки were трипсинизировали и ресуспендировали в смеси среды:матригеля (Corning) 50:50 и 2 × 10⁵ клеток в объеме 100 мкл подкожно инъецировали мышам. На сутки 10 и сутки 14 после имплантации опухоли измеряли и рассчитывали объемы (длина × ширину × высоту × 0,523) мышам одновременно инъецировали 120 мг/кг пимонидазола в/в (PIMO, Hypoxyprobe) и 30 мг/кг EF5 в/в (Hypoxia Imaging Center), умерщвляли через 90 мин после инъекции PIMO/EF5 и выделяли опухоли. Выделенные опухоли замораживали в OCT для иммуноокрашивания, а также с использованием диссоциатора gentleMACS разделяли на одиночные клетки с последующей инкубацией с 0,75 мг/мл коллагеназы/диспазы (Roche) при 37°C с перемешиванием в течение 45 мин. Разделенные клетки пропускали через 70 мкм фильтры.

[0257] Проточная цитометрия. Нефиксированные разделенные клетки окрашивали антителами к T-клетками (антитела хомяка к CD3 мыши-AlexaFluor 488, клон 145-2C11, eBioscience; антитела крысы к CD4 мыши-APC, клон RM4-5, BD Biosciences; антитела крысы к CD8 мыши-PE, клон 53-6,7, BD Biosciences) и проводили проточную цитометрию с использованием FACSCalibur. В качестве положительного контроля T-клеток с целью установления окна использовали селезенку. Также после фильтрации разделенных клеток через 70 мкм фильтры клетки окрашивали витальным красителем 570 (BD Biosciences), фиксировали формалином и метанолом, окрашивали антителами к маркерам гипоксии (антитела кролика к пимонидазолу, Hypoxyprobe, с последующими антителами осла к антителам кролика AlexaFluor 647; антителами мыши к EF5, конъюгированными с AlexaFluor 488, Hypoxia Imaging Center) и анализировали на FACSCalibur. Данные проточной цитометрии анализировали с использованием FlowJo.

[0258] Иммунофлуоресцентное окрашивание. Замороженные срезы разрезали на 10 мкм, фиксировали 4% PFA, окрашивали первичными антитела (антитела крысы к CD4 мыши, антитела крысы к CD8 мыши, антитела кролика к PIMO) с последующими вторичными антителами (антитела осла к антителам крысы AlexaFluor 594, антитела осла к PIMO AlexaFluor 488) и контрастно окрашивали DAPI.

[0259] Как показано на фиг. 13A-13K, больший размер опухоли коррелирует с увеличенной гипоксией и сниженной инфильтрацией лимфоцитов в подкожные сингенные опухоли 4T1-Luc. На фиг. 12A приведены объемы опухолей на сутки 10 и сутки 14 после имплантации. На фиг. 12B представлена фракция лимфоцитов в жизнеспособной популяции клетка, а на фиг. 12C представлены абсолютные количества лимфоцитов в жизнеспособной популяции. Продемонстрирована отрицательная корреляция между объемом опухоли и процентом лимфоцитов (фиг. 12D) и между процентом гипоксии и процентом лимфоцитов (фиг. 12F), тогда как зависимость между объемом опухоли и процентом гипоксии демонстрировала положительную корреляцию (фиг. 12E). Отрицательную корреляцию также наблюдали между объемом опухоли и процентом положительных по CD3 T-клеток (фиг. 12G), между объемом опухоли и процентом положительных по CD4 T-клеток (фиг. 12H), между объемом опухоли и процентом положительных по CD8 T-клеток (фиг. 12I), между объемом опухоли и процентом двойных положительных по CD3-CD4 T-клеток (фиг. 12J) и между объемом опухоли и процентом двойных положительных по CD3-CD8 T-клеток (фиг. 12K).

[0260] Фиг. 13A-13F продемонстрировано, что гипоксические области опухолей являются иммуносупрессорными и в подкожных сингенных опухолях мышей 4T1-Luc демонстрируют сниженную инфильтрацию T-клетками.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Tt. дикого типа

ATGAAGGGGACAATCGTCGGGACATGGATAAAGACCCTGAGGGACCTTTACGGGAATGATGTGGTTGATGAATCTTTAAAAAGTGTGGGTTGGGAACCAGATAGGGTAATTACACCTCTGGAGGATATTGATGACGATGAGGTTAGGAGAATTTTTGCTAAGGTGAGTGAAAAAACTGGTAAAAATGTCAACGAAATATGGAGAGAGGTAGGAAGGCAGAACATAAAAACTTTCAGCGAATGGTTTCCCTCCTATTTTGCAGGGAGAAGGCTAGTGAATTTTTTAATGATGATGGATGAGGTACACCTACAGCTTACCAAGATGATAAAAGGAGCCACTCCTCCAAGGCTTATTGCAAAGCCTGTTGCAAAAGATGCCATTGAAATGGAGTACGTTTCTAAAAGAAAGATGTACGATTACTTTTTAGGGCTTATAGAGGGTAGTTCTAAATTTTTCAAGGAAGAAATTTCAGTGGAAGAGGTCGAAAGAGGCGAAAAAGATGGCTTTTCAAGGCTAAAAGTCAGGATAAAATTTAAAAACCCCGTTTTTGAGTGA

(SEQ ID NO:1)

MKGTIVGTWIKTLRDLYGNDVVDESLKSVGWEPDRVITPLEDIDDDEVRRIFAKVSEKTGKNVNEIWREVGRQNIKTFSEWFPSYFAGRRLVNFLMMMDEVHLQLTKMIKGATPPRLIAKPVAKDAIEMEYVSKRKMYDYFLGLIEGSSKFFKEEISVEEVERGEKDGFSRLKVRIKFKNPVFE

(SEQ ID NO:2)

Домен сборки

GGTTATATTCCTGAAGCTCCAAGAGATGGGCAAGCTTACGTTCGTAAAGATGGCGAATGGGTATTACTTTCTACCTTTTTA (SEQ ID NO:3)

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:4)

L2 дикого типа

ATGATGTCTATGAAAGGAATCATATTCAACGAATTTCTCAATTTTGTAGAAAAAAGTGAATCCTACACCCTGGTAGATCAAATTATTATGGATAGTCATTTGAAGTCCCATGGTGCCTACACGTCTATCGGTACATACTCTCCCAAAGAATTATTTCAATTGGTTAAAGCGCTTGCTATGAAAAATGGCAAACCAACATCAGTGATTTTACAAGAATATGGTGAGTATTTGTTTGAGGTTTTTGCAAAAAAATATCCTCAATTTTTCAGGGAAAAAAAGTCGGTGTTTCAATTTTTGGAAGCGCTTGAAACACATATTCATTTCGAAGTGAAAAAATTGTATGACTATACTGAACTACCCCATTTTGAATGCCAATATCACAGTCAAAATCAAATGGAAATGATTTACACTTCTTCGCGTCCTTTGGCCGATTTTGCGGAAGGTTTAATAAAAGGTTGTATTAAATATCATAAAGAAAACATGACTATTGTTCGTGAAAATCTGCCTGCAAAAACAGGCTTTAAGGTAAGATTTGTATTAACAAAAGGCGATCCTGATGAGTGA(SEQ ID NO:9)

MMSMKGIIFNEFLNFVEKSESYTLVDQIIMDSHLKSHGAYTSIGTYSPKELFQLVKALAMKNGKPTSVILQEYGEYLFEVFAKKYPQFFREKKSVFQFLEALETHIHFEVKKLYDYTELPHFECQYHSQNQMEMIYTSSRPLADFAEGLIKGCIKYHKENMTIVRENLPAKTGFKVRFVLTKGDPDE(SEQ ID NO:10)

L1 дикого типа

ATGAAAGGTATCGTTTTTACCTCCTTAAATGACATGATTATAGAACAATTTGGCATAGAAACCTGGGACCAACTCGTATCCTCACTAGACCTTCCAAGTGGTGGAAGTTATACAGCAGGCGGCACTTACTCGGATACAGAATTTCAGCAATTGATTAAGGCCATTGCGAAGAGGACCAATCAGCACGCTTCTGTTTTTTTAGAGGCCTTTGGTGAATACATGTTTCCTATCTTATCGAGTAAGTGCGCAATTTTTTTAAAAAAGGACATGACATTAAAAGAATTTTTAAAAAGCATTGATGGAACAATTCATGTGGAAGTAGAAAAGTTATACCCAGATGAAACATTACCTACCATTAGCTATGAAGAGCCTGCTGCAAACCAATTGGTTATGGTGTATCGATCGCATAGAAGACTCTGTCATTTTGCAATGGGGCTCATCCAGGGAGCAGCGCAACATTTTAAAAAGAAAATTACCATTAAGCAGACTCACTGCATGTTAAAAAAAGATGATCATTGTCGTTTGGAGATTACCTTTGAGTGA

(SEQ ID NO:11)

MKGIVFTSLNDMIIEQFGIETWDQLVSSLDLPSGGSYTAGGTYSDTEFQQLIKAIAKRTNQHASVFLEAFGEYMFPILSSKCAIFLKKDMTLKEFLKSIDGTIHVEVEKLYPDETLPTISYEEPAANQLVMVYRSHRRLCHFAMGLIQGAAQHFKKKITIKQTHCMLKKDDHCRLEITFE

