Способ продуцирования серосодержащей аминокислоты или ее производного Российский патент 2023 года по МПК C12P13/12 C12N15/70 C12N15/77 C07K14/34 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот.

Уровень техники

L-аминокислоты получают в промышленности с помощью методов ферментации с использованием микроорганизмов, принадлежащих роду Brevibacterium, роду Corynebacterium, роду Escherichia и им подобных. В таких способах продуцирования используют бактериальные штаммы, выделенные из природного источника, их искусственные мутантные штаммы или штаммы, модифицированные для обеспечения повышенной активностью фермента, вовлеченного в биосинтез L-аминокислоты, посредством технологии рекомбинантных ДНК.

При этом серосодержащие аминокислоты используют в качестве ингредиентов для синтеза кормов для животных, пищевых добавок, фармацевтических инъецируемых жидкостей и лекарственных средств, и были проведены исследования по биологическому получению серосодержащих аминокислот и их производных.

Например, в заявке на патент США No. US 2009-0298135 А1 раскрыто получение 0,8 г/л L-метионина путем делетирования гена metJ из генома Escherichia coli и сверхэкпрессии белка YjeH, который представляет собой экспортер L-метионина. Также сообщалось, что полипептиды BrnF и BrnE являются экспортерами L-метионина Corynebacterium glutamicum (С.Troschel et al., Journal of Bacteriology, pp.3786-3794, June 2005).

При этом при продуцировании серосодержащих аминокислот количество NADPH, потребленного микроорганизмами, может варьировать в зависимости от восстановительной способности источника серы. Например, в то время как сульфиды, которые не требуют NADPH, имеют самые высокие теоретические выходы, сульфаты, которые требуют четыре молекулы NADPH, имеют низкие теоретические выходы. Однако сульфиды являются невыгодными в том аспекте, что они, как известно, вызывают повреждение клеток и имеют низкую стабильность. Следовательно, высокий выход продукции серосодержащих аминокислот можно ожидать при использовании тиосульфата, который представляет собой источник серы с низкой потребностью в NADPH и высокой внутриклеточной стабильностью. Однако в то время как наличие у Escherichia coli мембранного белка, способного использовать тиосульфат, было подтверждено (J Bacteriol. 1995 Jul; 177 14), мембранный белок у микроорганизмов рода Corynebacterium, способный эффективно использовать тиосульфат, не был раскрыт в уровне техники.

Техническая задача

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что белок, кодируемый геном ssuABC, вовлечен в поступление тиосульфата в микроорганизм и подтвердили, что микроорганизм, модифицированный так, чтобы иметь повышенную активность этого белка, обладает повышенной способностью продуцировать серосодержащие аминокислоты с использованием тиосульфата в качестве источника серы, тем самым выполняя настоящее изобретение.

Техническое решение

В настоящем изобретении предложен способ продуцирования серосодержащей аминокислоты и производного серосодержащей аминокислоты, включающий культивирование генетически модифицированного микроорганизма в культуральной среде, содержащей тиосульфат, где микроорганизм содержит генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

В настоящем изобретении предложен микроорганизм, продуцирующий серосодержащую аминокислоту или производное серосодержащей аминокислоты, содержащий генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

В настоящем изобретении предложена композиция для продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты, включающая микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, или его культуру и тиосульфат.

В настоящем изобретении предложено применение белка, кодируемого геном ssuABC, в качестве транспортера тиосульфата.

В настоящем изобретении предложено применение микроорганизма, содержащего генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, для продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты.

Полезные эффекты

Серосодержащие аминокислоты или их производные можно получать в промышленном масштабе с использованием микроорганизма, композиции и способа получения серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты с использованием такого(ой) же микроорганизма и композиции по настоящему изобретению, и таким образом их можно эффективно использовать в получении полезных продуктов, включая серосодержащие аминокислоты или их производные.

Наилучшее воплощение изобретения

Каждое описание и воплощение, раскрытое в настоящем изобретении, можно применять здесь к различным описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации различных компонентов, раскрытых в настоящем изобретении, включены в объем настоящего изобретения. Более того, объем настоящего изобретения не ограничен приведенными ниже описаниями.

Специалист в данной области техники понимает или способен определить, используя только рутинные эксперименты, множество воплощений, эквивалентных конкретным воплощениям настоящего изобретения. Подразумевается, что объем настоящего изобретения охватывает такие эквивалентные воплощения.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования серосодержащей аминокислоты и производного серосодержащей аминокислоты, включающий культивирование генетически модифицированного микроорганизма в культуральной среде, содержащей тиосульфат.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен генетически модифицированный микроорганизм, продуцирующий серосодержащую аминокислоту или производное серосодержащей аминокислоты.

Микроорганизм может содержать генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с микроорганизмом до генетической модификации.

Способ продуцирования может включать культивирование микроорганизма, обладающего повышенной активностью белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с естественной активностью, в культуральной среде, содержащей тиосульфат.

В одном воплощении настоящего изобретения способ может представлять собой способ повышения продуцирования серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот микроорганизмом ssuABC, по сравнению с естественным.

Способ продуцирования может включать приведение микроорганизма, обладающего повышенной активностью белка, кодируемого геномной активностью, в контакт с тиосульфатом.

При использовании в настоящем документе выражение "белок, кодируемый геном ssuABC" относится к белку, который кодирует ген ssuABC, или белку, экспрессируемому геном ssuABC, и может быть обозначен как "белок SsuABC" (здесь и далее, обозначен как "белок SsuABC"). Традиционно считается известным, что белок SsuABC вовлечен в транспорт алифатического сульфоната. Этот белок представляет собой один тип из АТР-связывающих кассетных транспортеров (ABC-транспортеров) и известно, что он присутствует у таких микроорганизмов, как Escherichia coli, Bacillus clausii, Xanthomonas citri и Corynebacterium glutamicum. Белок SsuABC представляет собой комплекс белков SsuA, SsuB и SsuC, и SsuA известен как периплазматический связывающий белок. SsuB известен как нуклеотидсвязывающий белок, и SsuC известен как АВС-транспортер-пермеаза. Однако не известно, вовлечен ли этот белковый комплекс в транспорт тиосульфата более, чем алифатического сульфоната.

В настоящем изобретении было впервые выявлено, что белок SsuABC вовлечен в транспорт тиосульфата, и было подтверждено, что продуцирование серосодержащей аминокислоты может быть увеличено путем повышения активности одного из белков, выбранных из SsuA, SsuB и SsuC, которые являются компонентами белка SsuABC.

Белок SsuABC по настоящему определению может быть получен из микроорганизма, принадлежащего роду Corynebacterium, но не ограничиваясь этим.

В частности, белок SsuABC может иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium suranareeae или Corynebacterium flavescens, более конкретно иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium deserti или Corynebacterium suranareeae, еще более конкретно иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum, не ограничиваясь ими. Аминокислотная последовательность, полученная для белка SsuABC, принадлежащего роду Corynebacterium, быть доступна из известной базы данных, такой как GenBank от Национального центра биотехнологической информации США, не ограничиваясь этим.

Белок SsuABC по настоящему изобретению можно рассматривать не только как один или более чем один белок и/или белковый комплекс, вовлеченный в транспорт тиосульфата, но также как систему, включающую один или более чем один белок и/или белковый комплекс в качестве компонента, то есть, как саму систему транспорта тиосульфата. То есть, в системе, а которой один или более чем один белок взаимодействует для транспортировки субстрата, термин "транспортер" можно понимать как включающий не только каждый белок, но также два или более чем два белка или целую систему во всем настоящем описании.

Белки SsuA, SsuB и SsuC, составляющие белок SsuABC по настоящему изобретению, могут иметь аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 80% идентичности аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 43, 44 и 45, соответственно. В частности, белки SsuA, SsuB и SsuC могут включать аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 43, 44 и 45, соответственно, или могут включать аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97% или 99% гомологии или идентичности аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 43, 44 и 45, соответственно. Также очевидно, что любой белок, имеющий аминокислотные последовательности, включающие делецию, модификацию или добавление нескольких аминокислот, попадает в объем настоящего изобретения, при условии, что эти аминокислотные последовательности сохраняют вышеописанную гомологию или идентичность и действия, эквивалентные таковым этого полипептида (то есть, активность, специфичную в отношении транспорта тиосульфата по отношению к другим источникам серы).

Кроме того, любой полипептид, обладающий активностью тиосульфат-специфичного транспортера и кодируемый полинуклеотидом, гибридизуемым с зондом, сконструированным с использованием известных генных последовательностей, например нуклеотидной последовательности, полностью или частично комплементарной данному полинуклеотиду, в строгих условиях, также может быть включен без ограничений.

То есть, хотя в настоящем изобретении используют выражение "белок или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность заданной SEQ ID NO", "белок или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности заданной SEQ ID NO" или "белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность заданной SEQ ID NO", очевидно, что любой белок, включающий делецию, модификацию, замену, консервативную замену или добавление одной или нескольких аминокислот, можно использовать в настоящем изобретении при условии, что белок обладает активностью идентичной или эквивалентной таковой полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO. Например, можно использовать добавление последовательность, не изменяющую функцию белка, на N-конце и/или С-конце аминокислотной последовательности, природную мутацию, молчащую мутацию в ней или консервативную замену в ней.

При использовании в настоящем документе термин "консервативная замена" относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую похожими структурными и/или химическими свойствами. Такая аминокислотная замена обычно может происходить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатка.

В одном воплощении настоящего изобретения ген ssuABC может включать нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8. В частности, ген ssuABC может состоять из нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8, не ограничиваясь этим.

При использовании в настоящем документе термин "полинуклеотид" имеет инклюзивное значение, включающее молекулы ДНК и РНК, и нуклеотид, представляющий собой базовую структурную единицу полинуклеотида, может включать не только природный нуклеотид, но также аналог, в котором сахар или основание модифицированы (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).

Полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид (ген ssuABC), кодирующий белок SsuABC по настоящему изобретению. Полинуклеотид по настоящему изобретению может включать различные модификации, сделанные в кодирующей области, при условии, что не изменяется аминокислотная последовательность полипептида, экспрессируемого с кодирующей области, вследствие вырожденности генетического кода или с учетом кодонов, предпочтительных для живого организма, в котором экспрессируется белок. Полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой, например, полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии или идентичности с белком SsuABC по настоящему изобретению. В частности, например, полинуклеотиды, кодирующие белки, содержащие аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 80% гомологии или идентичности с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 43, 44 и 45, соответственно, могут представлять собой полинуклеотиды, имеющие по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии или идентичности с частью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8. В частности, полинуклеотиды, кодирующие белки, содержащие аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 80% идентичности с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 43, 44 и 45, соответственно, могут представлять собой полинуклеотиды, имеющие по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии или идентичности по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из полинуклеотида, включающего с 2530^ого по 3489^ый нуклеотид; полинуклеотид а, включающего с 1789^ого по 2520™ нуклеотид, и полинуклеотида, включающего с 1004^ого по 1774^ый нуклеотид в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8, не ограничиваясь этим.

Дополнительно, очевидно, что также может быть включен любой полинуклеотид, который может транслироваться в белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44 и 45 вследствие вырожденности генетического кода, и белок, имеющий гомологию или идентичность с таким белком. Альтернативно, любой полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44 и 45 и гибридизуемый с зондом, сконструированным с использованием известных генных последовательностей, например нуклеотидной последовательности полностью или частично комплементарной этой полинуклеотидной последовательности, в строгих условиях, может быть включен без ограничения. Термин "строгие условия" обозначает условия, дающие возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия подробно раскрыты в известных документах (Например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Например, строгие условия могут включать проведение гибридизации между генами, имеющими высокую степень гомологии или идентичности, например, 70% или более гомологии или идентичности, 80% или более, 85% или более, в частности 90% или более, более конкретно 95% или более, еще более конкретно 97% или более, или наиболее конкретно 99% или более, без проведения гибридизации между генами, имеющими меньшую степень гомологии или идентичности, чем указанная выше степень гомологии или идентичности, или однократную промывку, в частности двукратную или трехкратную промывку в традиционных условиях промывки для гибридизации по Саузерну при концентрации соли и температуре 60°С, 1×SSC и 0,1% SDS, в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS и более конкретно 68°С, 0,1×SSC и 0,1% SDS.

Для гибридизации необходимо, чтобы два полинуклеотида имели комплементарные последовательности, хотя основания могут не соответствовать друг другу в зависимости от степени строгости гибридизации. Термин "комплементарный" используют для описания взаимодействия между основаниями нуклеотидов, способными гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, настоящее изобретение может включать не только по существу похожую нуклеотидную последовательность, но также и полинуклеотидный фрагмент, который является отдельным, но комплементарен полной последовательности.

В частности, полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему изобретению, могут быть определены с помощью условий гибридизации, включающих процесс гибридизации, выполненный при значении T_m 55°С и в вышеописанных условиях. Также значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничиваясь этим, и может быть подходящим образом уточнено специалистом в данной области техники в соответствии с поставленными задачами.

Подходящая степень строгости условий для гибридизации полинуклеотидов может зависеть от длин и степени комплементарности полинуклеотидов, и ее параметры хорошо известны в данной области техники (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

При использовании в настоящем документе термин "гомология" или "идентичность" относятся к степени родства между двумя аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и она может быть выражена в процентах. Термины "гомология" и "идентичность" часто можно использовать взаимозаменяемо.

Гомологию или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов или полипептидов можно определить по стандартному алгоритму выравнивания, и в нем можно использовать штрафы за пропуск в последовательности, по умолчанию установленные в программе. По существу, гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться друг с другом по меньшей мере примерно на 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от полной последовательности или полной длины в умеренно или очень строгих условиях. Очевидно, что полинуклеотиды, содержащие основной кодон или вырожденный кодон, также можно рассматривать для гибридизации.

Гомологию, сходство или идентичность между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями можно определить с помощью любого компьютерного алгоритма, известного в данной области техники, например, программы "FASTA", с использованием параметров по умолчанию, введенных Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. Альтернативно, гомологию, сходство или идентичность можно определить с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443^153), который реализован в программе Needleman пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включающем пакет программ GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно определять с использованием BLAST из базы данных Национального центра биотехнологической информации США или ClustalW.

Гомологию, сходство или идентичность между полинуклеотидами или полипептидами можно определить путем сравнения информации о последовательностях с использованием компьютерной программы GAP, представленной Needleman et al., (1970), J Mol Biol. 48:443, как раскрыто в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Вкратце, программа GAP определяет сходство как число выровненных символов (то есть, нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, разделенное на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (включающую значение 1 для совпадений и 0 для несовпадений) и взвешенную матрицу сравнения от Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. \A\61A5, как описано Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979) (или матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 EMBOSS)); (2) штраф 3,0 за каждый пропуск и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пропуске (или штраф за внесение пропуска 10 и штраф за продление пропуска 0,5) и (3) отсутствие штрафа за окончание пропуска.

Также, гомологию, сходство или идентичность последовательностей между двумя данными полинуклеотидами или полипептидами можно определить путем сравнения их последовательностей путем гибридизации по Саузерну в определенных строгих условиях, и определенные строгие условия гибридизации входят в объем данной технологии, и их можно определить способом, хорошо известным специалисту средней квалификации в данной области техники (Например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

При использовании в настоящем документе термин "усиление" активности полипептида или белка относится к увеличению активности полипептида по сравнению с его естественной активностью. Термин "усиление" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "повышающая регуляция (up-regulation)", "сверхэкспрессия", "увеличение" и им подобными.