(SEQ ID NO:12)

Homo sapiens дикого типа (1-385)

ATGTACGGATTTGTGAATCACGCCCTGGAGTTGCTGGTGATCCGCAATTACGGCCCCGAGGTGTGGGAAGACATCAAAAAAGAGGCACAGTTAGATGAAGAAGGACAGTTTCTTGTCAGAATAATATATGATGACTCCAAAACTTATGATTTGGTTGCTGCTGCAAGCAAAGTCCTCAATCTCAATGCTGGAGAAATCCTCCAAATGTTTGGGAAGATGTTTTTCGTCTTTTGCCAAGAATCTGGTTATGATACAATCTTGCGTGTCCTGGGCTCTAATGTCAGAGAATTTCTACAGAACCTTGATGCTCTGCACGACCACCTTGCTACCATCTACCCAGGAATGCGTGCACCTTCCTTTAGGTGCACTGATGCAGAAAAGGGCAAAGGACTCATTTTGCACTACTACTCAGAGAGAGAAGGACTTCAGGATATTGTCATTGGAATCATCAAAACAGTGGCACAACAAATCCATGGCACTGAAATAGACATGAAGGTTATTCAGCAAAGAAATGAAGAATGTGATCATACTCAATTTTTAATTGAAGAAAAAGAGTCAAAAGAAGAGGATTTTTATGAAGATCTTGACAGATTTGAAGAAAATGGTACCCAGGAATCACGCATCAGCCCATATACATTCTGCAAAGCTTTTCCTTTTCATATAATATTTGACCGGGACCTAGTGGTCACTCAGTGTGGCAATGCTATATACAGAGTTCTCCCCCAGCTCCAGCCTGGGAATTGCAGCCTTCTGTCTGTCTTCTCGCTGGTTCGTCCTCATATTGATATTAGTTTCCATGGGATCCTTTCTCACATCAATACTGTTTTTGTATTGAGAAGCAAGGAAGGATTGTTGGATGTGGAGAAATTAGAATGTGAGGATGAACTGACTGGGACTGAGATCAGCTGCTTACGTCTCAAGGGTCAAATGATCTACTTACCTGAAGCAGATAGCATACTTTTTCTATGTTCACCAAGTGTCATGAACCTGGACGATTTGACAAGGAGAGGGCTGTATCTAAGTGACATCCCTCTGCATGATGCCACGCGCGATCTTGTTCTTTTGGGAGAACAATTTAGAGAGGAATACAAACTCACCCAAGAACTGGAAATCCTCACTGACAGGCTACAGCTCACGTTAAGAGCCCTGGAAGATTGA

(SEQ ID NO:13)

MYGFVNHALELLVIRNYGPEVWEDIKKEAQLDEEGQFLVRIIYDDSKTYDLVAAASKVLNLNAGEILQMFGKMFFVFCQESGYDTILRVLGSNVREFLQNLDALHDHLATIYPGMRAPSFRCTDAEKGKGLILHYYSEREGLQDIVIGIIKTVAQQIHGTEIDMKVIQQRNEECDHTQFLIEEKESKEEDFYEDLDRFEENGTQESRISPYTFCKAFPFHIIFDRDLVVTQCGNAIYRVLPQLQPGNCSLLSVFSLVRPHIDISFHGILSHINTVFVLRSKEGLLDVEKLECEDELTGTEISCLRLKGQMIYLPEADSILFLCSPSVMNLDDLTRRGLYLSDIPLHDATRDLVLLGEQFREEYKLTQELEILTDRLQLTLRALED

(SEQ ID NO:14)

β2 Homo sapiens (1-217)

ATGTATGGATTCATCAACACCTGCCTGCAGTCTCTTGTGACAGAGAAATTTGGTGAGGAGACATGGGAGAAGCTGAAGGCTCCTGCAGAAGTGCAAGATGTCTTCATGACCTACACCGTGTATGATGACATCATCACCATTAAGCTCATCCAAGAAGCCTGCAAGGTTCTGGATGTGTCCATGGAAGCCATTCTGAAGCTCTTTGGCGAATACTTCTTTAAGTTCTGTAAGATGTCTGGCTATGACAGGATGCTGCGGACACTTGGAGGAAATCTCACCGAGTTTATTGAAAACCTAGATGCACTCCACAGTTACCTGGCACTGTCCTATCAGGAAATGAACGCACCATCCTTTCGAGTGGAGGAAGGAGCTGACGGGGCGATGCTTCTCCACTACTACTCAGACAGACATGGTCTGTGTCACATTGTACCAGGTATCATTGAAGCTGTGGCCAAGGACTTCTTTGACACTGATGTGGCCATGAGTATCCTGGATATGAACGAAGAGGTGGAAAGGACAGGGAAGAAAGAACATGTTGTGTTTCTGGTCGTGCAGAAGGCTCACAGACAGATAAGAGGAGCAAAGGCAAGCCGGCCACAAGGCAGTGAGGACAGCCAGGCAGACCAGGAGGCTCTCCAGGGAACACTCCTT

(SEQ ID NO:15)

MYGFINTCLQSLVTEKFGEETWEKLKAPAEVQDVFMTYTVYDDIITIKLIQEACKVLDVSMEAILKLFGEYFFKFCKMSGYDRMLRTLGGNLTEFIENLDALHSYLALSYQEMNAPSFRVEEGADGAMLLHYYSDRHGLCHIVPGIIEAVAKDFFDTDVAMSILDMNEEVERTGKKEHVVFLVVQKAHRQIRGAKASRPQGSEDSQADQEALQGTLL

(SEQ ID NO:16)

β1 Rattus norvegicus (1-385)

ATGTACGGTTTTGTGAACCATGCCCTGGAGCTGCTGGTGATCCGCAATTACGGTCCCGAGGTGTGGGAAGACATCAAAAAAGAGGCGCAGCTGGATGAAGAAGGCCAGTTTCTTGTGAGAATAATCTACGATGATTCCAAAACCTATGACTTGGTGGCTGCTGCGAGCAAAGTCCTCAACCTCAATGCTGGTGAAATCCTGCAGATGTTTGGGAAGATGTTTTTCGTCTTCTGTCAAGAGTCTGGCTATGATACCATCTTGCGTGTCCTGGGATCTAATGTCAGGGAGTTTTTGCAGAACCTCGACGCCCTGCACGACCACCTCGCCACCATCTACCCAGGGATGCGCGCACCTTCCTTCCGGTGCACCGATGCAGAAAAAGGCAAAGGGCTCATTCTGCACTACTACTCGGAAAGAGAGGGGCTTCAGGACATTGTGATCGGGATTATCAAGACTGTAGCTCAACAGATCCATGGCACTGAGATAGACATGAAGGTTATTCAGCAAAGAAGTGAAGAATGTGATCATACCCAATTTTTAATTGAAGAAAAAGAATCAAAAGAAGAGGATTTTTATGAAGATCTGGACAGGTTTGAAGAGAACGGTACCCAGGACTCCCGTATCAGCCCGTACACCTTCTGCAAAGCGTTTCCTTTTCACATCATATTTGACCGGGACCTAGTAGTCACGCAGTGTGGAAATGCTATCTACAGAGTGCTCCCCCAGCTCCAGCCTGGGAAGTGCAGCCTTCTGTCTGTCTTCTCTCTGGTCCGCCCTCATATTGACATCAGTTTCCACGGGATTCTTTCACACATCAATACCGTCTTTGTACTGAGAAGCAAGGAAGGGTTGCTGGATGTTGAGAAACTTGAATGTGAGGATGAACTGACTGGGGCAGAGATTAGCTGCCTCCGTCTCAAAGGCCAAATGATCTATTTACCGGAAGCAGATAGCATCCTCTTCCTCTGTTCACCAAGTGTGATGAACTTGGATGACCTAACAAGAAGAGGCCTGTACCTGAGTGACATCCCTCTCCATGATGCTACACGAGACCTGGTCCTTTTGGGAGAACAGTTCCGGGAGGAGTACAAACTGACACAAGAGCTGGAAATCCTCACAGACAGGCTGCAGCTCACACTGAGGGCTTTGGAGGATTGA(SEQ ID NO:17)

MYGFVNHALELLVIRNYGPEVWEDIKKEAQLDEEGQFLVRIIYDDSKTYDLVAAASKVLNLNAGEILQMFGKMFFVFCQESGYDTILRVLGSNVREFLQNLDALHDHLATIYPGMRAPSFRCTDAEKGKGLILHYYSEREGLQDIVIGIIKTVAQQIHGTEIDMKVIQQRSEECDHTQFLIEEKESKEEDFYEDLDRFEENGTQDSRISPYTFCKAFPFHIIFDRDLVVTQCGNAIYRVLPQLQPGKCSLLSVFSLVRPHIDISFHGILSHINTVFVLRSKEGLLDVEKLECEDELTGAEISCLRLKGQMIYLPEADSILFLCSPSVMNLDDLTRRGLYLSDIPLHDATRDLVLLGEQFREEYKLTQELEILTDRLQLTLRALED (SEQ ID NO:18)

β1 Rattus norvegicus (1-385)