В этом отношении увеличение может включать проявление активности, которой не было изначально, или проявление повышенной активности по сравнению с естественной активностью либо активностью до модификации. Термин "естественная активность" относится к активности определенного полипептида или белка, которой исходно обладал родительский штамм или немодифицированный микроорганизм до трансформации, при которой микроорганизм трансформируют путем генетической модификации, вызванной природным или искусственным фактором. Этот термин можно использовать взаимозаменяемо с выражением "активность до модификации". "Усиление" или "увеличение" активности полипептида или белка по сравнению с естественной активностью означает, что активность определенного полипептида или белка улучшена по сравнению с активностью, которой исходно обладает родительский штамм или немодифицированный микроорганизм до трансформации.

Термин "увеличение активности" может обозначать увеличение, достигнутое путем введения чужеродного полипептида или белка, или усиления активности эндогенного полипептида или белка, в частности достигнутое путем усиления активности эндогенного полипептида или белка. Это усиление активности полипептида или белка можно определить на основании увеличения степени активности полипептида или белка, уровня его экспрессии или количества производимого им продукта.

При использовании в настоящем документе выражение "усиление или увеличение активности белка, кодируемого геном ssuABC, или белка SsuABC" также может быть обозначено как "генетическая модификация для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC", и это означает, что активность по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белков SsuA, SsuB и SsuC, составляющих белок SsuABC, повышена по сравнению с естественной активностью.

Повышение активности белка SsuABC может включать как повышение активности путем введения по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из чужеродных белков SsuA, SsuB и SsuC и усиления активности по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из эндогенных белков SsuA, SsuB и SsuC.

При использовании в настоящем документе термин "введение белка" относится к обеспечению активности определенного белка у микроорганизма, у которого исходно нет этого белка, или усилению активности белка по сравнению с естественной активностью белка или активностью до модификации. Например, введение белка может относиться к введению определенного белка, введению полинуклеотида, кодирующего определенный белок, в хромосому микроорганизма или введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий определенный белок, в микроорганизм, тем самым обеспечивая активность белка.

Повышение активности полипептида или белка может быть достигнуто путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники без ограничения, при условии, что активность целевого полипептида или белка усилена по сравнению с таковой у микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать любые методы генетической инженерии и/или белковой инженерии, хорошо известные в данной области техники как обычные методы молекулярной биологии, не ограничиваясь ими (Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. AdvΔNces in Cell Biology. 2010, Vol. 2.1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и так далее).

В частности, в настоящем изобретении усиление активности может быть достигнуто путем:

(1) увеличения числа копий гена или полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, в клетке;

(2) замены области регуляции экспрессии гена, кодирующего полипептид или белок, на хромосоме последовательностью с более высокой активностью;

(3) модификации последовательности оснований, кодирующей инициирующий кодон или участок 5'-UTR (5'-нетранслируемой области) полипептида или белка;

(4) модификации нуклеотидной последовательности на хромосоме для усиления активности полипептида или белка;

(5) введения чужеродного полинуклеотида, обладающего активностью данного полипептида или белка, или кодон-оптимизированного варианта полинуклеотида; или

(6) модификации для усиления активности путем любой комбинации вышеописанных способов, не ограничиваясь ими.

Способ повышения активности полипептида или белка методом белковой инженерии может быть выполнен путем модификации или химической модификации поверхностного участка, выбранного путем анализа трехмерной структуры полипептида или белка, не ограничиваясь этим.

Увеличение числа копий гена или полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, описанный в (1) выше, может быть выполнено любым способом, хорошо известным в данной области техники, например, путем введения вектора, который реплицируется и функционирует независимо от клетки-хозяина и функционально связан с геном или полинуклеотидом, кодирующим полипептид или белок, в клетку-хозяина. Альтернативно, увеличение числа копий может быть выполнено путем введения вектора, который функционально связан с геном и способен вставлять ген или полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничиваясь этим.

Замена области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) гена, кодирующего полипептид или белок, на хромосоме последовательностью с более высокой активностью, описанная в (2) выше, может быть выполнена любым способом, известным в данной области техники, например путем введения мутации в последовательность путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или любой их комбинации или путем замены этой последовательности на последовательность с более высокой активностью для дополнительного усиления активности области регуляции экспрессии. Область регуляции экспрессии может содержать промотор; последовательность оператора; последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции, не ограничиваясь ими. Например, способ может быть выполнен путем присоединения более сильного гетерологичного промотора вместо естественного промотора, не ограничиваясь этим.

Примеры более сильных промоторов, известных в данной области техники, могут включать промоторы cj1 - cj7 (Патент США No. US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор lysCP1 (US 2010-0317067 A1), промотор spl1, промотор spl7, промотор spl13 (US 10584338 B2), промотор gap А, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА или асеВ, промотор 02 (Патент США No. US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, не ограничиваясь ими.

Модификация последостельности оснований, кодирующей инициирующий кодон или участок 5'-UTR полипептида или белка, описанная в (3) выше, может быть выполнена любым способом, известным в данной области техники, например, путем замены естественного кодона инициации на другой кодон инициации с более высоким уровнем экспрессии полипептида или белка, не ограничиваясь этим.

Модификация нуклеотидной последовательности на хромосоме для усиления активности полипептида или белка, описанная в (4) выше, может быть выполнена любым способом, известным в данной области техники, например путем индуцирования модификации последовательности регуляции экспрессии путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены, или любой их комбинации для дальнейшего усиления активности нуклеотидной последовательности или замены последовательности нуклеотидной последовательностью, модифицированной для повышения активности. Замена может представлять собой вставку гена в хромосому путем гомологичной рекомбинации, не ограничиваясь этим. Вектор, используемый при этом, может дополнительно содержать селективный маркер для определения вставки в хромосому.

Введение чужеродного полинуклеотида, обладающего активностью полипептида или белка, описанное в (5) выше, может быть выполнено любым способом, известным в данной области техники, например путем введения чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, обладающий активностью идентичной/подобной таковой полипептида или белка, или введения кодон-оптимизированного варианта этого полинуклеотида в клетку-хозяина. Происхождение или последовательность чужеродного полинуклеотида специально не ограничены, при условии, что чужеродный полинуклеотид проявляет активность идентичную/подобную таковой полипептида или белка. Кроме того, в клетку-хозяина может быть введен чужеродный полинуклеотид, кодон-оптимизированный для оптимизированной транскрипции и трансляции в клетке-хозяине. Введение может быть выполнено любым известным способом трансформации, подходящим образом выбранным специалистом средней квалификации в данной области техники. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, продуцируется полипептид или белок, за счет чего повышается его активность.

Наконец, комбинация вышеописанных способов, описанная в (6), может быть выполнена путем применения одного или более чем одного способа, описанного в (1) -(5)- Усиление активности полипептида или белка, как описано выше, может представлять собой повышение активности или концентрации полипептида или белка по сравнению с активностью или концентрацией полипептида или белка, экспрессируемого в штаммах микроорганизмов дикого типа или немодифицированных микроорганизмов, либо увеличение количества продукта, полученного посредством этого полипептида или белка, не ограничиваясь этим.

При использовании в настоящем документе термин "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" не исключает штаммы, содержащие природные мутации в микроорганизмах, и может относиться к штамму дикого типа или штамму природного типа или штамму до трансформации путем генетической модификации вследствие природного или искусственного фактора. Термины "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "немутированный штамм", "немодифицированный штамм", "немутированный микроорганизм", "немодифицированный микроорганизм" или "референсный микроорганизм".

При использовании в настоящем документе термин "вектор" относится к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, и функционально связанную с подходящей регуляторной последовательностью, так чтобы обладать способностью экспрессировать целевой белок в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий мРНК-сайт связывания рибосомы, и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции. Когда подходящую клетку-хозяина трансформируют вектором, вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может быть интегрирован в геном хозяина. Например, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в хромосому с помощью вектора для вставки в хромосому в клетках. Вставку полинуклеотида в хромосому можно выполнять любым способом, известным в данной области техники, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь этим. Вектор может дополнительно содержать селективный маркер для определения вставки в хромосому. Селективный маркер используют для отбора клеток, которые трансформированы вектором, то есть, для подтверждения вставки требуемых молекул нуклеиновой кислоты, и примеры селективных маркеров могут включать маркеры, обеспечивающие селектируемые фенотипы, такие как толерантность к лекарственным средствам, потребность в питательных веществах, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностного полипептида. Только клетки, экспрессирующие селективный маркер, способны выживать или демонстрировать различные фенотипы в условиях окружающей среды, обработанной селективным агентом, и таким образом можно отбирать трансформированные клетки.

Вектор, используемый в настоящем изобретении, конкретно не ограничен, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры векторов, обычно используемых в данной области техники, могут включать природную или рекомбинатную плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг.Например, pWE15, М13, MBL3, MBL4, ГХП, AS НИ, АРП, t10, til, Charon4A и Charon21A можно использовать в качестве фагового вектора или космидного вектора. В качестве плазмидного вектора можно использовать тип pBR, тип pUC, тип pBluescriptll, тип pGEM, тип pTZ, тип pCL и тип рЕТ. В частности, можно использовать pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC. Однако настоящее воплощение не ограничено ими.

При использовании в настоящем документе термин "трансформация" относится к процессу введения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом, экспрессируется в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может присутствовать либо в форме, вставленной в хромосому клетки-хозяина, либо в форме, локализованной вне хромосомы, при условии, что белок экспрессируется в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и/или РНК, кодирующую целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в любой форме, при условии, что полинуклеотид введен в клетку-хозяина, и полипептид экспрессируется в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все существенные элементы, необходимые для саморепликации. Экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме самореплицирующегося вектора экспрессии. Также полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в его исходной форме и функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, не ограничиваясь этим.

Кроме того, при использовании в настоящем документе термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью промотора, которая дает возможность инициации и процесса прохождения транскрипции полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению, и последовательностью гена.

Способы трансформации вектором по настоящему изобретению включают любые способы, дающие возможность введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, и могут быть выполнены любыми подходящими стандартными методами, хорошо известными в данной области техники, выбранными в соответствии с клеткой-хозяином. Например, можно использовать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцию, полиэтиленгликолевый метод (PEG), DEAE-декстрановый метод, катионно-липосомный метод и метод с ацетатом лития-DMSO, однако настоящее изобретение не ограничено этим.

Микроорганизм по настоящему изобретению может включать как микроорганизмы дикого типа, так и микроорганизмы, содержащие природные или искусственные генетические модификации, и любой микроорганизм, в который введен транспортер тиосульфата или содержащий транспортер тиосульфата по настоящему изобретению, может быть включен сюда без ограничения.

Микроорганизм по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одно из транспортера тиосульфата по настоящему изобретению; полинуклеотида, кодирующего такой транспортер тиосульфата, и вектора, содержащего такой полинуклеотид.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты и/или их производные.

При использовании в настоящем документе термин "микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты и/или их производные" включает как микроорганизм, от природы обладающий способностью продуцировать L-аминокислоты/их производные, так и микроорганизм, полученный путем придания способности продуцировать L-аминокислоты/их производные родительскому штамму, неспособному продуцировать L-аминокислоты или их производные. В частности, любой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования целевой L-аминокислоты или ее производных, благодаря наличию определенного механизма, ослабленного или усиленного за счет введения экзогенного гена либо усиления или инактивации активности эндогенного гена.

Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, у которого путь биосинтеза L-аминокислоты усилен или путь ее расщепления ослаблен. Например, микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту, может представлять собой микроорганизм, у которого путь биосинтеза L-метионина усилен.

Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, у которого активность белка-репрессора биосинтеза метионина и цистеина (McbR) или белка MetJ ослаблена или устранена, или микроорганизм, у которого способность продуцировать метионин усилена и/или увеличена путем усиления активности метионин синтазы (MetH) или сульфитредуктазы (CysI). Альтернативно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, у которого экспрессия гена, кодирующего фермент, вовлеченный в путь биосинтеза L-аминокислоты, усилен, или фермент, вовлеченный в путь расщепления L-аминокислоты ослаблен/инактивирован.

В частности, примеры белков или генов, экспрессию которых можно контролировать для усиления пути биосинтеза L-аминокислот или ослабления/инактивации пути их расщепления, являются такими, как указано далее. Они представлены в следующем порядке: белок; репрезентативный ген, кодирующий белок, и его репрезентативный номер ЕС. Первая буква названия белка является заглавной буквой, а название гена обозначено курсивом. Например, можно использовать тиосульфат-серотрансферазу, такую как Rdl2p, GlpE, PspE, YgaP, Thil, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, Ncgl1369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCG12678 и NCgl2890; сульфитредуктазу, CysI; транспортную систему тиосульфат/сульфат, cysPUWA (EC 3.6.3.25); 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат-редуктазу, cysH (EC 1.8.4.8); сульфитредуктазу, cysJI (EC 1.8.1.2); цистеин-синтазу A, cysK (EC 2.5.1.47); цистеин-синтазу В, cysM (EC 2.5.1.47); серин-ацетилтрансферазу, cysE (EC 2.3.1.30); систему расщепления глицина, gcvTHP-lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4); липоилсинтазу, lipA (EC 2.8.1.8); липоил-протеинлигазу, lipB (EC 2.3.1.181); фосфоглицерат дегидрогеназу, serA (EC 1.1.1.95); 3-фосфосерин-фосфатазу, serB (EC 3.1.3.3); 3-фосфосерин/фосфогидрокситреонин-аминотрансферазу, serC (EC 2.6.1.52); серин-гидроксиметилтрансферазу, glyA (EC 2.1.2.1); аспартокиназу I (EC 2.7.2.4); гомосерин-дегидрогеназу I, thrA (EC 1.1.1.3); аспартаткиназу, lysC (EC 2.7.2.4); гомосерин-дегидрогеназу, hom (EC 1.1.1.3); гомосерин-(9-ацетилтрансферазу, metX (EC 2.3.1.31); гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, metA (EC 2.3.1.46); цистатионин-гашш-синтазу, metB (EC 2.5.1.48); p-C-S-лиазу, aecD (EC 4.4.1.8, бета-лиаза); цистатионин-бета-лиазу, metC (EC 4.4.1.8); В12-независимую гомоцистеин-S-метилтрансферазу, metE (EC 2.1.1.14); метионин-синтазу, metH (EC 2.1.1.13); метилентетрагидрофолатредуктазу, metF (EC 1.5.1.20); экспортер L-метионина BrnFE; экспортер валина YgaZH (B2682, B2683), ygaZH (B2682, B2683); экспортер YjeH, b414P, пиридиннуклеотид-трансгидрогеназу PntAB, pntAB (EC 1.6.1.2); (9-сукцинил-гомосерин-сульфгидрилазу, MetZ (EC 2.5.1.48) и фосфоенолпируват карбоксилазу, Рус (ЕС 4.1.1.31). Путь биосинтеза L-аминокислот может быть усилен, или путь их расщепления может быть ослаблен путем усиления активности одного или более чем одного белка, описанного выше, или нескольких белков, составляющих систему, либо путем сверхэкспрессии полинуклеотидов, кодирующих такие белки. Альтернативно, по меньшей мере один белок, выбранный из глюкозо-6-фосфат изомеразы, pgi (ЕС 5.3.1.9); гомосеринкиназы, thrB (ЕС 2.7.1.39); S-аденозинметионин-синтазы, metK (ЕС 2.5.1.6); дигидродипиколинат-синтазы, dapA (ЕС 4.2.1.52); фосфоенолпируват-карбоксикиназы, рек (ЕС 4.1.1.49); формилтетрагидрофолат-гидролазы, purU (ЕС 3.5.1.10); пируваткиназы I, pykF (ЕС 2.7.1.40); пируваткиназы II, рукА (ЕС 2.7.1.40); цистатионин-у-лиазы, cg3086 (ЕС 4.4.1.1); цистатионин-β-синтазы, cg2344 (ЕС 4.2.1.22); регуляторного белка Cg3031, cg3031; белка-репрессора биосинтеза метионина и цистеина McbR, mcbR; белка-репрессора транскрипции Met, metJ; транспортера L-метионина MetQNI, metQ, metN, metl; N-ацилтрансферазы, yncA; sRNA (малая РНК)fnrS и транспортера L-метионина, metP, может быть инактивирован или ослаблен, либо экспрессия гена, кодирующего белок, может быть подавлена или устранена.