ATGTACGGTTTTGTGAACCATGCCCTGGAGCTGCTGGTGATCCGCAATTACGGTCCCGAGGTGTGGGAAGACATCAAAAAAGAGGCGCAGCTGGATGAAGAAGGCCAGTTTCTTGTGAGAATAATCTACGATGATTCCAAAACCTATGACTTGGTGGCTGCTGCGAGCAAAGTCCTCAACCTCAATGCTGGTGAAATCCTGCAGATGTTTGGGAAGATGTTTTTCGTCTTCTGTCAAGAGTCTGGCTATGATACCATCTTGCGTGTCCTGGGATCTAATGTCAGGGAGTTTTTGCAGAACCTCGACGCCCTGCACGACCACCTCGCCACCATCTACCCAGGGATGCGCGCACCTTCCTTCCGGTGCACCGATGCAGAAAAAGGCAAAGGGCTCATTCTGCACTACTACTCGGAAAGAGAGGGGCTTCAGGACATTGTGATCGGGATTATCAAGACTGTAGCTCAACAGATCCATGGCACTGAGATAGACATGAAGGTTATTCAGCAAAGAAGTGAAGAATGTGATCATACCCAATTTTTAATTGAAGAAAAAGAATCAAAAGAAGAGGATTTTTATGAAGATCTGGACAGGTTTGAAGAGAACGGTACCCAGGACTCCCGTATCAGCCCGTACACCTTCTGCAAAGCGTTTCCTTTTCACATCATATTTGACCGGGACCTAGTAGTCACGCAGTGTGGAAATGCTATCTACAGAGTGCTCCCCCAGCTCCAGCCTGGGAAGTGCAGCCTTCTGTCTGTCTTCTCTCTGGTCCGCCCTCATATTGACATCAGTTTCCACGGGATTCTTTCACACATCAATACCGTCTTTGTACTGAGAAGCAAGGAAGGGTTGCTGGATGTTGAGAAACTTGAATGTGAGGATGAACTGACTGGGGCAGAGATTAGCTGCCTCCGTCTCAAAGGCCAAATGATCTATTTACCGGAAGCAGATAGCATCCTCTTCCTCTGTTCACCAAGTGTGATGAACTTGGATGACCTAACAAGAAGAGGCCTGTACCTGAGTGACATCCCTCTCCATGATGCTACACGAGACCTGGTCCTTTTGGGAGAACAGTTCCGGGAGGAGTACAAACTGACACAAGAGCTGGAAATCCTCACAGACAGGCTGCAGCTCACACTGAGGGCTTTGGAGGATTGA (SEQ ID NO:19)

MYGFVNHALELLVIRNYGPEVWEDIKKEAQLDEEGQFLVRIIYDDSKTYDLVAAASKVLNLNAGEILQMFGKMFFVFCQESGYDTILRVLGSNVREFLQNLDALHDHLATIYPGMRAPSFRCTDAEKGKGLILHYYSEREGLQDIVIGIIKTVAQQIHGTEIDMKVIQQRSEECDHTQFLIEEKESKEEDFYEDLDRFEENGTQDSRISPYTFCKAFPFHIIFDRDLVVTQCGNAIYRVLPQLQPGKCSLLSVFSLVRPHIDISFHGILSHINTVFVLRSKEGLLDVEKLECEDELTGAEISCLRLKGQMIYLPEADSILFLCSPSVMNLDDLTRRGLYLSDIPLHDATRDLVLLGEQFREEYKLTQELEILTDRLQLTLRALED (SEQ ID NO:20)

β2 Rattus norvegicus

ATGTATGGATTCATCAACACCTGCCTGCAGTCTCTTGTGACAGAGAAATTTGGTGAGGAGACATGGGAGAAGCTGAAGGCTCCTGCAGAAGTGCAAGATGTCTTCATGACCTACACCGTGTATGATGACATCATCACCATTAAGCTCATCCAAGAAGCCTGCAAGGTTCTGGATGTGTCCATGGAAGCCATTCTGAAGCTCTTTGGCGAATACTTCTTTAAGTTCTGTAAGATGTCTGGCTATGACAGGATGCTGCGGACACTTGGAGGAAATCTCACCGAGTTTATTGAAAACCTAGATGCACTCCACAGTTACCTGGCACTGTCCTATCAGGAAATGAACGCACCATCCTTTCGAGTGGAGGAAGGAGCTGACGGGGCGATGCTTCTCCACTACTACTCAGACAGACATGGTCTGTGTCACATTGTACCAGGTATCATTGAAGCTGTGGCCAAGGACTTCTTTGACACTGATGTGGCCATGAGTATCCTGGATATGAACGAAGAGGTGGAAAGGACAGGGAAGAAAGAACATGTTGTGTTTCTGGTCGTGCAGAAGGCTCACAGACAGATAAGAGGAGCAAAGGCAAGCCGGCCACAAGGCAGTGAGGACAGCCAGGCAGACCAGGAGGCTCTCCAGGGAACACTCCTTCGGATGAAGGAGAGATATTTAAACATCCCTGTTTGCCCTGGGGAGAAATCTCACTCAACTGCTGTGAGGGCATCGGTCCTTTTTGGAAAAGGGCCCCTCAGGGACACCTTCCAGCCCGTCTATCCTGAGAGACTATGGGTCGAAGAGGAGGTGTTCTGTGATGCTTTTCCTTTCCACATTGTCTTTGATGAAGCACTAAGGGTCAAGCAAGCTGGAGTGAATATTCAGAAGTATGTCCCTGGAATCTTAACCCAGAAGTTTGCACTAGATGAGTATTTTTCCATCATCCACCCTCAAGTTACTTTCAACATCTCCAGCATCTGCAAGTTCATTAACAGTCAGTTTGTCTTGAAGACAAGAAAAGAAATGATGCCCAAAGCAAGGAAGAGCCAGCCGATGCTCAAACTCCGGGGTCAGATGATCTGGATGGAGTCTCTGAGGTGCATGATCTTCATGTGTTCCCCAAACGTCCGCAGCCTGCAAGAGCTGGAAGAGAGCAAGATGCATCTTTCTGATATCGCTCCGCACGACACGACCAGGGATCTCATCCTCCTCAACCAGCAGAGGCTGGCAGAGATGGAGCTGTCCTGCCAACTGGAAAAGAAGAAGGAGGAGTTGCGTGTCCTTTCCAATCACCTGGCCATCGAGAAGAAGAAGACAGAGACCTTGCTGTATGCCATGCTGCCTGAACATGTGGCCAACCAACTCAAGGAGGGCAGAAAGGTGGCTGCAGGAGAATTTGAAACATGTACAATCCTTTTCAGCGATGTTGTGACATTTACCAACATCTGTGCAGCCTGTGAACCTATCCAAATCGTGAACATGCTGAATTCAATGTACTCCAAGTTTGACAGGTTAACCAGTGTCCATGATGTCTACAAAGTAGAAACAATAGGGGATGCTTACATGGTGGTGGGTGGAGTACCAGTACCCGTTGAAAGCCATGCTCAAAGAGTCGCCAATTTTGCTCTGGGGATGAGAATTTCTGCAAAAGAAGTGATGAATCCTGTCACTGGGGAACCTATCCAGATCAGAGTGGGAATCCACACTGGACCAGTCTTAGCAGGTGTTGTGGGAGACAAGATGCCTCGGTACTGCTTGTTTGGTGACACTGTAAACACAGCCTCTAGGATGGAAAGTCACGGGCTTCCCAGCAAAGTGCATCTGAGCCCCACAGCCCACAGAGCCCTGAAAAACAAAGGGTTTGAAATTGTCAGGAGAGGCGAGATCGAAGTGAAGGGGAAAGGAAAGATGACCACATACTTTCTGATCCAGAACCTGAATGCCACCGAGGATGAGATAATGGGGCGACCTTCAGCCCCCGCTGATGGGAAGGAAGTATGTACTCCCGGAAACCAAGTCAGGAAGTCCCCTGCTGTCCCGAGGAACACAGACCATCAGCAACAAGTCTACAAAGGAGACCCAGCAGACGCTTCTAATGAAGTCACACTTGCTGGGAGCCCAGTGGCAGGGCGAAACTCCACAGATGCAGTCAATAACCAGCCATCACCAGATGAGACCAAGACAAGTGTCGTTGCTAGTGGCCCTGTGCTGTCTGCTTTCTGTGTTGTGCTGTGA (SEQ ID NO:21)

MYGFINTCLQSLVTEKFGEETWEKLKAPAEVQDVFMTYTVYDDIITIKLIQEACKVLDVSMEAILKLFGEYFFKFCKMSGYDRMLRTLGGNLTEFIENLDALHSYLALSYQEMNAPSFRVEEGADGAMLLHYYSDRHGLCHIVPGIIEAVAKDFFDTDVAMSILDMNEEVERTGKKEHVVFLVVQKAHRQIRGAKASRPQGSEDSQADQEALQGTLLRMKERYLNIPVCPGEKSHSTAVRASVLFGKGPLRDTFQPVYPERLWVEEEVFCDAFPFHIVFDEALRVKQAGVNIQKYVPGILTQKFALDEYFSIIHPQVTFNISSICKFINSQFVLKTRKEMMPKARKSQPMLKLRGQMIWMESLRCMIFMCSPNVRSLQELEESKMHLSDIAPHDTTRDLILLNQQRLAEMELSCQLEKKKEELRVLSNHLAIEKKKTETLLYAMLPEHVANQLKEGRKVAAGEFETCTILFSDVVTFTNICAACEPIQIVNMLNSMYSKFDRLTSVHDVYKVETIGDAYMVVGGVPVPVESHAQRVANFALGMRISAKEVMNPVTGEPIQIRVGIHTGPVLAGVVGDKMPRYCLFGDTVNTASRMESHGLPSKVHLSPTAHRALKNKGFEIVRRGEIEVKGKGKMTTYFLIQNLNATEDEIMGRPSAPADGKEVCTPGNQVRKSPAVPRNTDHQQQVYKGDPADASNEVTLAGSPVAGRNSTDAVNNQPSPDETKTSVVASGPVLSAFCVVL(SEQ ID NO:22)

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CARY, Stephen P. L.

KRTOLICA, Ana

LE MOAN, Natacha

WINGER, Jonathan A.

LEONG, Kevin G.

<120> МОДУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛИ ПУТЕМ

ОПОСРЕДОВАННОЙ БЕЛКАМИ ДОСТАВКИ O2

<130> 627042000940

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurently Herewith

<150> 62/134,523

<151> 2015-03-17

<160> 30

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 555

<212> ДНК

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 1

atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60

gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120

gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180

aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240

tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300

gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360

cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420

tttttagggc ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480

gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540

cccgtttttg agtga 555

<210> 2

<211> 184

<212> белок

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 2

Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu

20 25 30

Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val

35 40 45

Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn

50 55 60

Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu

65 70 75 80

Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met

85 90 95

Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala

100 105 110

Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu

115 120 125

Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Leu

130 135 140

Ile Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Ser Val Glu Glu

145 150 155 160

Val Glu Arg Gly Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile

165 170 175

Lys Phe Lys Asn Pro Val Phe Glu

180

<210> 3

<211> 81

<212> ДНК

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 3

ggttatattc ctgaagctcc aagagatggg caagcttacg ttcgtaaaga tggcgaatgg 60

gtattacttt ctaccttttt a 81

<210> 4

<211> 27

<212> белок

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 4

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1 5 10 15

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 5

<211> 690

<212> ДНК

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 5

atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60

gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120

gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180

aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240

tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300

gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360

cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420

tttttagggt ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480

gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540

cccgtttttg agtataagaa aaatctcgag ggcagcggcg gttatattcc tgaagctcca 600

agagatgggc aggcttacgt tcgtaaagat ggcgaatggg tattactttc taccttttta 660

aggggtagtc accatcacca tcaccattga 690

<210> 6

<211> 225

<212> белок

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 6

Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu

20 25 30

Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val

35 40 45

Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn

50 55 60

Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu

65 70 75 80

Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met

85 90 95

Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala

100 105 110

Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu

115 120 125

Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Phe

130 135 140

Ile Glu Gly Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Glu Glu Val Glu Arg Gly

145 150 155 160

Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile Lys Phe Lys Asn

165 170 175

Pro Val Phe Glu Tyr Lys Lys Asn Leu Glu Gly Ser Gly Gly Tyr Ile

180 185 190

Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu

195 200 205

Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Arg Gly Ser His His His His His

210 215 220

His

225

<210> 7

<211> 663

<212> ДНК

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 7

atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60

gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120

gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180

aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240

tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300

gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360

cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420

tttttagggt ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480

gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540

cccgtttttg agtataagaa aaatctcgag ggcagcggcg gttatattcc tgaagctcca 600

agagatgggc aggcttacgt tcgtaaagat ggcgaatggg tattactttc taccttttta 660

tga 663

<210> 8

<211> 220

<212> белок

<213> Thermoanaerobacter tengcongensis

<400> 8

Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu

20 25 30

Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val

35 40 45

Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn

50 55 60

Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu

65 70 75 80

Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met

85 90 95

Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala

100 105 110

Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu

115 120 125

Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Phe

130 135 140

Ile Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Ser Val Glu Glu

145 150 155 160

Val Glu Arg Gly Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile

165 170 175

Lys Phe Lys Asn Pro Val Phe Glu Tyr Lys Lys Asn Leu Glu Gly Ser

180 185 190

Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg

195 200 205

Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

210 215 220

<210> 9

<211> 564

<212> ДНК

<213> Legionella pneumophila

<400> 9

atgatgtcta tgaaaggaat catattcaac gaatttctca attttgtaga aaaaagtgaa 60

tcctacaccc tggtagatca aattattatg gatagtcatt tgaagtccca tggtgcctac 120

acgtctatcg gtacatactc tcccaaagaa ttatttcaat tggttaaagc gcttgctatg 180

aaaaatggca aaccaacatc agtgatttta caagaatatg gtgagtattt gtttgaggtt 240

tttgcaaaaa aatatcctca atttttcagg gaaaaaaagt cggtgtttca atttttggaa 300

gcgcttgaaa cacatattca tttcgaagtg aaaaaattgt atgactatac tgaactaccc 360

cattttgaat gccaatatca cagtcaaaat caaatggaaa tgatttacac ttcttcgcgt 420

cctttggccg attttgcgga aggtttaata aaaggttgta ttaaatatca taaagaaaac 480

atgactattg ttcgtgaaaa tctgcctgca aaaacaggct ttaaggtaag atttgtatta 540

acaaaaggcg atcctgatga gtga 564

<210> 10

<211> 187

<212> белок

<213> Legionella pneumophila

<400> 10

Met Met Ser Met Lys Gly Ile Ile Phe Asn Glu Phe Leu Asn Phe Val

1 5 10 15

Glu Lys Ser Glu Ser Tyr Thr Leu Val Asp Gln Ile Ile Met Asp Ser

20 25 30

His Leu Lys Ser His Gly Ala Tyr Thr Ser Ile Gly Thr Tyr Ser Pro

35 40 45

Lys Glu Leu Phe Gln Leu Val Lys Ala Leu Ala Met Lys Asn Gly Lys

50 55 60

Pro Thr Ser Val Ile Leu Gln Glu Tyr Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Val

65 70 75 80

Phe Ala Lys Lys Tyr Pro Gln Phe Phe Arg Glu Lys Lys Ser Val Phe

85 90 95

Gln Phe Leu Glu Ala Leu Glu Thr His Ile His Phe Glu Val Lys Lys

100 105 110

Leu Tyr Asp Tyr Thr Glu Leu Pro His Phe Glu Cys Gln Tyr His Ser

115 120 125

Gln Asn Gln Met Glu Met Ile Tyr Thr Ser Ser Arg Pro Leu Ala Asp

130 135 140

Phe Ala Glu Gly Leu Ile Lys Gly Cys Ile Lys Tyr His Lys Glu Asn

145 150 155 160

Met Thr Ile Val Arg Glu Asn Leu Pro Ala Lys Thr Gly Phe Lys Val

165 170 175

Arg Phe Val Leu Thr Lys Gly Asp Pro Asp Glu

180 185

<210> 11

<211> 543

<212> ДНК

<213> Legionella pneumophila

<400> 11

atgaaaggta tcgtttttac ctccttaaat gacatgatta tagaacaatt tggcatagaa 60

acctgggacc aactcgtatc ctcactagac cttccaagtg gtggaagtta tacagcaggc 120

ggcacttact cggatacaga atttcagcaa ttgattaagg ccattgcgaa gaggaccaat 180

cagcacgctt ctgttttttt agaggccttt ggtgaataca tgtttcctat cttatcgagt 240

aagtgcgcaa tttttttaaa aaaggacatg acattaaaag aatttttaaa aagcattgat 300

ggaacaattc atgtggaagt agaaaagtta tacccagatg aaacattacc taccattagc 360

tatgaagagc ctgctgcaaa ccaattggtt atggtgtatc gatcgcatag aagactctgt 420

cattttgcaa tggggctcat ccagggagca gcgcaacatt ttaaaaagaa aattaccatt 480

aagcagactc actgcatgtt aaaaaaagat gatcattgtc gtttggagat tacctttgag 540

tga 543

<210> 12

<211> 180

<212> белок

<213> Legionella pneumophila

<400> 12

Met Lys Gly Ile Val Phe Thr Ser Leu Asn Asp Met Ile Ile Glu Gln

1 5 10 15

Phe Gly Ile Glu Thr Trp Asp Gln Leu Val Ser Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ala Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Thr Glu Phe