Однако, это только примеры, и микроорганизм может представлять собой микроорганизм, у которого экспрессия гена, кодирующего фермент, вовлеченный в различные известные пути биосинтеза L-аминокислот, повышена, или фермент, вовлеченный в пути расщепления, инактивирован/ослаблен. Повышение активности белка и увеличение экспрессии гена являются такими как описано выше.

При использовании в настоящем документе термин "инактивация" или "ослабление" полипептида или белка представляет собой понятие, включающее как уменьшение, так и устранение активности по сравнению с естественной активностью. Термины "инактивация" или "ослабление" можно использовать взаимозаменяемо с термином "понижающая регуляция", "снижение" и "уменьшение". Инактивация или ослабление может включать случай, когда активность белка уменьшена или устранена по сравнению с естественной активностью микроорганизма путем мутации гена, кодирующего белок, модификации последовательности регуляции экспрессии или полной либо частичной делеции гена; случай, когда общая активность белка в клетке ниже, чем активность в нативных штаммах или немодифицированных штаммах, вследствие ингибирования экспрессии или трансляции гена, кодирующего этот белок; случай, когда ген не экспрессируется, и случай, когда активность отсутствует, несмотря на то, что ген экспрессируется.

В настоящем изобретении инактивация/ослабление белка может быть достигнута(то) различными способами, хорошо известными в данной области техники, не ограничиваясь этим (Nakashima N. et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. IntJMol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).

Примеры способов включают:

(1) полную или частичную делецию гена, кодирующего белок,

(2) модификацию области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего белок,

(3) модификацию последовательности гена, кодирующего белок, для устранения или ослабления активности белка,

(4) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, введение антисмысловой РНК), комплементарно связывающегося с транскриптом гена, кодирующего белок,

(5) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего белок, выше по течению от последовательности Шайна-Дальгарно для образования вторичной структуры, предупреждающей связывание рибосомы с этой последовательностью,

(6) добавление промотора для обратной транскрипции на 3'-конец открытой рамки считывания (ORF) нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок (Технология обратной транскрипции, RTE), или любую их комбинацию, не ограничиваясь ими.

В частности, полная или частичная делеция гена, кодирующего белок, может быть выполнена путем замены полинуклеотида, кодирующего естественный целевой белок в хромосоме, на полинуклеотид с делецией нескольких нуклеотидов или маркерный ген с помощью вектора для вставки в хромосому в микроорганизме. В качестве примера полной или частичной делеции полинуклеотида можно использовать способ делеции полинуклеотида путем гомологичной рекомбинации, не ограничиваясь этим.

Кроме того, полную или частичную делецию гена можно выполнять путем индуцирования мутации с помощью излучения, такого как УФ-излучение, или химического вещества, и отбора мутантных штаммов с делецией целевого гена. Получение делеции гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Технологию рекомбинантной ДНК можно применять путем индуцирования гомологичной рекомбинации путем вставки нуклеотидной последовательности или вектора, имеющей(его) гомологию с целевым геном, в микроорганизм. Дополнительно, вставленная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, не ограничиваясь этим.

Кроме того, может быть выполнена модификация последовательности регуляции экспрессии путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники. Например, модификация может быть выполнена путем индуцирования мутации в области регуляции экспрессии (последовательности регуляции экспрессии) путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или любой их комбинации для дополнительного снижения активности области регуляции экспрессии (последовательность регуляции экспрессии) или путем замены последовательности на последовательность, имеющую более слабую активность. Область регуляции экспрессии может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность регуляции терминации транскрипции и трансляции, не ограничиваясь ими.

Также модификация последовательности гена может быть выполнена путем индуцирования мутации в последовательности гена путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или любой их комбинации для дополнительного снижения активности полипептида или путем замены этой последовательности на последовательность гена, модифицированную с тем, чтобы иметь более слабую активность, или последовательность гена, модифицированную с тем, чтобы не иметь активности, не ограничиваясь этим.

Например, экспрессия гена может быть подавлена или ослаблена путем образования кодона терминации путем введения мутации в последовательность гена.

Однако вышеописанные способы представляют собой исключительно примеры, и специалисты средней квалификации в данной области техники могут получить микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты и/или их производные, с использованием любых способов, известных в данной области техники.

L-аминокислота и/или ее производное может представлять собой серосодержащую аминокислоту и/или производное серосодержащей аминокислоты.

При использовании в настоящем документе термин "серосодержащая аминокислота" или "производное серосодержащей аминокислоты" относится к аминокислоте, содержащей серу, или ее производному, в частности таковым, выбранным из метионина, цистеина, цистина, лантионина, гомоцистеина, гомоцистина, гомолантионина и таурина, но не ограничиваясь ими; любая аминокислота, содержащая серу, и ее производные могут быть включены в объем настоящего изобретения без ограничения.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, принадлежащий роду Corynebacterium sp., роду Escherichia sp.или роду Lactobacillus sp., не ограничиваясь ими. Микроорганизм может включать любой микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-аминокислоты и/или их производные путем усиления активности эндогенного белка SsuABC или введения чужеродного белка SsuABC без ограничения.

"Микроорганизм, принадлежащий роду Corynebacterium" может включать любые микроорганизмы, принадлежащие роду Corynebacterium. В частности, микроорганизм может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens, и более конкретно Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium stationis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium callunae или Corynebacterium deserti, еще более конкретно Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваясь ими.

"Микроорганизм, принадлежащий роду Escherichia'", может включать любые микроорганизмы, принадлежащие роду Escherichia. В частности, микроорганизм может представлять собой Escherichia coli, но не ограничиваясь этим.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой любой микроорганизм, содержащий транспортер тиосульфата по настоящему изобретению и использующий тиосульфат в качестве источника серы.

Способ продуцирования по настоящему изобретению может включать культивирование микроорганизма по настоящему изобретению в культуральной среде, содержащей тиосульфат.

При использовании в настоящем документе термин "культивирование" относится к выращиванию микроорганизма в подобранных подходящим образом условиях. Процесс культивирования по настоящему изобретению может быть проведен в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области техники. Процесс культивирования может быть легко адаптирован для использования специалистом в данной области техники в соответствии с выбранным штаммом. Культивирование микроорганизма может быть выполнено в периодическом процессе, непрерывном процессе, периодическом процессе с подпиткой и так далее, известных в данной области техники, не ограничиваясь ими.

При использовании в настоящем документе термин "культуральная среда" относится к материалу, в котором смешаны питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма, в качестве основных ингредиентов, а также запасы питательных веществ и факторы роста, как и вода, которые необходимы для выживания и роста. В частности, хотя культуральная среда и другие условия культивирования для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению конкретно не ограничены, при условии, что культуральные среды являются такими, которые обычно используют при культивировании микроорганизмов, микроорганизм по настоящему изобретению можно культивировать в обычной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины в аэробных условиях при контролировании температуры, рН и тому подобного.

В настоящем изобретении источники углерода могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза (saccharose), лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахарные спирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; и аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин. Кроме того, можно использовать натуральные органические питательные вещества, такие как гидролизаты крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниоку, жмых сахарного тростника и кукурузный экстракт, и в частности можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерильная предварительно обработанная меласса (то есть, меласса, конвертированная в восстановленные сахара), и подходящие количества любых других источников углерода также можно использовать без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации по меньшей мере двух из них, но не ограничиваясь этим.

Источники азота могут включать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, например, глутаминовую кислоту, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыбу или продукты ее переработки и обезжиренный соевый жмых или продукты его переработки. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации по меньшей мере двух из них, не ограничиваясь этим.

Источники фосфора могут включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие им натрийсодержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Также дополнительно можно включать аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники. Эти компоненты и предшественники можно добавлять в культуральную среду в периодическом или непрерывном процессе, не ограничиваясь ими.

Также во время процесса культивирования микроорганизма в культуральную среду можно добавлять такие соединения как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, ортофосфорная кислота и серная кислота в подходящем способе для подведения рН культуральной среды. Также, во время культивирования можно добавлять пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, для ингибирования образования пены. Дополнительно в культуральную среду можно вводить кислород или кислородсодержащий газ для поддержания культуральной среды в аэробных условиях, или азот, водород либо газообразный диоксид углерода можно вводить в культуральную среду для поддержания культуральной среды в анаэробных и микроаэробных условиях без введения каких-либо других газов, однако настоящее воплощение не ограничено этим.

Температуру культуральной среды можно поддерживать в диапазоне от 25°С до 40°С, более конкретно от 30°С до 37°С, не ограничиваясь этим. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества продукта, например, в течение от 0,5 часов до 60 часов, не ограничиваясь этим.

Термин "источник серы" по настоящему изобретению можно использовать взаимозаменяемо с термином "источник, обеспечивающий серой", и он относится к серосодержащему веществу, доступному для продуцирования серосодержащей аминокислоты.

При культивировании микроорганизма источник серы может представлять собой важный фактор для определения метаболического пути у микроорганизма. Однако факторы, вовлеченные в транспорт различных источников серы, и факторы, вовлеченные в их расщепление, точно не выявлены. Например, хотя известно, что Corynebacterium glutamicum дикого типа использует различные источники серы, известно, что белок SsuABC не вовлечен в транспорт сульфата или сульфита, но вовлечен только в транспорт алифатического сульфоната (D. J. Koch, С. Ruckert, D.A. Rey, A. Mix, A. Puhler, J. Kalinowski. 2005. Role of the ssu and sen Genes of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Utilization of Sulfonates and Sulfonate Esters as Sulfur Sources. AEM. 71.10.6104-6114. 2005). To есть белок, транспортирующий источник серы в клетку, обладает субстратной специфичностью. Дополнительно, после того как источник серы транспортирован в клетку, фермент, расщепляющий источник серы, может варьировать, и метаболический путь, использующий его, также может варьировать в зависимости от структуры и функциональной группы источника серы. Например, известно, что когда в качестве источника серы используют сульфат, CysZ транспортирует сульфат, и CysDN, CysH и CysI вовлечены до тех пор, пока сульфид не продуцирован (Bolten, Christoph J., Hartwig Schroder, Jeroen Dickschat, and Christoph Wittmann. Towards Methionine Overproduction in Corynebacterium glutamicum Methanethiol and Dimethyldisulfide as Reduced Sulfur Sources. J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(8), 1196-1203). Однако в случае, когда в качестве источника серы для продуцирования серосодержащих аминокислот используется тиосульфат, факторы, используемые для транспорта и расщепления тиосульфата, пока достоверно не выявлены.

Источник серы может представлять собой тиосульфат. В частности, в настоящем изобретении источник серы может включать тиосульфат, например, тиосульфат аммония или тиосульфат натрия или смесь тиосульфата и органического или неорганического серосодержащего соединения, такого как сульфит, восстановленного сырья, например H2S, сульфида, производного сульфида, метилмеркаптана, тиогликолята, тиоцианата и тиомочевины. Альтернативно, источник серы может не содержать никого другого вещества, кроме тиосульфата. Однако настоящее воплощение не ограничено этим.

Способ продуцирования серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот может включать выделение серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот из микрорганизма или культуральной среды.

Стадию выделения можно выполнять путем сбора требуемых серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот с помощью подходящего способа, известного в данной области техники в соответствии со способом культивирования по настоящему изобретению, такого как способ периодического культивирования, непрерывного культивирования или периодического культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку агентом осаждения белков (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, различные хроматографические методы, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-проникающая), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), и любую их комбинацию, не ограничиваясь этим.

Стадия выделения может дополнительно включать процесс очистки. Процесс очистки может быть выполнен с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция для продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты, где композиция включает микроорганизм, обладающий повышенной активностью белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с естественной активностью, или его культуру и тиосульфат.

Белок, кодируемый геном ssuABC, микроорганизм, тиосульфат и серосодержащая аминокислота являются такими, как описано выше.

Культура может быть получена путем культивирования микроорганизма по настоящему изобретению в культуральной среде.

Композиция для продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты по настоящему изобретению может дополнительно включать любой компонент, который может способствовать продуцированию серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот, и этот компонент может быть подходящим образом выбран из таковых, известных в данной области техники.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение белка, кодируемого геном ssuABC, в качестве транспортера тиосульфата.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение микроорганизма, содержащего генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом для продуцирования серосодержащих аминокислот или производных серосодержащих аминокислот.

Белок, кодируемый геном ssuABC, микроорганизм, культуры, тиосульфат и серосодержащая аминокислота являются такими, как описано выше. Примеры

Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры и экспериментальные примеры. Однако следующие примеры и экспериментальные примеры представлены исключительно для иллюстрации настоящего описания и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение рекомбинантного вектора для делетирования гена mcbR

Сначала для того, чтобы получить штамм, продуцирующий метионин в качестве репрезентативной серосодержащей аминокислоты, использовали штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 для получения вектора для инактивирования известного гена mcbR, кодирующего белок-регулятор транскрипции метионина и цистеина (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003).

В частности, для того, чтобы делетировать ген mcbR из хромосомы штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, получали рекомбинантный плазмидный вектор в соответствии со следующим способом.

На основании нуклеотидной последовательности, размещенной в GenBank Национального института здравоохранения США (NIH), были получены ген mcbR и фланкирующие последовательности (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum.

ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК 700 п. н., соответственно.

Вектор pDZ (Патент США No. US 9109242 В2), неспособный к репликации в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты гена mcbR обрабатывали ферментом рестрикции Smal для вставки в хромосому с последующим клонированием методом изотермической сборки. Escherichia coli DH5a трансформировали этим вектором и высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, в который с помощью ПЦР был вставлен фрагмент, имеющий делецию целевого гена, отбирали, и затем плазмида была выделена методом экстракции плазмид и обозначена как pDZ-AmcbR.

Пример 2: Получение и культивирование штамма с делецией гена mcbR

Штамм АТСС 13032 трансформировали методом электропорации вектором pDZ-AmcbR, полученным в Примере 1 выше, путем гомологичной хромосомной рекомбинации (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем проводили вторую рекомбинацию в твердой среде, содержащей сахарозу. После завершения второй рекомбинации трансформированный штамм Corynebacterium glutamicum, имеющий делецию гена mcbR, идентифицировали путем проведения ПЦР с использованием SEQ ID NO: 6 и 7, и рекомбинантный штамм получил название СМ02-0618.

Штамм СМ02-0618 был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов в соответствии с Будапештским соглашением 4 января 2019 года с номером доступа KCCM12425P.

Для анализа способности полученного штамма СМ02-0618 продуцировать L-метионин этот штамм и родительский штамм, штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, культивировали следующим образом.

Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 и Corynebacterium glutamicum СМ02-0618 инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. Затем 1 мл этого культурального бульона инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 48 часов при 200 об/мин. Состав посевной среды и продукционной среды был следующим. В продукционной среде (NH₄)₂S₂O₃, представляющий собой один из типов тиосульфата, использовали в качестве источника серы.

Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 8,0)

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCL, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ и 1 мкг цианокобаламина (витамина В12) (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 1 ниже.

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 1 ниже.

В результате было подтверждено, что способность штамма с делецией mcbR продуцировать L-метионин увеличена на 0,04 г/л по сравнению с таковой у контрольного штамма. Также было подтверждено, что метионин продуцировался даже при использовании тиосульфата в качестве единственного источника серы.

Пример 3: Выбор гена, вовлеченного в поступление тиосульфата, путем анализа транскриптов

Тиосульфат-специфические белки штаммов рода Corynebacterium не известны. Однако, как подтверждено в Примере 2, штамм СМ02-0618 продуцировал метионин, когда тиосульфат использовали в качестве единственного источника серы, и поэтому был проведен эксперимент для выбора белка, вовлеченного в поступление тиосульфата.

Более подробно, после культивирования штамма СМ02-0618, полученного в Примере 2, при изменении только источника серы (сульфат аммония и тиосульфат аммония) был выполнен транскриптомный анализ (анализ на уровне РНК). Использовали такой же способ культивирования, как в Примере 2.

На основании результатов этого эксперимента было подтверждено, что уровни РНК генов, кодирующих SsuABC (Ncgl1174-76), который известен как транспортер сульфоната, были значительно повышены.

Таким образом, было подтверждено, что белок SsuABC не взаимодействует с сульфатом, но специфически взаимодействует с тиосульфатом, и, следовательно, можно предположить, что этот белок вовлечен в транспорт тиосульфата.

Пример 4: Подтверждение действия штамма с делецией гена, кодирующего белок SsuABC

Был получен вектор для определения эффекта инактивации белка SsuABC, выбранного в качестве белка, специфически взаимодействующего с тиосульфатом в Примере 3.

Пример 4-1: Получение вектора для делетирования гена, кодирующего белок SsuABC

Для делетирования гена, кодирующего белок SsuABC (здесь и далее обозначен как ген ssuABC), из хромосомы штамма Corynebacterium АТСС 13032 рекомбинантный плазмидный вектор был получен в соответствии со следующим способом.

На основании нуклеотидных последовательностей, размещенных в GenBank Национального института здравоохранения США (NIH), были получены ген ssuABC и фланкирующие последовательности (SEQ ID NO: 8) Corynebacterium glutamicum.

Для делетирования гена ssuABC проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 7 минут.В результате были получены фрагменты ДНК 700 п. н., соответственно.

Вектор pDZ, неспособный реплицироваться в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты гена ssuABC обрабатывали ферментом рестрикции Smal для вставки в хромосому с последующим клонированием методом изотермической сборки. Escherichia coli DH5a трансформировали этим вектором и высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, в который с помощью ПЦР был вставлен фрагмент, имеющий делецию целевого гена, отбирали, и затем плазмида была получена методом экстракции плазмид и обозначена как pDZ-ΔSsuABC.

Пример 4-2: Получение и культивирование штамма с делецией гена ssuABC Штамм 13032/AmcbR трансформировали методом электропорации вектором pDZ-ΔSsuABC, полученным в Примере 4-1 выше, путем гомологичной хромосомной рекомбинации (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем проводили вторую рекомбинацию в твердой среде, содержащей сахарозу. После завершения второй рекомбинации трансформированный штамм Corynebacterium glutamicum, имеющий делецию гена mcbR, идентифицировали путем проведения ПЦР с использованием SEQ ID NO: 13 и 14, и рекомбинантный штамм получил название Corynebacterium glutamicum CM02-0618/ΔSsuABC.

Пример 4-3: Анализ способности штамма с делецией гена ssuABC продуцировать метионин

Для анализа способности продуцировать L-метионин полученного штамма СМ02-0618/ΔSsuABC этот штамм и родительский штамм, штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, культивировали следующим образом.

Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, Corynebacterium glutamicum СМ02-0618, полученный в Примере 2, и СМ02-0618/ΔSsuABC, полученный в Примере 4-2, инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. Затем 1 мл этого культурального бульона инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 48 часов при 200 об/мин. Состав посевной среды и продукционной среды был следующим.

Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 8,0)

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCL, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида и 30 г СаСО₃ (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 3 ниже.

В результате было подтверждено, что способность штамма с делецией гена ssuABC продуцировать L-метионин снижена примерно до 25% по сравнению с таковой у контрольного штамма. На основании этого было подтверждено, что белок SsuABC представляет собой белок, вовлеченный в поступление тиосульфата.

Пример 5: Получение и культивирование штамма с повышенной экспрессией гена ssuABC

Был получен вектор для усиления активности белка SsuABC, выбранного в качестве белка, специфически взаимодействующего с тиосульфатом в Примере 3.

Пример 5-1: Получение вектора для повышения экспрессии гена ssuABC

Для дополнительной вставки гена ssuABC в хромосому Corynebacterium АТСС 13032 был получен плазмидный вектор в соответствии со следующим способом.

Сначала был получен вектор для делетирования Ncgl1464 (Транспозаза), чтобы вставить ген ssuABC.

На основании нуклеотидных последовательностей, размещенных в GenBank Национального института здравоохранения США (NIH), были получены ген Ncgl1464 и фланкирующие последовательности (SEQ ID NO: 15) Corynebacterium glutamicum. Для делетирования гена Ncgl1464 проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 16, 17, 18 и 19. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК, соответственно.

Вектор pDZ, неспособный реплицироваться в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты гена Ncgl1464 обрабатывали ферментом рестрикции Smal для вставки в хромосому с последующим клонированием методом изотермической сборки. Escherichia coli DH5a трансформировали этим вектором и высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, в который с помощью ПЦР был вставлен фрагмент, имеющий делецию целевого гена, отбирали, и затем плазмида была получена методом экстракции плазмид и обозначена pDZ-ΔNcgl1464.

Затем для получения фрагментов гена ssuABC проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и SEQ ID NO: 20 и 21. Дополнительно промотор PgapA использовали для усиления экспрессии гена ssuABC. Для их получения проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID NO: 22 и 23. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 7 минут.В результате были получены фрагменты гена ssuABC и фрагменты промотора gapA.

Вектор pDZ-ΔNcgl1464, неспособный реплицироваться в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали ферментом рестрикции Seal с последующим клонированием методом изотермической сборки вместе с двумя амплифицированными фрагментами ДНК. Escherichia coli DH5a трансформировали этим вектором и высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, в который был вставлен целевой ген с помощью ПЦР, отбирали, и затем плазмида была получена методом экстракции плазмид и обозначена как pDZ-ΔNcgl1464-PgapΔSsuABC.

Пример 5-2: Получение и культивирование штамма с повышенной экспрессией гена ssuABC

Штамм СМ02-0618 трансформировали методом электропорации векторами pDZ-ΔNcgl1464 и pDZ-ΔNcgl1464-PgapΔSsuABC, полученными в Примере 5-1 выше, путем гомологичной хромосомной рекомбинации (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем проводили вторую рекомбинацию в твердой среде, содержащей сахарозу. После завершения второй рекомбинации трансформированный штамм Corynebacterium glutamicum с делецией гена Ncgl1464 и штамм Corynebacterium glutamicum, имеющий как делециею гена Ncgl1464, так и вставку гена ssuABC, идентифицировали путем проведения ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 24 и 25. Штамм с делецией гена Ncgl1464 получил название CM02-0618/ΔNcgl1464, и штамм, имеющий как делецию гена Ncgl1464, так и вставку гена ssuABC, получил название СМ02-073. Штамм СМ02-0735 был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов в соответствии с Будапештским соглашением 21 марта 2021 года с номером доступа КССМ12466Р.

Пример 5-3: Анализ способности штамма с повышенной экспрессией гена ssuABC продуцировать метионин

Для анализа способности полученных штаммов CM02-0618/ΔNcgl1464 и СМ02-0735 продуцировать L-метионин эти штаммы и родительский штамм, штамм СМ02-0618, культивировали следующим образом.

Каждый из штаммов СМ02-0618, CM02-0618/ΔNcgl1464 и СМ02-0735 инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. Затем 1 мл этого культурального бульона инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 48 часов при 200 об/мин. Состав посевной среды и продукционной среды был следующим.

Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 8,0)

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ и 1 мкг цианокобаламина (витамина В12) (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 4 ниже.

В результате было подтверждено, что способность штамма с повышенной экспрессией гена ssuABC продуцировать L-метионин была увеличена на 50% или более по сравнению с таковой контрольного штамма. Также, было подтверждено, что белок SsuABC вовлечен в поступление тиосульфата, как подтверждено в Примере 4.

Пример 6: Сравнительное культивирование с тиосульфатом и другим сульфонатом

Белок SsuABC известен как белок, поставляющий сульфонат (Appl. Environ. Microbial. 71 (10:6104-6114, 2005). Сульфонат, имея структуру R-SO3, где R представляет собой органическую группу, отличается от тиосульфата, который имеет структуру S-SO3.

Поэтому действие тиосульфата на продукцию метионина определяли путем сравнительного эксперимента с использованием сульфоната.

Штаммы Corynebacterium glutamicum СМ02-0618 и СМ02-0735 инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. Затем 1 мл этого культурального бульона инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 48 часов при 200 об/мин. Состав посевной среды и продукционной среды был следующим.

Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 8,0)

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, метансульфонат или этансульфонат (в зависимости от источника серы), 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCL, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ и 1 мкг цианокобаламина (витамина В12) (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 5 ниже.

В результате, в случае когда тиосульфат использовали в качестве источника серы для каждого штамма, продукция метионина увеличивалась на величину вплоть до 700% по сравнению со случаем использования сульфоната в качестве источника серы.

На основании этого было подтверждено, что продукция метионина была самой высокой при использовании тиосульфата в качестве источника серы, и также было подтверждено, что повышение активности белка SsuABC вовлечено в такое увеличение продукции метионина.

Пример 7: Получение Метионин-продуцирующего штамма, обладающего повышенной экспрессией генов metH и CysI без делетирования гена mcbR

Пример 7-1: Получение рекомбинантного вектора для усиления обоих генов, metH и CysI

Для определения того, будет ли увеличена продукция серосодержащей аминокислоты при усилении активности белка SsuABC по настоящему изобретению и использования тиосульфата в качестве источника серы, вышеописанный эксперимент был проведен с другим метионин-продуцирующим штаммом. Сначала был получен вектор для усиления как гена metH (Ncgl1450), кодирующего метионинсинтазу, так и гена cys/(Ncgl2718), кодирующего сульфитредуктазу, у штамма АТСС 13032.

В частности, был получен рекомбинантный плазмидный вектор для дополнительной вставки генов metH и CysI в хромосому Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в соответствии со следующим способом. На основании нуклеотидных последовательностей, размещенных в GenBank Национального института здравоохранения США (NIH), были получены ген metH и фланкирующие последовательности (SEQ ID NO: 26) и ген CysI и фланкирующие последовательности (SEQ ID NO: 27) Corynebacterium glutamicum.

Сначала был получен вектор для делетирования Ncgl1201 (Транспозаза) для вставки эти генов. На основании нуклеотидных последовательностей, размещенных в GenBank Национального института здравоохранения США (NIH), были получены ген Ncgl1021 и фланкирующие последовательности (SEQ ID NO: 28) Corynebacterium glutamicum. Для делетирования гена Ncgl1021 проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 29, 30, 31 и 32. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 7 минут.В результате были получены фрагменты ДНК. Вектор pDZ, неспособный реплицироваться в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты гена Ncgl1021 обрабатывали ферментом рестрикции Xbal для вставки в хромосому с последующим клонированием методом изотермической сборки. Escherichia coli DH5a трансформировали этим вектором и высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, в который с помощью ПЦР был вставлен фрагмент, имеющий делецию целевого гена, отбирали, и затем плазмида была получена методом экстракции плазмид и обозначена pDZ-ΔNcgl1021.

Затем, для получения генов metH и CysI проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 33, 34, 35 и 36. Дополнительно промотор Pcj7 использовали для усиления экспрессии гена metH и промотор Pspll использовали для усиления экспрессии гена CysI. Для их получения проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium ammoniagenes АТСС 6872 в качестве матрицы и с использованием праймеров SEQ ID NO: 37 и 38 для промотора Pcj7 и ПЦР проводили с использованием ДНК известного вектора spll-GFP (US 10584338 В2) в качестве матрицы и с использованием праймеров SEQ ID NO: 39 и 40 для промотора Pspll. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК генов metH и CysI, промотор Pcj7 (US 7662943 В2) и промотор Pspll (US 10584338 В2).

Вектор pDZ-ΔNcgl1021, неспособный реплицироваться в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали ферментом рестрикции Seal и четыре амплифицированных фрагмента ДНК обрабатывали ферментом рестрикции Seal с последующим клонированием методом изотермической сборки. Escherichia coli DH5a трансформировали этим вектором и высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, в который целевой ген был вставлен путем ПЦР, отбирали, и затем плазмида была получена методом экстракции плазмид и обозначена pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-PspllcysI.

Пример 7-2: Разработка L-Метионин-продуцирующего штамма и выявление продукции L-Метионина с использованием этого штамма

Штамм АТСС 13032 трансформировали методом электропорации векторами pDZ-ΔNcgl1021 HpDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-PspllcysI, полученным в Примере 7-1 выше, путем гомологичной хромосомной рекомбинации (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем проводили вторую рекомбинацию в твердой среде, содержащей сахарозу. После завершения второй рекомбинации вставку гена Pcj7-metH-PspllCysI в трансформированном штамме Corynebacterium glutamicum выявляли с использованием SEQ ID NO: и 41 и 42. Рекомбинантные штаммы получили названия Corynebacterium glutamicum 13032/ΔNcgl1021 (штамм, трансформированный pDZ-ΔNcgl1021) и СМ02-0753 (трансформированный pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-PspllcysIn).

Для анализа способности полученных штаммов 13032/ΔNcgl 1021 и СМ02-0753 продуцировать L-метионин эти штаммы и родительский штамм, штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, культивировали следующим образом.

Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 и штаммы по настоящему изобретению, то есть, Corynebacterium glutamicum 13032/ΔNcgl1021 и CM02-0753 инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. Затем 1 мл этого культурального бульона инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 48 часов при 200 об/мин. Состав посевной среды и продукционной среды был следующим. Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 8,0)

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ и 1 мкг цианокобаламина (витамина В12) (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 6 ниже.