35 40 45

Gln Gln Leu Ile Lys Ala Ile Ala Lys Arg Thr Asn Gln His Ala Ser

50 55 60

Val Phe Leu Glu Ala Phe Gly Glu Tyr Met Phe Pro Ile Leu Ser Ser

65 70 75 80

Lys Cys Ala Ile Phe Leu Lys Lys Asp Met Thr Leu Lys Glu Phe Leu

85 90 95

Lys Ser Ile Asp Gly Thr Ile His Val Glu Val Glu Lys Leu Tyr Pro

100 105 110

Asp Glu Thr Leu Pro Thr Ile Ser Tyr Glu Glu Pro Ala Ala Asn Gln

115 120 125

Leu Val Met Val Tyr Arg Ser His Arg Arg Leu Cys His Phe Ala Met

130 135 140

Gly Leu Ile Gln Gly Ala Ala Gln His Phe Lys Lys Lys Ile Thr Ile

145 150 155 160

Lys Gln Thr His Cys Met Leu Lys Lys Asp Asp His Cys Arg Leu Glu

165 170 175

Ile Thr Phe Glu

180

<210> 13

<211> 1158

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 13

atgtacggat ttgtgaatca cgccctggag ttgctggtga tccgcaatta cggccccgag 60

gtgtgggaag acatcaaaaa agaggcacag ttagatgaag aaggacagtt tcttgtcaga 120

ataatatatg atgactccaa aacttatgat ttggttgctg ctgcaagcaa agtcctcaat 180

ctcaatgctg gagaaatcct ccaaatgttt gggaagatgt ttttcgtctt ttgccaagaa 240

tctggttatg atacaatctt gcgtgtcctg ggctctaatg tcagagaatt tctacagaac 300

cttgatgctc tgcacgacca ccttgctacc atctacccag gaatgcgtgc accttccttt 360

aggtgcactg atgcagaaaa gggcaaagga ctcattttgc actactactc agagagagaa 420

ggacttcagg atattgtcat tggaatcatc aaaacagtgg cacaacaaat ccatggcact 480

gaaatagaca tgaaggttat tcagcaaaga aatgaagaat gtgatcatac tcaattttta 540

attgaagaaa aagagtcaaa agaagaggat ttttatgaag atcttgacag atttgaagaa 600

aatggtaccc aggaatcacg catcagccca tatacattct gcaaagcttt tccttttcat 660

ataatatttg accgggacct agtggtcact cagtgtggca atgctatata cagagttctc 720

ccccagctcc agcctgggaa ttgcagcctt ctgtctgtct tctcgctggt tcgtcctcat 780

attgatatta gtttccatgg gatcctttct cacatcaata ctgtttttgt attgagaagc 840

aaggaaggat tgttggatgt ggagaaatta gaatgtgagg atgaactgac tgggactgag 900

atcagctgct tacgtctcaa gggtcaaatg atctacttac ctgaagcaga tagcatactt 960

tttctatgtt caccaagtgt catgaacctg gacgatttga caaggagagg gctgtatcta 1020

agtgacatcc ctctgcatga tgccacgcgc gatcttgttc ttttgggaga acaatttaga 1080

gaggaataca aactcaccca agaactggaa atcctcactg acaggctaca gctcacgtta 1140

agagccctgg aagattga 1158

<210> 14

<211> 385

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn

1 5 10 15

Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp

20 25 30

Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr

35 40 45

Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly

50 55 60

Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu

65 70 75 80

Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu

85 90 95

Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr

100 105 110

Pro Gly Met Arg Ala Pro Ser Phe Arg Cys Thr Asp Ala Glu Lys Gly

115 120 125

Lys Gly Leu Ile Leu His Tyr Tyr Ser Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asp

130 135 140

Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr

145 150 155 160

Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Asn Glu Glu Cys Asp His

165 170 175

Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr

180 185 190

Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Glu Ser Arg Ile

195 200 205

Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp

210 215 220

Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu

225 230 235 240

Pro Gln Leu Gln Pro Gly Asn Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu

245 250 255

Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile

260 265 270

Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu

275 280 285

Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Thr Glu Ile Ser Cys Leu

290 295 300

Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu

305 310 315 320

Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg

325 330 335

Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu

340 345 350

Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu

355 360 365

Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu

370 375 380

Asp

385

<210> 15

<211> 651

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 15

atgtatggat tcatcaacac ctgcctgcag tctcttgtga cagagaaatt tggtgaggag 60

acatgggaga agctgaaggc tcctgcagaa gtgcaagatg tcttcatgac ctacaccgtg 120

tatgatgaca tcatcaccat taagctcatc caagaagcct gcaaggttct ggatgtgtcc 180

atggaagcca ttctgaagct ctttggcgaa tacttcttta agttctgtaa gatgtctggc 240

tatgacagga tgctgcggac acttggagga aatctcaccg agtttattga aaacctagat 300

gcactccaca gttacctggc actgtcctat caggaaatga acgcaccatc ctttcgagtg 360

gaggaaggag ctgacggggc gatgcttctc cactactact cagacagaca tggtctgtgt 420

cacattgtac caggtatcat tgaagctgtg gccaaggact tctttgacac tgatgtggcc 480

atgagtatcc tggatatgaa cgaagaggtg gaaaggacag ggaagaaaga acatgttgtg 540

tttctggtcg tgcagaaggc tcacagacag ataagaggag caaaggcaag ccggccacaa 600

ggcagtgagg acagccaggc agaccaggag gctctccagg gaacactcct t 651

<210> 16

<211> 217

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Tyr Gly Phe Ile Asn Thr Cys Leu Gln Ser Leu Val Thr Glu Lys

1 5 10 15

Phe Gly Glu Glu Thr Trp Glu Lys Leu Lys Ala Pro Ala Glu Val Gln

20 25 30

Asp Val Phe Met Thr Tyr Thr Val Tyr Asp Asp Ile Ile Thr Ile Lys

35 40 45

Leu Ile Gln Glu Ala Cys Lys Val Leu Asp Val Ser Met Glu Ala Ile

50 55 60

Leu Lys Leu Phe Gly Glu Tyr Phe Phe Lys Phe Cys Lys Met Ser Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Arg Met Leu Arg Thr Leu Gly Gly Asn Leu Thr Glu Phe Ile

85 90 95

Glu Asn Leu Asp Ala Leu His Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Gln Glu

100 105 110

Met Asn Ala Pro Ser Phe Arg Val Glu Glu Gly Ala Asp Gly Ala Met

115 120 125

Leu Leu His Tyr Tyr Ser Asp Arg His Gly Leu Cys His Ile Val Pro

130 135 140

Gly Ile Ile Glu Ala Val Ala Lys Asp Phe Phe Asp Thr Asp Val Ala

145 150 155 160

Met Ser Ile Leu Asp Met Asn Glu Glu Val Glu Arg Thr Gly Lys Lys

165 170 175

Glu His Val Val Phe Leu Val Val Gln Lys Ala His Arg Gln Ile Arg

180 185 190

Gly Ala Lys Ala Ser Arg Pro Gln Gly Ser Glu Asp Ser Gln Ala Asp

195 200 205

Gln Glu Ala Leu Gln Gly Thr Leu Leu

210 215

<210> 17

<211> 1158

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 17

atgtacggtt ttgtgaacca tgccctggag ctgctggtga tccgcaatta cggtcccgag 60

gtgtgggaag acatcaaaaa agaggcgcag ctggatgaag aaggccagtt tcttgtgaga 120

ataatctacg atgattccaa aacctatgac ttggtggctg ctgcgagcaa agtcctcaac 180

ctcaatgctg gtgaaatcct gcagatgttt gggaagatgt ttttcgtctt ctgtcaagag 240

tctggctatg ataccatctt gcgtgtcctg ggatctaatg tcagggagtt tttgcagaac 300

ctcgacgccc tgcacgacca cctcgccacc atctacccag ggatgcgcgc accttccttc 360

cggtgcaccg atgcagaaaa aggcaaaggg ctcattctgc actactactc ggaaagagag 420

gggcttcagg acattgtgat cgggattatc aagactgtag ctcaacagat ccatggcact 480

gagatagaca tgaaggttat tcagcaaaga agtgaagaat gtgatcatac ccaattttta 540

attgaagaaa aagaatcaaa agaagaggat ttttatgaag atctggacag gtttgaagag 600

aacggtaccc aggactcccg tatcagcccg tacaccttct gcaaagcgtt tccttttcac 660

atcatatttg accgggacct agtagtcacg cagtgtggaa atgctatcta cagagtgctc 720

ccccagctcc agcctgggaa gtgcagcctt ctgtctgtct tctctctggt ccgccctcat 780

attgacatca gtttccacgg gattctttca cacatcaata ccgtctttgt actgagaagc 840

aaggaagggt tgctggatgt tgagaaactt gaatgtgagg atgaactgac tggggcagag 900

attagctgcc tccgtctcaa aggccaaatg atctatttac cggaagcaga tagcatcctc 960

ttcctctgtt caccaagtgt gatgaacttg gatgacctaa caagaagagg cctgtacctg 1020

agtgacatcc ctctccatga tgctacacga gacctggtcc ttttgggaga acagttccgg 1080

gaggagtaca aactgacaca agagctggaa atcctcacag acaggctgca gctcacactg 1140

agggctttgg aggattga 1158

<210> 18

<211> 385

<212> белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn

1 5 10 15

Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp

20 25 30

Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr

35 40 45

Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly

50 55 60

Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu

65 70 75 80

Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu

85 90 95

Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr

100 105 110

Pro Gly Met Arg Ala Pro Ser Phe Arg Cys Thr Asp Ala Glu Lys Gly

115 120 125

Lys Gly Leu Ile Leu His Tyr Tyr Ser Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asp

130 135 140

Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr

145 150 155 160

Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Ser Glu Glu Cys Asp His

165 170 175

Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr

180 185 190

Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Asp Ser Arg Ile

195 200 205

Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp

210 215 220

Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu

225 230 235 240

Pro Gln Leu Gln Pro Gly Lys Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu

245 250 255

Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile

260 265 270

Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu

275 280 285

Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Ala Glu Ile Ser Cys Leu

290 295 300

Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu

305 310 315 320

Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg

325 330 335

Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu

340 345 350

Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu

355 360 365

Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu

370 375 380

Asp

385

<210> 19

<211> 1158

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 19

atgtacggtt ttgtgaacca tgccctggag ctgctggtga tccgcaatta cggtcccgag 60

gtgtgggaag acatcaaaaa agaggcgcag ctggatgaag aaggccagtt tcttgtgaga 120

ataatctacg atgattccaa aacctatgac ttggtggctg ctgcgagcaa agtcctcaac 180

ctcaatgctg gtgaaatcct gcagatgttt gggaagatgt ttttcgtctt ctgtcaagag 240

tctggctatg ataccatctt gcgtgtcctg ggatctaatg tcagggagtt tttgcagaac 300

ctcgacgccc tgcacgacca cctcgccacc atctacccag ggatgcgcgc accttccttc 360

cggtgcaccg atgcagaaaa aggcaaaggg ctcattctgc actactactc ggaaagagag 420

gggcttcagg acattgtgat cgggattatc aagactgtag ctcaacagat ccatggcact 480

gagatagaca tgaaggttat tcagcaaaga agtgaagaat gtgatcatac ccaattttta 540

attgaagaaa aagaatcaaa agaagaggat ttttatgaag atctggacag gtttgaagag 600

aacggtaccc aggactcccg tatcagcccg tacaccttct gcaaagcgtt tccttttcac 660

atcatatttg accgggacct agtagtcacg cagtgtggaa atgctatcta cagagtgctc 720

ccccagctcc agcctgggaa gtgcagcctt ctgtctgtct tctctctggt ccgccctcat 780

attgacatca gtttccacgg gattctttca cacatcaata ccgtctttgt actgagaagc 840

aaggaagggt tgctggatgt tgagaaactt gaatgtgagg atgaactgac tggggcagag 900

attagctgcc tccgtctcaa aggccaaatg atctatttac cggaagcaga tagcatcctc 960

ttcctctgtt caccaagtgt gatgaacttg gatgacctaa caagaagagg cctgtacctg 1020

agtgacatcc ctctccatga tgctacacga gacctggtcc ttttgggaga acagttccgg 1080

gaggagtaca aactgacaca agagctggaa atcctcacag acaggctgca gctcacactg 1140

agggctttgg aggattga 1158

<210> 20

<211> 385

<212> белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 20

Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn

1 5 10 15

Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp

20 25 30

Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr

35 40 45

Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly

50 55 60

Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu

65 70 75 80

Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu

85 90 95

Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr

100 105 110

Pro Gly Met Arg Ala Pro Ser Phe Arg Cys Thr Asp Ala Glu Lys Gly

115 120 125

Lys Gly Leu Ile Leu His Tyr Tyr Ser Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asp

130 135 140

Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr

145 150 155 160

Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Ser Glu Glu Cys Asp His

165 170 175

Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr

180 185 190

Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Asp Ser Arg Ile

195 200 205

Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp

210 215 220

Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu

225 230 235 240

Pro Gln Leu Gln Pro Gly Lys Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu

245 250 255

Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile

260 265 270

Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu

275 280 285

Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Ala Glu Ile Ser Cys Leu

290 295 300

Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu

305 310 315 320

Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg

325 330 335

Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu

340 345 350

Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu

355 360 365

Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu

370 375 380

Asp

385

<210> 21

<211> 2229

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 21

atgtatggat tcatcaacac ctgcctgcag tctcttgtga cagagaaatt tggtgaggag 60

acatgggaga agctgaaggc tcctgcagaa gtgcaagatg tcttcatgac ctacaccgtg 120

tatgatgaca tcatcaccat taagctcatc caagaagcct gcaaggttct ggatgtgtcc 180

atggaagcca ttctgaagct ctttggcgaa tacttcttta agttctgtaa gatgtctggc 240

tatgacagga tgctgcggac acttggagga aatctcaccg agtttattga aaacctagat 300

gcactccaca gttacctggc actgtcctat caggaaatga acgcaccatc ctttcgagtg 360

gaggaaggag ctgacggggc gatgcttctc cactactact cagacagaca tggtctgtgt 420

cacattgtac caggtatcat tgaagctgtg gccaaggact tctttgacac tgatgtggcc 480

atgagtatcc tggatatgaa cgaagaggtg gaaaggacag ggaagaaaga acatgttgtg 540

tttctggtcg tgcagaaggc tcacagacag ataagaggag caaaggcaag ccggccacaa 600

ggcagtgagg acagccaggc agaccaggag gctctccagg gaacactcct tcggatgaag 660

gagagatatt taaacatccc tgtttgccct ggggagaaat ctcactcaac tgctgtgagg 720

gcatcggtcc tttttggaaa agggcccctc agggacacct tccagcccgt ctatcctgag 780

agactatggg tcgaagagga ggtgttctgt gatgcttttc ctttccacat tgtctttgat 840

gaagcactaa gggtcaagca agctggagtg aatattcaga agtatgtccc tggaatctta 900

acccagaagt ttgcactaga tgagtatttt tccatcatcc accctcaagt tactttcaac 960

atctccagca tctgcaagtt cattaacagt cagtttgtct tgaagacaag aaaagaaatg 1020

atgcccaaag caaggaagag ccagccgatg ctcaaactcc ggggtcagat gatctggatg 1080

gagtctctga ggtgcatgat cttcatgtgt tccccaaacg tccgcagcct gcaagagctg 1140

gaagagagca agatgcatct ttctgatatc gctccgcacg acacgaccag ggatctcatc 1200

ctcctcaacc agcagaggct ggcagagatg gagctgtcct gccaactgga aaagaagaag 1260

gaggagttgc gtgtcctttc caatcacctg gccatcgaga agaagaagac agagaccttg 1320

ctgtatgcca tgctgcctga acatgtggcc aaccaactca aggagggcag aaaggtggct 1380

gcaggagaat ttgaaacatg tacaatcctt ttcagcgatg ttgtgacatt taccaacatc 1440

tgtgcagcct gtgaacctat ccaaatcgtg aacatgctga attcaatgta ctccaagttt 1500

gacaggttaa ccagtgtcca tgatgtctac aaagtagaaa caatagggga tgcttacatg 1560

gtggtgggtg gagtaccagt acccgttgaa agccatgctc aaagagtcgc caattttgct 1620

ctggggatga gaatttctgc aaaagaagtg atgaatcctg tcactgggga acctatccag 1680

atcagagtgg gaatccacac tggaccagtc ttagcaggtg ttgtgggaga caagatgcct 1740

cggtactgct tgtttggtga cactgtaaac acagcctcta ggatggaaag tcacgggctt 1800

cccagcaaag tgcatctgag ccccacagcc cacagagccc tgaaaaacaa agggtttgaa 1860

attgtcagga gaggcgagat cgaagtgaag gggaaaggaa agatgaccac atactttctg 1920

atccagaacc tgaatgccac cgaggatgag ataatggggc gaccttcagc ccccgctgat 1980

gggaaggaag tatgtactcc cggaaaccaa gtcaggaagt cccctgctgt cccgaggaac 2040

acagaccatc agcaacaagt ctacaaagga gacccagcag acgcttctaa tgaagtcaca 2100

cttgctggga gcccagtggc agggcgaaac tccacagatg cagtcaataa ccagccatca 2160

ccagatgaga ccaagacaag tgtcgttgct agtggccctg tgctgtctgc tttctgtgtt 2220

gtgctgtga 2229

<210> 22

<211> 742

<212> белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 22

Met Tyr Gly Phe Ile Asn Thr Cys Leu Gln Ser Leu Val Thr Glu Lys

1 5 10 15

Phe Gly Glu Glu Thr Trp Glu Lys Leu Lys Ala Pro Ala Glu Val Gln

20 25 30

Asp Val Phe Met Thr Tyr Thr Val Tyr Asp Asp Ile Ile Thr Ile Lys

35 40 45

Leu Ile Gln Glu Ala Cys Lys Val Leu Asp Val Ser Met Glu Ala Ile

50 55 60

Leu Lys Leu Phe Gly Glu Tyr Phe Phe Lys Phe Cys Lys Met Ser Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Arg Met Leu Arg Thr Leu Gly Gly Asn Leu Thr Glu Phe Ile

85 90 95

Glu Asn Leu Asp Ala Leu His Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Gln Glu