В результате было подтверждено, что способность штамма, в котором присутствует ген mcbR, и гены metH и CysI сверхэкспрессируются, продуцировать L-метионин повышена по сравнению с таковой контрольного штамма. На основании этого было подтверждено, что штамм, в котором гены metH и CysI сверхэкспрессируются без делетирования гена mcbR, обладает способностью продуцировать метионин, и этот штамм использовали в следующем эксперименте.

Пример 8: Разработка L-Метионин-продуцирующего штамма, обладающего повышенной активностью SsuABC и содержащего mcbR, и определение способности продуцировать L-Метионин

Штамм с повышенной активностью белка SsuABC получали с использованием метионин-продуцирующего штамма, полученного в Примере 7, и затем определяли его способность продуцировать L-метионин.

Пример 8-1: Получение штамма, обладающего повышенной активностью SsuABC

В частности, штамм СМ02-0753 из Примера 7 трансформировали методом электропорации вектором pDZ-ΔNcgl464-PgapΔSsuABC, полученным в Примере 5, путем гомологичной хромосомной рекомбинации (Van der Rest et at, Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем проводили вторую рекомбинацию в твердой среде, содержащей сахарозу.

После завершения второй рекомбинации вставку гена PgapA-SsuABC в сайт Ncgl1464 трансформированного Corynebacterium glutamicum выявляли с использованием SEQ ID NO: 24 и 25. Полученный рекомбинантный штамм получил название Corynebacterium glutamicum СМ02-0755.

СМ02-0755 был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов в соответствии с Будапештским соглашением 21 марта 2019 года с номером доступа КССМ12467Р.

Пример 8-2: Определение способности полученного штамма продуцировать метионин

Для анализа способности штамма СМ02-0753, полученного в Примере 7, и штамма СМ02-0755, полученного в Примере 8-1, продуцировать L-метионин штаммы культивировали следующим образом.

Штаммы Corynebacterium glutamicum СМ02-0753 и СМ02-0755 инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. Затем 1 мл этого культурального бульона инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 30°С в течение 48 часов при 200 об/мин. Состав посевной среды и продукционной среды был следующим.

Посевная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 8,0)

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCL, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ и 1 мкг цианокобаламина (витамина В12) (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

Штаммы культивировали в соответствии с вышеописанным способом культивирования и анализировали концентрации L-метионина, содержащегося в культуральном бульоне, и они представлены в Таблице 7 ниже.

В результате было подтверждено, что способность продуцировать L-метионин была увеличена путем повышения активности белка SsuABC в присутствии mcbR и при использовании тиосульфата в качестве источника серы.

Эти результаты показывают, что серосодержащие аминокислоты или производные серосодержащих аминокислот можно получать с использованием тиосульфата в качестве источника серы путем повышения активности белка SsuABC, который, как впервые подтверждено в настоящем изобретении, представляет собой белок для поступления тиосульфата.

Вышеописанное описание настоящего изобретения представлено для иллюстративных целей, и специалисту в данной области техники будет понятно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без изменения технической идеи и существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, очевидно, что вышеописанные воплощения являются иллюстративными во всех аспектах и не ограничивают объем настоящего изобретения. Следовательно, объем настоящего изобретения определен не подробным описанием, а прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами, и все варианты в пределах объема прилагаемой формулы изобретения следует рассматривать как включенные в настоящее описание.

--->

Перечень последовательностей

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> METHOD OF PRODUCING SULFUR-CONTAINING AMINO ACID OR DERIVATIVE

THEREOF

<130> OPA20064

<150> KR 10-2019-0077998

<151> 2019-06-28

<160> 45

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 2642

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

ctcccgcgca ctgctgcaat ccgcaccgtg cccaatgatg gtggttcgcc cacctgagaa 60

gattaagaag tagtttcttt taagtttcga tgccccggtt tcctgatttt gtgcagggag 120

gccggggcat tggtgtttgc gggttagttc gggccattcg aaagggagaa accaagggca 180

gccagacaga cgtgccaaga atctggattt ccgccaggtt ttggcacgcc cgtctggttt 240

aggcaatgag ataccgaaca cacgtgccaa aagttcggct ttttcgccga tcttgtcacg 300

cctgcctggt ttgtcttgta aagagtgatt tcatggccga gactcctaaa agtttgacct 360

cacaggattg cttctaaggg cctctccaat ctccactgag gtacttaatc cttccgggga 420

attcgggcgc ttaaatcgag aaattaggcc atcacctttt aataacaata caatgaataa 480

ttggaatagg tcgacacctt tggagcggag ccggttaaaa ttggcagcat tcaccgaaag 540

aaaaggagaa ccacatgctt gccctaggtt ggattacatg gatcattatt ggtggtctag 600

ctggttggat tgcctccaag attaaaggca ctgatgctca gcaaggaatt ttgctgaaca 660

tagtcgtcgg tattatcggt ggtttgttag gcggctggct gcttggaatc ttcggagtgg 720

atgttgccgg tggcggcttg atcttcagct tcatcacatg tctgattggt gctgtcattt 780

tgctgacgat cgtgcagttc ttcactcgga agaagtaatc tgctttaaat ccgtagggcc 840

tgttgatatt tcgatatcaa caggcctttt ggtcattttg gggtggaaaa agcgctagac 900

ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 960

gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtggctgcta gcgcttcagg 1020

caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat cgaccaagcc cccgacagcg 1080

tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt attcgcgtca tcggtattga 1140

tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc tattcccttt tcggatcgaa 1200

ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag ctgtggcgtg aagcgtggcg 1260

tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc atcgcgttct ttgatcagtg 1320

cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac tttcagaatg cggctagtga 1380

gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt gcagcagtgt tagagcaccg 1440

cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag aagaacggct acccaggcac 1500

cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga cttgctggat ctcgattggt 1560

ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct cggcagttgt tgtcggctcc 1620

acctgcggac tactcaattt agtttcttca ttttccgaag gggtatcttc gttgggggag 1680

gcgtcgataa gccccttctt tttagcttta acctcagcgc gacgctgctt taagcgctgc 1740

atggcggcgc ggttcatttc acgttgcgtt tcgcgcctct tgttcgcgat ttctttgcgg 1800

gcctgttttg cttcgttgat ttcggcagta cgggttttgg tgagttccac gtttgttgcg 1860

tgaagcgttg aggcgttcca tggggtgaga atcatcaggg cgcggttttt gcgtcgtgtc 1920

cacaggaaga tgcgcttttc tttttgtttt gcgcggtaga tgtcgcgctg ctctaggtgg 1980

tgcactttga aatcgtcggt aagtgggtat ttgcgttcca aaatgaccat catgatgatt 2040

gtttggagga gcgtccacag gttgttgctg acccaataga gtgcgattgc tgtggggaat 2100

ggtcctgtga ggccaaggga cagtgggaag atcggcgcga ggatcgacat cacgatcatg 2160

aacttcagca tgccgttaga gaatccggat gcgtaatcgt tggtttggaa gctgcggtac 2220

atggacatcg ccatgttgat tgcggtgagg attgcggctg tgatgaacag tggcaaaacg 2280

aaactaagaa cttccgcctg cgtggtgctc aaatatttta gctgctcagt gggcatcgaa 2340

acataagcgg gcagaggcac attgctcacg cgaccagcga ggaaagattc cacttcctca 2400

ggagttagga agccgatcga ctggaagacg ggattttcca aaccaccttc agggcgagcc 2460

atgcggagaa gtgcccagta aagaccaagg acaatcggta tctggatcag cccaggcaca 2520

caacctgcca gcgggttaat gccgtattcc ttattcaaat cattctggcg cttctgcaac 2580

tcccgaatgg acgcttcatc gtactttccc ttgtattctt cccggagcgc agcgcggtga 2640

gg 2642

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 2

tcgagctcgg tacccctgcc tggtttgtct tgta 34

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 3

cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 4

aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 5

ctctagagga tccccgtttc gatgcccact gagca 35

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 6

aatctggatt tccgccaggt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 7

cttcctaact cctgaggaag 20

<210> 8

<211> 4528

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

atgcgtggat tactgacgct tctttgattg aggcgacaaa acgcttgaag ttcctcgttg 60

cgcttcgccc tgggcagatt ggacctacgc tgtctgctca aatggcttct actttccagc 120

gtctgtctgg caaccgtttg ctgatcaatg tggtcaccgg tggggaagat gcggagcagc 180

gtgcgtttgg tgatttcttg aacaaggagg agcgctacgc ccgtaccgga gaattcttgg 240

atatcgtgag ccgcttgtgg cgaggcgaaa ccgtcacgca ccacggtgaa cacctgcagg 300

tggagcaagc tagccttgcg catccgccag agattattcc ggagattctt tttggtggat 360

cgtcgccagc tgcaggtgag gtggctgcac gttatgcgga cacctatctc acgtggggtg 420

aaactcccga tcaggtggcg cagaaaatca actggatcaa cgagctagca gcacagcgcg 480

gccgggaact gcgccatgga atccgcttcc atgtgatcac ccgcgatacg tctgaagaag 540

catgggtggt ggcagagaag ttgattagcg gggtcactcc agaacaggtc gctaaggctc 600

aagccgggtt tgcaacgtct aagtcggagg ggcagcgccg gatggctgag ctgcacagca 660

agggtcgtgc ctttactagt ggctcaactg ctcgtgatct ggaggtgtat cccaatgtgt 720

gggcaggcgt cggtttgctt cgcggaggtg caggaacagc ccttgtgggc tcgcatgaag 780

aggtcgccga tcgcatcgaa gaatacgcag cactcggctt ggatcagttt gtactgtcgg 840

gttatccaaa cttggaggag gccttccact tcggtgaggg tgtgattccg gagctgctgc 900

gccgcggtgt ggatatcaaa aatcaagaat cacgagtttt ggaacctgtt gggtaaacgg 960

gaagaacgag acgtcgataa gcaaatttct taaggaacct gacatgacta caaccttgac 1020

tcgccccaaa atcgcgctgc ccgcgcgcat ctattcaccg cttgcggtgc ttgttttctg 1080

gcagctcggc tcgagcctgg gcgccatccc ggagcggatt ctgccggcac caaccacgat 1140

cttggccgcc agctgggagg tcgccacaaa tggcacgctt ctcgacgccc tcctcgtctc 1200

aagccaacgc gtccttctag gcttcgccct cggtgctgtc ctaggcattt ccctaggtgt 1260

attgacaggc atgtccagat ttgcagacac cgccgttgat ccgctcattc aagctgcccg 1320

cgcgctgcct cacctgggtc ttgtgccgct gtttatcatc tggttcggta tcggtgagct 1380

gccgaaagta ctgattatta gcctcggcgt gctgtatccg ctgtacctca acaccgccag 1440

cgggttcagg caaattgatc caaagcttct ggaagccggc cacgtgatgg gcttcggatt 1500

tttccagagg ttgcggacca tcatcattcc ttctgccgcg ccgcaacttt ttgtcggcct 1560

gcgccaagca agtgcggccg cctggctctc actgatcgtg gcggaacagg tcaacgcccg 1620

cgaaggactc ggcttcctca tcaacaatgc gcgcgatttt taccgcaccg acctcgttat 1680

tttcggcctc attgtctacg ccagcctcgg tctgctgtct gaagcgctga tcagagcttg 1740

ggaacgtcac accttccgct accgaaacgc ataagaaagt tgctcgccat gactgccaca 1800

ttgtcactca aacccgcagc cactgtccgt ggattgcgca aatcatacgg aactaaagaa 1860

gtcctccaag gaatcgacct caccatcaac tgcggcgaag taaccgcgct gatcggacgc 1920

tcaggttcag gaaaatccac catcctgcgc gtgttggcgg gcctatctaa agagcattcc 1980

ggctctgtag aaatttccgg aaacccggcc gttgccttcc aagagcctcg cctgttgccg 2040

tggaaaacgg tgctcgataa tgtgaccttt ggcctcaacc gcactgatat ttcctggtca 2100

gaagcacaag aacgcgcctc ggcactgctt gcagaagtca aacttcccga ctccgacgcc 2160

gcctggcccc tcacgctctc cggcggccaa gcccagcgcg tctcccttgc gcgagcgctc 2220

atctccgagc cagagctttt gcttctcgac gaacccttcg gcgccctcga tgctctgaca 2280

agactgacag cccaagacct gctgctcaaa accgtgaaca cccgaaactt gggagttctg 2340

ctggtcaccc atgatgtttc cgaggccatc gccctggccg accacgtcct tcttcttgac 2400

gacggcgcca tcacacacag tttgactgta gatatccccg gcgatcgccg cacccacccc 2460

tcctttgcct cctacaccgc tcaactcctt gagtggctcg aaatcaccac acctgcctag 2520

aaagaaatca tgaaatttaa gaaaatcgcc ctcgttctcg ccttcggtct aggccttgca 2580

tcctgctcat cagcttctgg cgatcccgcc accaacgccg atggatccat cgatctgagc 2640

aaagtaaccc ttaacatcgg tgatcaaatc gccggaacag aacaagtgct ccaagcttca 2700

ggggagctag atgatgtccc ttataaaatc gaatggtcat catttacctc tggaccaccc 2760

caaatcgaag cattaaacgc aggtcaaatt gatttcgcga tcaccggaaa caccccaccg 2820

atcatcggcg gccccaccaa caccaaagtg gtctccgcct acaacaacga tgctttaggt 2880

gatgtcatct tggtcgcccc ggattcttca ataacctcgg tggctgacct tgctggaaag 2940

aaagtggctg tcgcccgcgg atccagcgcc cacggacacc tcatccaaca actagaaaaa 3000

gcaggcgtga gcgttgacga cgtagaaatc aacctcctcc aaccctccga cgccaaagcc 3060

gctttccaaa acggccaggt agatgcgtgg gcagtgtggg atccctacag ctcacaggcg 3120

gaactggaag gagctcaagt tttggtcagg ggagcgggac tggtcagtgg gcatggattt 3180

ggtgtcgcaa gtgatgaagc gctcgatgac cccgcaaagg aagccgcctt ggcagatttc 3240

ctcgatcgcg tggccgactc ttatgaatgg gctgaagaca acaccgatga atgggcgacg 3300

attttcagcc aagaatccgg ctttgatccg gaggcctctc aactgaacac ccgcagcctg 3360

cgccatcagg tgccgctcga cgagtccgtc aacacctatc agaacgcgct tatcgacgct 3420

ttcgtctccg cgggtctcgt tgaggacttt aatttcgagg acaccgtaga cacccgattt 3480

gagggctaag tatgtctgag tatggcaaag gggcgttgag gtgctcagac ggccatacaa 3540

agcatcgtag tttgtgcata tgagggctgc tttttgccgc tgtgagttgg ctgttcagga 3600

atccgtcctc gggttgggga gaggggctga aaccgaacga atattcgcat aaatctttcg 3660

aattggcgcg aatattcgat cccgctggcc tccgaactag ccattttggt agaaaatttg 3720

catccttgag ccggtattgg cccaaggatg cattttcctg tgtcctactt ctgcagtgag 3780

tagaactgag cactcatcgc tgggacatgc agtgagagtg agtaggcgaa attatcgcgt 3840

ggtgtcgctg ctgcttgaac ggaagtagcg atatcgtttt ctgcaccgag gaattcagca 3900

tcatcagtgt tgagaacgag cttccattcg ccacccgctg caacaccgag ctggtactca 3960

ggctgggagg ttccagacag gttgaataca cacagcatct gggagccgtc gctgccgaaa 4020

cgagtgaacg ccaaaatgtt gttggtggcg tcgtcgccct tattccatgt gaagccttct 4080

ccggtgaaat cctgagtgtg cagcgcaggg gagtctgagt agacaccgtt gagggagcgg 4140

gtcagagtgc ggatggcttc gtggtactcg ccttgccagc cgtcgacaat atcccatggc 4200

agtccctggc cttcagccca ctcttcacgc tgaccaaact cctgacccat gaaaagcagc 4260

ttcttgcctg ggtgtgacca catgtacgca aggaaggtgc gaagaccagc ggccttgttc 4320

cacgtatcgc caggcatacg gtcccacagg gaacccttgc cgtggacgac ttcatcgtga 4380

gagatcggaa gtacaaaacg ctcagagaat gcgtacacca aggagaaagt gagctcactg 4440

tggtggaatg cgcggtgcac agggtttttg gagaagtact ctaaggtgtc gtgcatccag 4500

cccatgttcc acttgaggga gaatccca 4528

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 9

tcgagctcgg tacccagcaa gctagccttg cgcat 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 10

cagacataca gtactgtcag gttccttaag aaatt 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 11

gaacctgaca gtactgtatg tctgagtatg gcaaa 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 12

ctctagagga tccccttgtc gacggctggc aaggc 35

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 13

ccaggtgttt ggggtgcagg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 14

agtttggtca gcgtgaagag 20

<210> 15

<211> 3161

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 15

agacgattct ggaaggccac tttcttttga tcctggcggc gatttttcgg tgcttggtag 60

cggaatgtca atcgagacca agcgtccccc ggcgggtcga ttttttggtc tcgaatgaca 120

gtttcgctct ctggaaactc tcagtgtcag gtcagtggtg aaccaccatc cttagcaagg 180

agttcatcat gtccatcccc ttctcagtcc ttcaggacta cctggatctg atcagtcccg 240

aagccttacc ccagatccca cagcccccgg cccctgcccc cacagcaccc cagctaccac 300

cggcgccgga cccacacagc atcgagtggc cgatcttccc accagatcga atctccgcca 360

acgggcgacg ctactacgag ccacaaacac gactcgagtt catgcggatc tacaccaccc 420

tgccgcacgg ctaccgccag cccttcctta aagccaacaa catcggccac tgcaccgttc 480

gaacctggct agcagcaata agcaccttca gccgacttcc ccatgctttt gatgatgccc 540

accgcttcgg gatcgaacgc accaccccag tcgacgatgt caccacacta acggctgatg 600

acaaacgtga cctggtcata ggatacttag ctcaaccaca cggtcagggc cagcaattcc 660

tcacgtttta ccaactccgt aagcacacca tcatggcctg gtgcgccgct atgaccgacg 720

gggacttaga cgctgatatc tcaccccgcc agatcgggtt gatgaccacc cgaaccgtgg 780

tcgaaatcgt tcgactacgc cacatgattg cccaacaact agaaagagcc acgatcatgg 840

aaaacgagta cctcaaagaa atcgcagcgc tgaagaaaga actcgcgcac tacaagcaaa 900

aagaccatca gaatcaaatg gtgatcgata tcttgggaaa agctattggg accaggccca 960

atcctggcga gggcttagac gaggaggacg ccacctaaac gtggatgagc aacgcgcctt 1020

tgatcaagga ctcaaggaag aaaacacctt gatcacagat ctcaccacct gtgccaggct 1080

gagccataac aaggcattac ggctgatcaa gctgtcgaaa tcaacggcgt attaccgcaa 1140

caagccgcgt ccccgtcctg caccgaaacc tgtcctgcag gccgtgccag caccaacagc 1200

acctggtgtg gaacccacac cagagccttg gcaggggaag gagccagcag tgtcgtcggt 1260

gcgtcaagcg ttggcagaac acgaacgcca gttcattgtt gatgcgatca ccgcgtaccc 1320

acaactgagc gttagtgggg tgtttaacat gttgtttaac aaaggcatct accgcgcatc 1380

actacgtaca tggtggcgtg ttgccaagca gcacaagttg ttacacaaag accgagtcag 1440

tgccctgtcc ccggggaaac gatcaccaac gccacgggtt aagccgaggt tggaagcaac 1500

acagcctggt caggtggtgt gttgggatgt gacgttcttg ccgtcgctgg tacgtggtaa 1560

gacctatgcg ttgcatctgg cgattgattt gttttcccgc aagattgttg gggcgaaggt 1620

cgcgccgacg gaaaatacct ccaccgcggt ggagttgtta acgcaggtgt tagcggataa 1680

tccgggtgtg gtgacggtgc attcggataa tgggtcggcg atgacatcga cgagggtgcg 1740

gcggttgtta gcggatcatg gtgtggcgtt gtcgttgatt cggccgcggg tgagtgatga 1800

taatgcgttt gtggagtcgg tgtttcatac gttgaagtat cggccgtttt atccgaaggt 1860

gtttgcatcg atggatcagg cccgggtgtg ggtggaggag tttgtggtgt attacaacac 1920

ggttcatccg cattctggtg tggctgggca tactccgcag tcggtgtttg atggtagttg 1980

gagggcggct cataggttgc gtgtgcaggc gttggatgcc cattaccggc agttcccgca 2040

gcggtatgtg gggcggccgg tggttcagga agttgctggt gtggtgcgtc ttaatggtgc 2100

gcgtgatgat gggtctgtac aggagagggt tggtggtgta gcgtcgctgt taagtgcttg 2160

agttagcatg tgttcttatc gcccccctgg ttcacaaacc cctggcagcg agcggaaaag 2220

tgcattttta ggccaagggc cctcggatct tcgagcgctt tggtctcttt tgcacgtctg 2280

accgaaccag atcacctaga aacgccaaag gccccgcaag tatcaaacct gcggggcctt 2340

tgaggtacct gtttcctatt ttgttgactt aggaagctgc gcacggcgga taaccaaacc 2400

gcacagcaag gcagccactc cccacgcggt gagccagaac tgctccacga cataaacctg 2460

aatagttgga agcaaacgac ttacgatcac cagggctaca gcgatgctca aagaaatgat 2520

ctgtgtcttt gagcttggct cgtacttgct ggtggtagcg aatgcgccga gaatgatcga 2580

ggcaacgagg atcagaagga atcctggagt gatcacaaat gggctcagca tgccggcggt 2640

aaacagctca attgctgcaa acaccaacaa aaccagacct aaggctacga aagctccacc 2700

gatgcggatt gctgccggaa ctttacgcca gctggcacgg ccttcgaggc tggtgagctt 2760

ttttaatgat cttcccgatg ctgaactcat aatgtgacat accctactag ttctcgtacc 2820

atccccacac aattgacctg ccaagagtgt ggaaatacag gttgaagcct agaacagtgg 2880

gggtagcgtc gggggcgatg tcgagttttt ccacatcaag tgcatgaact gcgaagaggt 2940

aacggtgcgg tgcgtggcca gctggaggtt gcgctccgta gaagccacgc ttgccggaat 3000

cacccttgag ggaaactacg ccttcgatgc cgccgagggt ttcatcgcca gcaccggtgg 3060

ggatctccgt gacagttgtg gggatgttaa acactgccca gtgccagaaa ccagcgccgg 3120

ttggggcatc tgggtcgagg caggtgatcg cgagggattt g 3161

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 16

tcgagctcgg tacccttttt tggtctcgaa tgaca 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 17

catgctaaca gtactgttta ggtggcgtcc tcctc 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 18

cacctaaaca gtactgttag catgtgttct tatcg 35

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 19

ctcagaggat cccccccacc ggtgctggcg atga 34

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 20

cgccacctaa acagtgaagc ctaaaaacga ccgag 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 21

caaggttgta gtcatgttgt gtctcctcta aagat 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 22

tagaggagac acaacatgac tacaaccttg actcg 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 23

acacatgcta acagtcatgt cccagcgatg agtgc 35

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 24

ctggcggcga tttttcggtg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 25

cgcgatcacc tgcctcgacc 20

<210> 26

<211> 5666

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

tgtcatgctt ccggaggtgc gcagggctcg agactccgga aagctatttg ccactccgat 60

gtttgggtca ctcgacgaga tacgtgctga tcacctaatt tggtgcacag ggtttcggcc 120

ggcgattagg ccagttcgtc aacttctcaa acacggacaa ccaaaggttc ctggtcttta 180

tttagtaggc tacggagatt ggacgggacc tgggtctgcg actatcacag gggtcgggct 240

ttatgccaag cgagcagcca aagagattgc cgcgtcagtc ggcaaagtcg ttaaatagtt 300

tgaaggctaa gaacttaatg ttaaagcgaa aattgttttg acacctcaac taatgcagcg 360

atgcgttctt tccagaatgc tttcatgaca gggatgctgt cttgatcagg caggcgtctg 420

tgctggatgc cgaagctgga tttattgtcg cctttggagg tgaagttgac gctcactcga 480

gaatcatcgg ccaaccattt ggcattgaat gttctaggtt cggaggcgga ggttttctca 540

attagtgcgg gatcgagcca ctgcgcccgc aggtcatcgt ctccgaagag cttccacact 600

ttttcgaccg gcaggttaag ggttttggag gcattggccg cgaacccatc gctggtcatc 660

ccgggtttgc gcatgccacg ttcgtattca taaccaatcg cgatgccttg agcccaccag 720

ccactgacat caaagttgtc cacgatgtgc tttgcgatgt gggtgtgagt ccaagaggtg 780

gcttttacgt cgtcaagcaa ttttagccac tcttcccacg gctttccggt gccgttgagg 840

atagcttcag gggacatgcc tggtgttgag ccttgcggag tggagtcagt catgcgaccg 900

agactagtgg cgctttgcct gtgttgctta ggcggcgttg aaaatgaact acgaatgaaa 960

agttcgggaa ttgtctaatc cgtactaagc tgtctacaca atgtctactt cagttacttc 1020

accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat gcgttggcaa accatgtgtt 1080

gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt gacctggacg tggaaaagga 1140

tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac acccgccctg atgtgttgag 1200

gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg gttgagacca atacttttgg 1260

ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat cgttgccgtg agcttgccta 1320

caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg gggccgggcc gaaacggcat 1380

gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag cttccatcgc tgggccatgc 1440

accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg cttggcatca tcgacggtgg 1500

tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt caggtcaagg ctgcggttca 1560

cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg cccattattt gccacgtcac 1620

cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc ggtgccgcgt tgacagcgct 1680

gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc accggcccag atgagatgag 1740

cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct gtgtcggtga tgcctaacgc 1800

aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca cttgaggctg aggatttggc 1860

gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc atggtgggtg gttgttgtgg 1920

caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg gttggtgttc cagagcagga 1980

aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag caggcctccc gcgaggtgga 2040

gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca ttgtcccagg aaaccggcat 2100

ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag gcattccgtg aggcaatgct 2160

gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag caaacccgcg atggtgcaca 2220

catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc accgccgata tggcgacctt 2280

ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg attgactcca ccgagccaga 2340

ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc atcgttaact ccgtcaactt 2400

tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc atgaaactgg taaagcagca 2460

cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc caggcacgta ccgctgagca 2520

caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc ggcagctacg gcctggatat 2580

caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct actggccagg aagaaaccag 2640

gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg aagaagctct acccagaaat 2700

ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg aaccctgctg cacgccaggt 2760

tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt ctggactctg cgattgcgca 2820

cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc cagcgcgaag tggcgttgga 2880

tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg caggaattca tgcagctgtt 2940

tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct gaacagctgg ccgctatgcc 3000

tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat aagaatggcc ttgaggatga 3060

tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc atcaacgagg accttctcaa 3120

cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag atgcagctgc cattcgtgct 3180

gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg gaaccgttca tggaagagga 3240

agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc aaaatcgtcg tggccaccgt 3300

caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac atcattttgt ccaacaacgg 3360

ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc gccatgttgg aagcagcgga 3420

agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt gtgaagtcca ccgtggtgat 3480

gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc aattacccag tcattttggg 3540

tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc aacgaggtgt acaccggtga 3600

ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg atggatgagg tgatggcaga 3660

aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct attgagcagg cgaagaagaa 3720

ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt gccgcggagc gtaaagctaa 3780

tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc accgatactc caaccgcggc 3840

accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc ttggcggagt tcttgggcaa 3900

ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg aaatccaccc gcggcaacga 3960

gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga ccacgcctgc gctactggct 4020

ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc ttggtgtatg gctacttccc 4080

agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc ccggatccac acgcagccga 4140

acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg ttcttgtgca tcgcggattt 4200

cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg gacgtcatgc cattccagct 4260

ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag ttgttcgcag ccaatgaata 4320

ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc accgaagcat tggccgagta 4380

ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac ggtggatctg tcgctgattt 4440

tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac cgcggcgccc gcttctcctt 4500

tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag ctggtggaat tgctcgagcc 4560

aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg cacccagagc agtccacaga 4620

cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac gtctaacacc tttgagaggg 4680

aaaactttcc cgcacattgc agatcgtgcc actttaacta aggttgacgg catgattaag 4740

gcgattttct gggacatgga cggcacgatg gtggactctg agccacagtg gggcattgct 4800

acctacgagc tcagcgaagc catgggccgc cgcctcaccc cggagctccg ggaactcacc 4860

gtcggctcga gcctgccgcg caccatgcgc ttatgcgcag agcacgcagg cattacattg 4920

agcgacgcgg actacgagcg ctaccgggct ggcatgttcg cccgggtcca tgagcttttc 4980

gacgaatccc tcgtcccaaa tccaggcgtc accgaactcc tgacagagtt gaaggccctc 5040

gagatcccca tgttggtcac caccaacaca gagcgcgatc tcgcgacccg ttcagtcgca 5100

gccgtgggaa atgagttctt catcggttct atcgctggtg atgaagtccc aacagcaaag 5160

ccagcccccg acatgtacct cgaagcagca cgacgtgtgg gctttgaccc atcagagtgc 5220

ctcgtgttcg aagattccta caacggcatg ctgggcgctg ttactgcagg ttgccgcgtc 5280

attggtctgc acccagaaga agtccaagcg ccagaaggtg tagtgccttt gcgttccctc 5340

cacggtaaaa actctttcga aggtgtcacc gctgagatgg tcactgcctg gtaccaccag 5400

atcgagccgg caggtgtcgc aaaataaaac caggtggggg agtgaaatta ttcgactaat 5460

atcctccccc aaacacacat tgataactgt tgtgtggaag aatgtaccga gtgaagacat 5520

ttgactcgct gtacgaagaa cttcttaacc gtgctcagac ccgccctgaa gggtctggaa 5580

ccgtggccgc cttggataaa ggcatccatc atctaggtaa gaaggtcatc gaagaagccg 5640

gagaggtctg gattgcagcc gagtat 5666

<210> 27

<211> 3613

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 27

tcctgtgggg tgaacttgac ctgtgctggg ccacgacgtc cgaaaacgtg cacttcagtg 60

gccttgtttt ctttgaggga gtcgtagacg ttgtcggaaa tttcggtgac tttgagctcg 120

tcgcctgtct tagccaggat gcgggctacg tcgaggccga cgttaccaac gccgataaca 180

gcgacggact gtgcagacag atcccaggag cgctcgaagc gtgggttgcc gtcgtagaag 240

ccaacgaact cgccggcacc gaaggagcct tctgcttcaa ttccggggat gttgaggtcg 300

cggtctgcaa ctgcgccggt ggagaacacg actgcatcgt agtagtcgcg gagttcttcg 360

acggtgatgt ctttgccgat ttcaatgtta ccgagcaggc gcaggcgtgg cttgtccaac 420

acgttgtgca gggacttaac gatgcccttg atgcgtgggt ggtctggagc aacgccgtaa 480

cggatgagtc cgaacggtgc aggcatttgc tcgaaaaggt caacgaacac ttcgcgctct 540

tcattgcgga tgaggaggtc ggatgcgtaa atgccagcag ggccagctcc gatgacggct 600

acgcgcaggg gagttgtcat gtgtttgaag ttgcctttcg tgagcccttt tatggaaaca 660

agggtgtgaa aatcaagtag ttaaaggtgt ttcaagtcca ggctgtttaa cactcctaga 720

ccgcttggtc tgtaaacgta gcagcgaaat gcgacaatgc gaagactttt gcttaattaa 780

attcaaactc catgaaaaaa ctagacagat cggtctatta tattcacggt gaacctaacc 840

taatatcccc aggttaattc atttaaacgg gcattaggtg actccattgc tttcagtctc 900

atgaatctaa tggttggtct agacagagcg gtacgtctaa gtttgcggat agatcaaacc 960

gagtgacatg tacttcacta gctctttaag gattaactcc ccatgacaac aaccaccgga 1020

agtgcccggc cagcacgtgc cgccaggaag cctaagcccg aaggccaatg gaaaatcgac 1080

ggcaccgagc cgcttaacca tgccgaggaa attaagcaag aagaacccgc ttttgctgtc 1140

aagcagcggg tcattgatat ttactccaag cagggttttt cttccattgc accggatgac 1200

attgccccac gctttaagtg gttgggcatt tacacccagc gtaagcagga tctgggcggt 1260

gaactgaccg gtcagcttcc tgatgatgag ctgcaggatg agtacttcat gatgcgtgtg 1320

cgttttgatg gcggactggc ttcccctgag cgcctgcgtg ccgtgggtga aatttctagg 1380

gattatgctc gttccaccgc ggacttcacc gaccgccaga acattcagct gcactggatt 1440

cgtattgaag atgtgcctgc gatctgggag aagctagaaa ccgtcggact gtccaccatg 1500

cttggttgcg gtgacgttcc acgtgttatc ttgggctccc cagtttctgg cgtagctgct 1560

gaagagctga tcgatgccac cccggctatc gatgcgattc gtgagcgcta cctagacaag 1620

gaagagttcc acaaccttcc tcgtaagttt aagactgcta tcactggcaa ccagcgccag 1680

gatgttaccc acgaaatcca ggacgtttcc ttcgttcctt cgattcaccc agaattcggc 1740

ccaggatttg agtgctttgt gggcggtggc ctgtccacca acccaatgct tgctcagcca 1800

cttggttctt ggattccact tgatgaggtt ccagaagtgt gggctggcgt cgccggaatt 1860

ttccgcgact acggcttccg acgcctgcgt aaccgtgctc gcctcaagtt cttggtggca 1920

cagtggggta ttgagaagtt ccgtgaagtt cttgagaccg aatacctcga gcgcaagctg 1980

atcgatggcc cagttgttac caccaaccct ggctaccgtg accacattgg cattcaccca 2040

caaaaggacg gcaagttcta cctcggtgtg aagccaaccg ttggacacac caccggtgag 2100

cagctcattg ccattgctga tgttgcagaa aagcacggca tcaccaggat tcgtaccacg 2160

gcggaaaagg aactgctctt cctcgatatt gagagaaaga accttactac cgttgcacgc 2220

gacctggatg aaatcggact gtactcttca ccttccgagt tccgccgcgg catcatttcc 2280

tgcaccggct tggagttctg caagcttgcg cacgcaacca ccaagtcacg agcaattgag 2340

cttgtcgacg aactggaaga gcgcctcggc gatttggatg ttcccatcaa gattgcactg 2400

aacggttgcc ctaactcttg tgcacgcacc caggtttccg acatcggatt caagggacag 2460

accgtcactg atgctgacgg caaccgcgtt gaaggtttcc aggttcacct gggcggttcc 2520

atgaacttgg atccaaactt cggacgcaag ctcaagggcc acaaggttat tgccgatgaa 2580

gtgggagagt acgtcactcg cgttgttacc cacttcaagg aacagcgcca cgaggacgag 2640

cacttccgcg attgggtcca gcgggccgct gaggaagatt tggtgtgagt cttcggagga 2700

aacccaatcc caaccgcaac caccctctgt actgcccata ctgcgcggga gaagttcttt 2760

tccccgatga gcaaacagaa ttcgcgtggt tgtgtgcgga ttgcaccaga gtttttgaag 2820

tgaaatatca cggccaggac gatccagtgc acaggccagc accagcaaag tccacatcgc 2880

aagcattaaa agaatctctc gaaagacaca aaagaggtga gtcgcaacaa tgagctttca 2940

actagttaac gccctgaaaa atactggttc ggtaaaagat cccgagatct cacccgaagg 3000

acctcgcacg accacaccgt tgtcaccaga ggtagcaaaa cataacgagg aactcgtcga 3060

aaagcatgct gctgcgttgt atgacgccag cgcgcaagag atcctggaat ggacagccga 3120

gcacgcgccg ggcgctattg cagtgacctt gagcatggaa aacaccgtgc tggcggagct 3180

ggctgcgcgg cacctgccgg aagctgattt cctctttttg gacaccggtt accacttcaa 3240

ggagaccctt gaagttgccc gtcaggtaga tgagcgctat tcccagaagc ttgtcaccgc 3300

gctgccgatc ctcaagcgca cggagcagga ttccatttat ggtctcaacc tgtaccgcag 3360

caacccagcg gcgtgctgcc gaatgcgcaa agttgaaccg ctggcggcgt cgttaagccc 3420

atacgctggc tggatcaccg gcctgcgccg cgctgatggc ccaacccgtg ctcaagcccc 3480

tgcgctgagc ttggatgcca ccggcaggct caagatttct ccaattatca cctggtcatt 3540

ggaggaaacc aacgagttca ttgcggacaa caacctcatc gatcacccac ttacccatca 3600

gggttatcca tca 3613

<210> 28

<211> 3311

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 28

ctcattccag cgtcacgacg ttccgaaggt actggttacc tggcattggg cactaccgtt 60

tctgcagcac ttggaccagc cctagcactt tttgtcctag gaacatttga ttacgacatg 120

ctgtttatcg tggtcttggc aacctcggtc atctctttga tcgccgtcgt gttcatgtac 180

tttaagacca gcgaccctga gccttctggg gaaccagcca agttcagctt caaatctatt 240

atgaacccaa agatcatccc catcggcatc tttatcttgc ttatttgctt tgcttactct 300

ggcgtcattg cctacatcaa cgcatttgct gaagaacgcg atctgattac gggtgctgga 360

ttgttcttca ttgcctacgc agtatcaatg tttgtgatgc gcagcttcct tggcaaactg 420

caggaccgtc gcggagacaa cgtcgttatt tactttggat tgttcttctt cgttatttcc 480

ttgacgattt tgtcctttgc cacttccaac tggcacgttg tgttgtccgg agtcattgca 540

ggtctgggat acggcacttt gatgccagca gtgcagtcca tcgctgttgg tgtagtagac 600

aaaaccgaat tcggtacggc cttctccact ttgttcctgt ttgtggactt aggttttggc 660

tttggaccta ttatcctggg agcagtttct gcggcaattg gtttcggacc tatgtatgca 720

gcactggcag gtgtgggtgt gattgccgga atcttctacc tgttcacaca cgctcgcacc 780

gatcgagcta agaatggctt tgttaaacac ccagagcctg tcgctttagt tagctagttc 840

tttcagcttt ccctcccgat cagcgtaaac cggcccttcc ggttttgggg tacatcacag 900

aacctgggct agcggtgtag acccgaaaat aaacgagcct tttgtcaggg ttaaggttta 960

ggtatctaag ctaaccaaac accaacaaaa ggctctaccc atgaagtcta ccggcaacat 1020

catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc accatcaccg gcgcttccga 1080

tgcaggtgat tacaccctga tcgaagcaga cgcactcgac tacacctcca cctgcccaga 1140

atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg atgctcattg atttacccat 1200

cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc taccgctgca ccaaccccac 1260

atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct gaccacggta aaaaggtcac 1320

ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt gaccggatga gtgttcacgc 1380

aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc caactagccc tcgatatgtg 1440

ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga gtgtatgtca ttggggtgga 1500

tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat gggtttgtca ccgtgattgt 1560

cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc cggttattag atgtcgtccc 1620

aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc cgcggtgaac agttccgcaa 1680

tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac gccacagcaa gtaaagaact 1740

cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt gtgcggcttg ctggtgacaa 1800

gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac cagcgtcgtg gtttaagcca 1860

ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg cacaagtggt tgagtcctcg 1920

tcagcaagaa agcttggagc agttgtgggc gtatgacaaa gactacgggg cgttaaagct 1980

tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag atgggtaata agcgtgaagc 2040

gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg ttgaaggggc cgaataagga 2100

actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt gatgtgttgg cgtatttcga 2160

tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga cggttggagc atttgcgtgg 2220

gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg cggtgcctta tccattcagg 2280

gcagttggtc cataagatca atgcactcta aaacaggaag agcccgtaaa cctctgacta 2340

gcgtcaccct ctgattaagg cgaccgcgga tttaagagca gaggctgcca cgagcgcatc 2400

ttcacggctg tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460

aagccccaac gccagcaaca catgggatac ctctccggaa ccacaggcag aaccagggga 2520

gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580

gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640

gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700

ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760

tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820

aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880

aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940

caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000

tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060

gggggatagg taggtgatct cgaaatcatg aaacctttca agataagcag cagtttctag 3120

gacactgtca tgctcgatcg gggtggtgat gaggtgccgg ccacgaggat tagctaagca 3180

cgctcctttg atagcgaggt tgttggcttc tgatccaccc gacgtaaacg tcacctgtgt 3240

ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300

gagtcttccc a 3311

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 29

acccggggat cctctagaat gtttgtgatg cgcag 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 30

gtcagagagt acttacgctg atcgggaggg aaagc 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 31

atcagcgtaa gtactctctg actagcgtca ccctc 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 32

ctgcaggtcg actctagaaa agggattgga gtgtt 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 33

caacgaaagg aaacaatgtc tacttcagtt acttc 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 34

tagtcagaga gtgatttaga cgttaaagta ctttg 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 35

atcaaaacag atatcatgac aacaaccacc ggaag 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 36

cgctagtcag agagttcaca ccaaatcttc ctcag 35

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 37

ccgatcagcg taagtagaaa catcccagcg ctact 35

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 38

aactgaagta gacattgttt cctttcgttg ggtac 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 39

tactttaacg tctaaggtac cggcgcttca tgtca 35

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 40

ggtggttgtt gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 41

atccccatcg gcatctttat 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 42

cgatcacact gggctgatct 20

<210> 43

<211> 319

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 43

Met Lys Phe Lys Lys Ile Ala Leu Val Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Ser Cys Ser Ser Ala Ser Gly Asp Pro Ala Thr Asn Ala Asp Gly

20 25 30

Ser Ile Asp Leu Ser Lys Val Thr Leu Asn Ile Gly Asp Gln Ile Ala

35 40 45

Gly Thr Glu Gln Val Leu Gln Ala Ser Gly Glu Leu Asp Asp Val Pro

50 55 60

Tyr Lys Ile Glu Trp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Pro Pro Gln Ile Glu

65 70 75 80

Ala Leu Asn Ala Gly Gln Ile Asp Phe Ala Ile Thr Gly Asn Thr Pro

85 90 95

Pro Ile Ile Gly Gly Pro Thr Asn Thr Lys Val Val Ser Ala Tyr Asn

100 105 110

Asn Asp Ala Leu Gly Asp Val Ile Leu Val Ala Pro Asp Ser Ser Ile

115 120 125

Thr Ser Val Ala Asp Leu Ala Gly Lys Lys Val Ala Val Ala Arg Gly

130 135 140

Ser Ser Ala His Gly His Leu Ile Gln Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Ser Val Asp Asp Val Glu Ile Asn Leu Leu Gln Pro Ser Asp Ala Lys

165 170 175

Ala Ala Phe Gln Asn Gly Gln Val Asp Ala Trp Ala Val Trp Asp Pro

180 185 190

Tyr Ser Ser Gln Ala Glu Leu Glu Gly Ala Gln Val Leu Val Arg Gly

195 200 205

Ala Gly Leu Val Ser Gly His Gly Phe Gly Val Ala Ser Asp Glu Ala

210 215 220

Leu Asp Asp Pro Ala Lys Glu Ala Ala Leu Ala Asp Phe Leu Asp Arg

225 230 235 240

Val Ala Asp Ser Tyr Glu Trp Ala Glu Asp Asn Thr Asp Glu Trp Ala

245 250 255

Thr Ile Phe Ser Gln Glu Ser Gly Phe Asp Pro Glu Ala Ser Gln Leu

260 265 270

Asn Thr Arg Ser Leu Arg His Gln Val Pro Leu Asp Glu Ser Val Asn

275 280 285

Thr Tyr Gln Asn Ala Leu Ile Asp Ala Phe Val Ser Ala Gly Leu Val

290 295 300

Glu Asp Phe Asn Phe Glu Asp Thr Val Asp Thr Arg Phe Glu Gly

305 310 315

<210> 44

<211> 243

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 44

Met Thr Ala Thr Leu Ser Leu Lys Pro Ala Ala Thr Val Arg Gly Leu

1 5 10 15

Arg Lys Ser Tyr Gly Thr Lys Glu Val Leu Gln Gly Ile Asp Leu Thr

20 25 30

Ile Asn Cys Gly Glu Val Thr Ala Leu Ile Gly Arg Ser Gly Ser Gly

35 40 45

Lys Ser Thr Ile Leu Arg Val Leu Ala Gly Leu Ser Lys Glu His Ser

50 55 60

Gly Ser Val Glu Ile Ser Gly Asn Pro Ala Val Ala Phe Gln Glu Pro

65 70 75 80

Arg Leu Leu Pro Trp Lys Thr Val Leu Asp Asn Val Thr Phe Gly Leu

85 90 95

Asn Arg Thr Asp Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Glu Arg Ala Ser Ala

100 105 110

Leu Leu Ala Glu Val Lys Leu Pro Asp Ser Asp Ala Ala Trp Pro Leu

115 120 125

Thr Leu Ser Gly Gly Gln Ala Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Leu