100 105 110

Met Asn Ala Pro Ser Phe Arg Val Glu Glu Gly Ala Asp Gly Ala Met

115 120 125

Leu Leu His Tyr Tyr Ser Asp Arg His Gly Leu Cys His Ile Val Pro

130 135 140

Gly Ile Ile Glu Ala Val Ala Lys Asp Phe Phe Asp Thr Asp Val Ala

145 150 155 160

Met Ser Ile Leu Asp Met Asn Glu Glu Val Glu Arg Thr Gly Lys Lys

165 170 175

Glu His Val Val Phe Leu Val Val Gln Lys Ala His Arg Gln Ile Arg

180 185 190

Gly Ala Lys Ala Ser Arg Pro Gln Gly Ser Glu Asp Ser Gln Ala Asp

195 200 205

Gln Glu Ala Leu Gln Gly Thr Leu Leu Arg Met Lys Glu Arg Tyr Leu

210 215 220

Asn Ile Pro Val Cys Pro Gly Glu Lys Ser His Ser Thr Ala Val Arg

225 230 235 240

Ala Ser Val Leu Phe Gly Lys Gly Pro Leu Arg Asp Thr Phe Gln Pro

245 250 255

Val Tyr Pro Glu Arg Leu Trp Val Glu Glu Glu Val Phe Cys Asp Ala

260 265 270

Phe Pro Phe His Ile Val Phe Asp Glu Ala Leu Arg Val Lys Gln Ala

275 280 285

Gly Val Asn Ile Gln Lys Tyr Val Pro Gly Ile Leu Thr Gln Lys Phe

290 295 300

Ala Leu Asp Glu Tyr Phe Ser Ile Ile His Pro Gln Val Thr Phe Asn

305 310 315 320

Ile Ser Ser Ile Cys Lys Phe Ile Asn Ser Gln Phe Val Leu Lys Thr

325 330 335

Arg Lys Glu Met Met Pro Lys Ala Arg Lys Ser Gln Pro Met Leu Lys

340 345 350

Leu Arg Gly Gln Met Ile Trp Met Glu Ser Leu Arg Cys Met Ile Phe

355 360 365

Met Cys Ser Pro Asn Val Arg Ser Leu Gln Glu Leu Glu Glu Ser Lys

370 375 380

Met His Leu Ser Asp Ile Ala Pro His Asp Thr Thr Arg Asp Leu Ile

385 390 395 400

Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Ala Glu Met Glu Leu Ser Cys Gln Leu

405 410 415

Glu Lys Lys Lys Glu Glu Leu Arg Val Leu Ser Asn His Leu Ala Ile

420 425 430

Glu Lys Lys Lys Thr Glu Thr Leu Leu Tyr Ala Met Leu Pro Glu His

435 440 445

Val Ala Asn Gln Leu Lys Glu Gly Arg Lys Val Ala Ala Gly Glu Phe

450 455 460

Glu Thr Cys Thr Ile Leu Phe Ser Asp Val Val Thr Phe Thr Asn Ile

465 470 475 480

Cys Ala Ala Cys Glu Pro Ile Gln Ile Val Asn Met Leu Asn Ser Met

485 490 495

Tyr Ser Lys Phe Asp Arg Leu Thr Ser Val His Asp Val Tyr Lys Val

500 505 510

Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met Val Val Gly Gly Val Pro Val Pro

515 520 525

Val Glu Ser His Ala Gln Arg Val Ala Asn Phe Ala Leu Gly Met Arg

530 535 540

Ile Ser Ala Lys Glu Val Met Asn Pro Val Thr Gly Glu Pro Ile Gln

545 550 555 560

Ile Arg Val Gly Ile His Thr Gly Pro Val Leu Ala Gly Val Val Gly

565 570 575

Asp Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala

580 585 590

Ser Arg Met Glu Ser His Gly Leu Pro Ser Lys Val His Leu Ser Pro

595 600 605

Thr Ala His Arg Ala Leu Lys Asn Lys Gly Phe Glu Ile Val Arg Arg

610 615 620

Gly Glu Ile Glu Val Lys Gly Lys Gly Lys Met Thr Thr Tyr Phe Leu

625 630 635 640

Ile Gln Asn Leu Asn Ala Thr Glu Asp Glu Ile Met Gly Arg Pro Ser

645 650 655

Ala Pro Ala Asp Gly Lys Glu Val Cys Thr Pro Gly Asn Gln Val Arg

660 665 670

Lys Ser Pro Ala Val Pro Arg Asn Thr Asp His Gln Gln Gln Val Tyr

675 680 685

Lys Gly Asp Pro Ala Asp Ala Ser Asn Glu Val Thr Leu Ala Gly Ser

690 695 700

Pro Val Ala Gly Arg Asn Ser Thr Asp Ala Val Asn Asn Gln Pro Ser

705 710 715 720

Pro Asp Glu Thr Lys Thr Ser Val Val Ala Ser Gly Pro Val Leu Ser

725 730 735

Ala Phe Cys Val Val Leu

740

<210> 23

<211> 19

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Cys Ala Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gly Gly Ala

<210> 24

<211> 18

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Gly Cys Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys

1 5 10 15

Cys Thr

<210> 25

<211> 19

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys

1 5 10 15

Cys Ala Cys

<210> 26

<211> 21

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Gly Thr Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys

1 5 10 15

Ala Cys Ala Gly Ala

20

<210> 27

<211> 21

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Gly Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala

1 5 10 15

Cys Cys Thr Cys Thr

20

<210> 28

<211> 21

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly

1 5 10 15

Gly Thr Cys Ala Cys

20

<210> 29

<211> 23

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Thr

1 5 10 15

Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala

20

<210> 30

<211> 22

<212> белок

<212> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Ala Thr Thr Thr Gly Ala Cys Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Cys Thr

20

<---

Группа изобретений относится к cпособам лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, включающим: (а) введение индивидууму эффективного количества пегилированного тримерного белка H-NOX, где пегилированный тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX и домен тримеризации и где домен H-NOX представляет собой домен H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (“T. tengcongensis”), содержащий аминокислотную замену L144F в дистальном кармане; и (b) проведение иммунотерапии индивидуума. Такие способы пригодны при лечении широкого спектра злокачественных опухолей. 4 н. и 74 з.п. ф-лы, 8 пр., 13 ил.

1. Способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий: (а) введение индивидууму эффективного количества пегилированного тримерного белка H-NOX, где пегилированный тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX и домен тримеризации и где домен H-NOX представляет собой домен H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (“T. tengcongensis”), содержащий аминокислотную замену L144F в дистальном кармане; и (b) проведение иммунотерапии индивидуума.

2. Способ по п. 1, где домен H-NOX в каждом из мономеров ковалентно связан с доменом тримеризации.

3. Способ по п. 2, где C-конец домена H-NOX в каждом мономере ковалентно связан с доменом тримеризации.

4. Способ по п. 3, где домен H-NOX в каждом из мономеров связан с доменом тримеризации через аминокислотный линкер.

5. Способ по п. 4, где аминокислотный линкер составляет три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот в длину.

6. Способ по п. 5, где аминокислотный линкер содержит Gly-Ser-Gly.

7. Способ по п. 1, где домен тримеризации представляет собой домен сборки фибритина бактериофага T4.

8. Способ по п. 7, где домен сборки фибритина бактериофага T4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

9. Способ по п. 3, где каждый из мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

10. Способ по п. 3, где каждый из трех мономеров содержит молекулы PEG на мономер, где молекулярная масса каждой из трех молекул PEG составляет между 1 и 10 кДа.

11. Способ по п. 10, где каждый из трех мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

12. Способ по п. 1, где каждый домен H-NOX T. tengcongensis имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, за исключением замены L144F в SEQ ID NO: 2.

13. Способ по п. 12, где домен H-NOX в каждом из трех мономеров связан через аминокислотный линкер с доменом сборки фибритина бактериофага T4, где указанный аминокислотный линкер составляет три, четыре, пять, шеть, семь, восемь, девять или десять аминокислот в длину.

14. Способ по п. 12, где каждый из трех мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

15. Способ по п. 1, где пегилированный тримерный белок H-NOX охарактеризован одним или более из следующего:

а) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ находится в пределах 2 порядков от константы диссоциации гемоглобина с O₂, и при этом реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 10 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина;

b) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 нМ до приблизительно 1000 нМ при 20°C;

c) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ при 20°C;

d) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ при 20°C;

e) реакционноспособность пегилированного тримерного белка H-NOX в отношении NO составляет менее чем приблизительно 700 с^-1 при 20°C;

f) реакционноспособность пегилированного тримерного белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 100 раз ниже или по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина;

g) k_off пегилированного тримерного белка H-NOX с кислородом меньше или равен приблизительно 0,65 с^-1 при 20°C, или приблизительно от 0,21 с^-1 до приблизительно 0,65 с^-1 при 20°C, или приблизительно от 1,35 с^-1 до приблизительно 2,9 с^-1 при 20°C, или

h) скорость самоокисления гема пегилированного тримерного белка H-NOX составляет менее чем приблизительно 1 ч^-1 при 37°C.

16. Способ по п. 1, где пегилированный тримерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

17. Способ по п. 1, где иммунотерапия представляет собой одно или несколько из вакцины против злокачественной опухоли, терапии адоптивными иммуноцитами или средства, мишенью которого является регулятор контрольной точки иммунного ответа.

18. Способ по п. 17, где мишенью иммунотерапии является один или более из CTLA-4, PD1, PD-L1, LAG-3 или TIM-3.

19. Способ по п. 18, где иммунотерапия представляет собой анти-CTLA-4 терапию, анти-PD-1 терапию, анти-PD-L1 терапию, анти-LAG-3 терапию, анти-TIM-3 терапию, двойную блокирующую PD-1/CTLA-4 терапию или двойную блокирующую PD-1/PD-L1 терапию.

20. Способ по п. 18, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию, анти-PD-L1 терапию и анти-CTLA-4 терапию, двойную блокирующую PD-1/CTLA-4 терапию или двойную блокирующую PD-1/PD-L1 терапию.

21. Способ по п. 20, где пегилированный трехмерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

22. Способ по п. 20, где иммунотерапия включает применение антагониста PD-1, антагониста PD-L1 или CTLA-4 антагониста.

23. Способ по п. 20, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию или анти-PD-L1 терапию.

24. Способ по п. 20, иммунотерапия включает применение антитела.

25. Способ по п. 23, где иммунотерапия включает применение анти-PD-1 антитела.

26. Способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий: (а) введение индивидууму эффективного количества пегилированного тримерного белка H-NOX, где пегилированный тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (“T. tengcongensis”) и домен тримеризации, где каждый из трех мономеров ковалентно связан с полиэтиленгликолем (“PEG”), где каждый домен H-NOX T. tengcongensis имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, за исключением аминокислотной замены L144F в SEQ ID NO: 2, и где домен тримеризации представляет собой домен сборки фибритина бактериофага T4; и (b) проведение иммунотерапии индивидуума, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию, анти-PD-L1 терапию, анти-CTLA-4 терапию, двойную блокирующую PD-1/CTLA-4 терапию или двойную блокирующую PD-1/PD-L1 терапию.

27. Способ по п. 26, где пегилированный тримерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

28. Способ по п. 26, где каждый из трех мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

29. Способ по п. 26, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию или анти-PD-L1 терапию.

30. Способ по п. 29, где иммунотерапия включает применение анти-PD-1 антитела.

31. Способ по п. 29, где пэгилированный тримерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

32. Способ по любому из пп. 1-31, где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль головного мозга, глиобластому, злокачественную опухоль кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланому, рак легких, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ануса, рак печени, печеночноклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак эндометрия, рак шейки матки, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак кишечника, рак щитовидной железы, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточный рак.

33. Способ по любому из пп. 1-31, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX является внутривенным.

34. Способ по любому из пп. 1-31, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX осуществляется болюсным введением и/или инфузией.

35. Способ по любому из пп 1-31, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX осуществляется перед или одновременно с проведением иммунотерапии.

36. Способ по любому из пп. 1-31, дополнительно включающий проведение лучевой терапии или химиотерапии индивидууму.

37. Способ по п. 36, где лучевая терапия представляет собой рентгеновские лучи.

38 Способ по любому из пп. 1-31, где индивидуум представляет собой человека.

39. Способ по п. 33, где млекопитающее представляет собой человека.

40. Применение пегилированного тримерного белка H-NOX для лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, где эффективное количество пегилированного тримерного белка H-NOX вводится в комбинации с иммунотерапией, где пегилированный тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX и домен тримеризации и где домен H-NOX представляет собой домен H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (“T. tengcongensis”), содержащий аминокислотную замену L144F в дистальном кармане.

41. Применение по п. 40, где домен H-NOX в каждом из мономеров ковалентно связан с доменом тримеризации.

42. Применение по п. 41, где C-конец домена H-NOX в каждом мономере ковалентно связан с доменом тримеризации.

43. Применение по п. 42, где домен H-NOX в каждом из мономеров связан с доменом тримеризации через аминокислотный линкер.

44. Применение по п. 43, где аминокислотный линкер составляет три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот в длину.

45. Применение по п. 44, где аминокислотный линкер содержит Gly-Ser-Gly.

46. Применение по п. 40, где домен тримеризации представляет собой домен сборки фибритина бактериофага T4.

47. Применение по п. 46, где домен сборки фибритина бактериофага T4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

48. Применение по п. 42, где каждый из мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

49. Применение по п. 42, где каждый из трех мономеров содержит молекулы PEG на мономер, где молекулярная масса каждой из трех молекул PEG составляет между 1 и 10 кДа.

50. Применение по п. 49, где каждый из трех мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

51. Применение по п. 40, где каждый домен H-NOX T. tengcongensis имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, за исключением замены L144F в SEQ ID NO: 2.

52. Применение по п. 51, где домен H-NOX в каждом из трех мономеров связан через аминокислотный линкер с доменом сборки фибритина бактериофага T4, где указанный аминокислотный линкер составляет три, четыре, пять, шеть, семь, восемь, девять или десять аминокислот в длину.

53. Применение по п. 51, где каждый из трех мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

54. Применение по п. 40, где пегилированный тримерный белок H-NOX охарактеризован одним или более из следующего:

а) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ находится в пределах 2 порядков от константы диссоциации гемоглобина с O₂, и при этом реакционноспособность белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 10 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина;

b) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 нМ до приблизительно 1000 нМ при 20°C;

c) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ при 20°C;

d) константа диссоциации пегилированного тримерного белка H-NOX с O₂ составляет приблизительно от 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ при 20°C;

e) реакционноспособность пегилированного тримерного белка H-NOX в отношении NO составляет менее чем приблизительно 700 с^-1 при 20°C;

f) реакционноспособность пегилированного тримерного белка H-NOX в отношении NO по меньшей мере в 100 раз ниже или по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем реакционноспособность в отношении NO гемоглобина;

g) k_off пегилированного тримерного белка H-NOX с кислородом меньше или равен приблизительно 0,65 с^-1 при 20°C, или приблизительно от 0,21 с^-1 до приблизительно 0,65 с^-1 при 20°C, или приблизительно от 1,35 с^-1 до приблизительно 2,9 с^-1 при 20°C, или

h) скорость самоокисления гема пегилированного тримерного белка H-NOX составляет менее чем приблизительно 1 ч^-1 при 37°C.

55. Применение по п. 40, где пегилированный тримерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

56. Применение по п. 40, где иммунотерапия представляет собой одно или несколько из вакцины против злокачественной опухоли, терапии адоптивными иммуноцитами или средства, мишенью которого является регулятор контрольной точки иммунного ответа.

57. Применение по п. 56, где мишенью иммунотерапии является один или более из CTLA-4, PD1, PD-L1, LAG-3 или TIM-3.

58. Применение по п. 57, где иммунотерапия представляет собой анти-CTLA-4 терапию, анти-PD-1 терапию, анти-PD-L1 терапию, анти-LAG-3 терапию, анти-TIM-3 терапию, двойную блокирующую PD-1/CTLA-4 терапию или двойную блокирующую PD-1/PD-L1 терапию.

59. Применение по п. 57, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию, анти-PD-L1 терапию и анти-CTLA-4 терапию, двойную блокирующую PD-1/CTLA-4 терапию или двойную блокирующую PD-1/PD-L1 терапию.

60. Применение по п. 59, где пегилированный трехмерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

61. Применение по п. 59, где иммунотерапия включает применение антагониста PD-1, антагониста PD-L1 или CTLA-4 антагониста.

62. Применение по п. 59, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию или анти-PD-L1 терапию.

63. Применение по п. 59, где иммунотерапия включает применение антитела.

64. Применение по п. 62, где иммунотерапия включает применение анти-PD-1 антитела.

65. Применение пегилированного тримерного белка H-NOX для лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, где эффективное количество пегилированного тримерного белка H-NOX вводят в комбинации с иммунотерапией, где пегилированный тримерный белок H-NOX содержит три мономера, где каждый мономер содержит домен H-NOX Thermoanaerobacter tengcongensis (“T. tengcongensis”) и домен тримеризации, где каждый из трех мономеров ковалентно связан с полиэтиленгликолем (“PEG”), где каждый домен H-NOX T. tengcongensis имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, за исключением аминокислотной замены L144F в SEQ ID NO: 2, и где домен тримеризации представляет собой домен сборки фибритина бактериофага T4; и (b) проведение иммунотерапии индивидуума, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию, анти-PD-L1 терапию, анти-CTLA-4 терапию, двойную блокирующую PD-1/CTLA-4 терапию или двойную блокирующую PD-1/PD-L1 терапию.

66. Применение по п. 65, где пегилированный тримерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

67. Применение по п. 65, где каждый из трех мономеров содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

68. Применение по п. 65, где иммунотерапия представляет собой анти-PD-1 терапию или анти-PD-L1 терапию.

69. Применение по п. 68, где иммунотерапия включает применение анти-PD-1 антитела.

70. Применение по п. 68, где пэгилированный тримерный белок H-NOX не является инкапсулированным.

71. Применение по любому из пп. 40-70, где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль головного мозга, глиобластому, злокачественную опухоль кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланому, рак легких, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ануса, рак печени, печеночноклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак эндометрия, рак шейки матки, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак кишечника, рак щитовидной железы, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак почки, рак молочной железы, множественную миелому, саркому или плоскоклеточный рак.

72. Применение по любому из пп. 40-70, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX является внутривенным.

73. Применение по любому из пп. 40-70, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX осуществляется болюсным введением и/или инфузией.

74. Применение по любому из пп. 40-70, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX осуществляется перед или одновременно с проведением иммунотерапии.

75. Применение по любому из пп. 40-70, где введение пегилированного тримерного белка H-NOX дополнительно включает проведение лучевой терапии или химиотерапии индивидууму.

76. Применение по п. 75, где лучевая терапия представляет собой рентгеновские лучи.

77. Применение по любому из пп. 40-70, где индивидуум представляет собой человека.

78. Применение по п. 72, где млекопитающее представляет собой человека.