130 135 140

Ile Ser Glu Pro Glu Leu Leu Leu Leu Asp Glu Pro Phe Gly Ala Leu

145 150 155 160

Asp Ala Leu Thr Arg Leu Thr Ala Gln Asp Leu Leu Leu Lys Thr Val

165 170 175

Asn Thr Arg Asn Leu Gly Val Leu Leu Val Thr His Asp Val Ser Glu

180 185 190

Ala Ile Ala Leu Ala Asp His Val Leu Leu Leu Asp Asp Gly Ala Ile

195 200 205

Thr His Ser Leu Thr Val Asp Ile Pro Gly Asp Arg Arg Thr His Pro

210 215 220

Ser Phe Ala Ser Tyr Thr Ala Gln Leu Leu Glu Trp Leu Glu Ile Thr

225 230 235 240

Thr Pro Ala

<210> 45

<211> 256

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 45

Met Thr Thr Thr Leu Thr Arg Pro Lys Ile Ala Leu Pro Ala Arg Ile

1 5 10 15

Tyr Ser Pro Leu Ala Val Leu Val Phe Trp Gln Leu Gly Ser Ser Leu

20 25 30

Gly Ala Ile Pro Glu Arg Ile Leu Pro Ala Pro Thr Thr Ile Leu Ala

35 40 45

Ala Ser Trp Glu Val Ala Thr Asn Gly Thr Leu Leu Asp Ala Leu Leu

50 55 60

Val Ser Ser Gln Arg Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Gly Ala Val Leu

65 70 75 80

Gly Ile Ser Leu Gly Val Leu Thr Gly Met Ser Arg Phe Ala Asp Thr

85 90 95

Ala Val Asp Pro Leu Ile Gln Ala Ala Arg Ala Leu Pro His Leu Gly

100 105 110

Leu Val Pro Leu Phe Ile Ile Trp Phe Gly Ile Gly Glu Leu Pro Lys

115 120 125

Val Leu Ile Ile Ser Leu Gly Val Leu Tyr Pro Leu Tyr Leu Asn Thr

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Arg Gln Ile Asp Pro Lys Leu Leu Glu Ala Gly His

145 150 155 160

Val Met Gly Phe Gly Phe Phe Gln Arg Leu Arg Thr Ile Ile Ile Pro

165 170 175

Ser Ala Ala Pro Gln Leu Phe Val Gly Leu Arg Gln Ala Ser Ala Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Leu Ile Val Ala Glu Gln Val Asn Ala Arg Glu Gly

195 200 205

Leu Gly Phe Leu Ile Asn Asn Ala Arg Asp Phe Tyr Arg Thr Asp Leu

210 215 220

Val Ile Phe Gly Leu Ile Val Tyr Ala Ser Leu Gly Leu Leu Ser Glu

225 230 235 240

Ala Leu Ile Arg Ala Trp Glu Arg His Thr Phe Arg Tyr Arg Asn Ala

245 250 255

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Способ продуцирования серосодержащей аминокислоты или ее производного

<130> OPA20064

<150> KR 10-2019-0077998

<151> 2019-06-28

<160> 45

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 2642

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

ctcccgcgca ctgctgcaat ccgcaccgtg cccaatgatg gtggttcgcc cacctgagaa 60

gattaagaag tagtttcttt taagtttcga tgccccggtt tcctgatttt gtgcagggag 120

gccggggcat tggtgtttgc gggttagttc gggccattcg aaagggagaa accaagggca 180

gccagacaga cgtgccaaga atctggattt ccgccaggtt ttggcacgcc cgtctggttt 240

aggcaatgag ataccgaaca cacgtgccaa aagttcggct ttttcgccga tcttgtcacg 300

cctgcctggt ttgtcttgta aagagtgatt tcatggccga gactcctaaa agtttgacct 360

cacaggattg cttctaaggg cctctccaat ctccactgag gtacttaatc cttccgggga 420

attcgggcgc ttaaatcgag aaattaggcc atcacctttt aataacaata caatgaataa 480

ttggaatagg tcgacacctt tggagcggag ccggttaaaa ttggcagcat tcaccgaaag 540

aaaaggagaa ccacatgctt gccctaggtt ggattacatg gatcattatt ggtggtctag 600

ctggttggat tgcctccaag attaaaggca ctgatgctca gcaaggaatt ttgctgaaca 660

tagtcgtcgg tattatcggt ggtttgttag gcggctggct gcttggaatc ttcggagtgg 720

atgttgccgg tggcggcttg atcttcagct tcatcacatg tctgattggt gctgtcattt 780

tgctgacgat cgtgcagttc ttcactcgga agaagtaatc tgctttaaat ccgtagggcc 840

tgttgatatt tcgatatcaa caggcctttt ggtcattttg gggtggaaaa agcgctagac 900

ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 960

gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtggctgcta gcgcttcagg 1020

caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat cgaccaagcc cccgacagcg 1080

tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt attcgcgtca tcggtattga 1140

tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc tattcccttt tcggatcgaa 1200

ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag ctgtggcgtg aagcgtggcg 1260

tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc atcgcgttct ttgatcagtg 1320

cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac tttcagaatg cggctagtga 1380

gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt gcagcagtgt tagagcaccg 1440

cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag aagaacggct acccaggcac 1500

cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga cttgctggat ctcgattggt 1560

ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct cggcagttgt tgtcggctcc 1620

acctgcggac tactcaattt agtttcttca ttttccgaag gggtatcttc gttgggggag 1680

gcgtcgataa gccccttctt tttagcttta acctcagcgc gacgctgctt taagcgctgc 1740

atggcggcgc ggttcatttc acgttgcgtt tcgcgcctct tgttcgcgat ttctttgcgg 1800

gcctgttttg cttcgttgat ttcggcagta cgggttttgg tgagttccac gtttgttgcg 1860

tgaagcgttg aggcgttcca tggggtgaga atcatcaggg cgcggttttt gcgtcgtgtc 1920

cacaggaaga tgcgcttttc tttttgtttt gcgcggtaga tgtcgcgctg ctctaggtgg 1980

tgcactttga aatcgtcggt aagtgggtat ttgcgttcca aaatgaccat catgatgatt 2040

gtttggagga gcgtccacag gttgttgctg acccaataga gtgcgattgc tgtggggaat 2100

ggtcctgtga ggccaaggga cagtgggaag atcggcgcga ggatcgacat cacgatcatg 2160

aacttcagca tgccgttaga gaatccggat gcgtaatcgt tggtttggaa gctgcggtac 2220

atggacatcg ccatgttgat tgcggtgagg attgcggctg tgatgaacag tggcaaaacg 2280

aaactaagaa cttccgcctg cgtggtgctc aaatatttta gctgctcagt gggcatcgaa 2340

acataagcgg gcagaggcac attgctcacg cgaccagcga ggaaagattc cacttcctca 2400

ggagttagga agccgatcga ctggaagacg ggattttcca aaccaccttc agggcgagcc 2460

atgcggagaa gtgcccagta aagaccaagg acaatcggta tctggatcag cccaggcaca 2520

caacctgcca gcgggttaat gccgtattcc ttattcaaat cattctggcg cttctgcaac 2580

tcccgaatgg acgcttcatc gtactttccc ttgtattctt cccggagcgc agcgcggtga 2640

gg 2642

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 2

tcgagctcgg tacccctgcc tggtttgtct tgta 34

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 3

cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 4

aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 5

ctctagagga tccccgtttc gatgcccact gagca 35

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 6

aatctggatt tccgccaggt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 7

cttcctaact cctgaggaag 20

<210> 8

<211> 4528

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

atgcgtggat tactgacgct tctttgattg aggcgacaaa acgcttgaag ttcctcgttg 60

cgcttcgccc tgggcagatt ggacctacgc tgtctgctca aatggcttct actttccagc 120

gtctgtctgg caaccgtttg ctgatcaatg tggtcaccgg tggggaagat gcggagcagc 180

gtgcgtttgg tgatttcttg aacaaggagg agcgctacgc ccgtaccgga gaattcttgg 240

atatcgtgag ccgcttgtgg cgaggcgaaa ccgtcacgca ccacggtgaa cacctgcagg 300

tggagcaagc tagccttgcg catccgccag agattattcc ggagattctt tttggtggat 360

cgtcgccagc tgcaggtgag gtggctgcac gttatgcgga cacctatctc acgtggggtg 420

aaactcccga tcaggtggcg cagaaaatca actggatcaa cgagctagca gcacagcgcg 480

gccgggaact gcgccatgga atccgcttcc atgtgatcac ccgcgatacg tctgaagaag 540

catgggtggt ggcagagaag ttgattagcg gggtcactcc agaacaggtc gctaaggctc 600

aagccgggtt tgcaacgtct aagtcggagg ggcagcgccg gatggctgag ctgcacagca 660

agggtcgtgc ctttactagt ggctcaactg ctcgtgatct ggaggtgtat cccaatgtgt 720

gggcaggcgt cggtttgctt cgcggaggtg caggaacagc ccttgtgggc tcgcatgaag 780

aggtcgccga tcgcatcgaa gaatacgcag cactcggctt ggatcagttt gtactgtcgg 840

gttatccaaa cttggaggag gccttccact tcggtgaggg tgtgattccg gagctgctgc 900

gccgcggtgt ggatatcaaa aatcaagaat cacgagtttt ggaacctgtt gggtaaacgg 960

gaagaacgag acgtcgataa gcaaatttct taaggaacct gacatgacta caaccttgac 1020

tcgccccaaa atcgcgctgc ccgcgcgcat ctattcaccg cttgcggtgc ttgttttctg 1080

gcagctcggc tcgagcctgg gcgccatccc ggagcggatt ctgccggcac caaccacgat 1140

cttggccgcc agctgggagg tcgccacaaa tggcacgctt ctcgacgccc tcctcgtctc 1200

aagccaacgc gtccttctag gcttcgccct cggtgctgtc ctaggcattt ccctaggtgt 1260

attgacaggc atgtccagat ttgcagacac cgccgttgat ccgctcattc aagctgcccg 1320

cgcgctgcct cacctgggtc ttgtgccgct gtttatcatc tggttcggta tcggtgagct 1380

gccgaaagta ctgattatta gcctcggcgt gctgtatccg ctgtacctca acaccgccag 1440

cgggttcagg caaattgatc caaagcttct ggaagccggc cacgtgatgg gcttcggatt 1500

tttccagagg ttgcggacca tcatcattcc ttctgccgcg ccgcaacttt ttgtcggcct 1560

gcgccaagca agtgcggccg cctggctctc actgatcgtg gcggaacagg tcaacgcccg 1620

cgaaggactc ggcttcctca tcaacaatgc gcgcgatttt taccgcaccg acctcgttat 1680

tttcggcctc attgtctacg ccagcctcgg tctgctgtct gaagcgctga tcagagcttg 1740

ggaacgtcac accttccgct accgaaacgc ataagaaagt tgctcgccat gactgccaca 1800

ttgtcactca aacccgcagc cactgtccgt ggattgcgca aatcatacgg aactaaagaa 1860

gtcctccaag gaatcgacct caccatcaac tgcggcgaag taaccgcgct gatcggacgc 1920

tcaggttcag gaaaatccac catcctgcgc gtgttggcgg gcctatctaa agagcattcc 1980

ggctctgtag aaatttccgg aaacccggcc gttgccttcc aagagcctcg cctgttgccg 2040

tggaaaacgg tgctcgataa tgtgaccttt ggcctcaacc gcactgatat ttcctggtca 2100

gaagcacaag aacgcgcctc ggcactgctt gcagaagtca aacttcccga ctccgacgcc 2160

gcctggcccc tcacgctctc cggcggccaa gcccagcgcg tctcccttgc gcgagcgctc 2220

atctccgagc cagagctttt gcttctcgac gaacccttcg gcgccctcga tgctctgaca 2280

agactgacag cccaagacct gctgctcaaa accgtgaaca cccgaaactt gggagttctg 2340

ctggtcaccc atgatgtttc cgaggccatc gccctggccg accacgtcct tcttcttgac 2400

gacggcgcca tcacacacag tttgactgta gatatccccg gcgatcgccg cacccacccc 2460

tcctttgcct cctacaccgc tcaactcctt gagtggctcg aaatcaccac acctgcctag 2520

aaagaaatca tgaaatttaa gaaaatcgcc ctcgttctcg ccttcggtct aggccttgca 2580

tcctgctcat cagcttctgg cgatcccgcc accaacgccg atggatccat cgatctgagc 2640

aaagtaaccc ttaacatcgg tgatcaaatc gccggaacag aacaagtgct ccaagcttca 2700

ggggagctag atgatgtccc ttataaaatc gaatggtcat catttacctc tggaccaccc 2760

caaatcgaag cattaaacgc aggtcaaatt gatttcgcga tcaccggaaa caccccaccg 2820

atcatcggcg gccccaccaa caccaaagtg gtctccgcct acaacaacga tgctttaggt 2880

gatgtcatct tggtcgcccc ggattcttca ataacctcgg tggctgacct tgctggaaag 2940

aaagtggctg tcgcccgcgg atccagcgcc cacggacacc tcatccaaca actagaaaaa 3000

gcaggcgtga gcgttgacga cgtagaaatc aacctcctcc aaccctccga cgccaaagcc 3060

gctttccaaa acggccaggt agatgcgtgg gcagtgtggg atccctacag ctcacaggcg 3120

gaactggaag gagctcaagt tttggtcagg ggagcgggac tggtcagtgg gcatggattt 3180

ggtgtcgcaa gtgatgaagc gctcgatgac cccgcaaagg aagccgcctt ggcagatttc 3240

ctcgatcgcg tggccgactc ttatgaatgg gctgaagaca acaccgatga atgggcgacg 3300

attttcagcc aagaatccgg ctttgatccg gaggcctctc aactgaacac ccgcagcctg 3360

cgccatcagg tgccgctcga cgagtccgtc aacacctatc agaacgcgct tatcgacgct 3420

ttcgtctccg cgggtctcgt tgaggacttt aatttcgagg acaccgtaga cacccgattt 3480

gagggctaag tatgtctgag tatggcaaag gggcgttgag gtgctcagac ggccatacaa 3540

agcatcgtag tttgtgcata tgagggctgc tttttgccgc tgtgagttgg ctgttcagga 3600

atccgtcctc gggttgggga gaggggctga aaccgaacga atattcgcat aaatctttcg 3660

aattggcgcg aatattcgat cccgctggcc tccgaactag ccattttggt agaaaatttg 3720

catccttgag ccggtattgg cccaaggatg cattttcctg tgtcctactt ctgcagtgag 3780

tagaactgag cactcatcgc tgggacatgc agtgagagtg agtaggcgaa attatcgcgt 3840

ggtgtcgctg ctgcttgaac ggaagtagcg atatcgtttt ctgcaccgag gaattcagca 3900

tcatcagtgt tgagaacgag cttccattcg ccacccgctg caacaccgag ctggtactca 3960

ggctgggagg ttccagacag gttgaataca cacagcatct gggagccgtc gctgccgaaa 4020

cgagtgaacg ccaaaatgtt gttggtggcg tcgtcgccct tattccatgt gaagccttct 4080

ccggtgaaat cctgagtgtg cagcgcaggg gagtctgagt agacaccgtt gagggagcgg 4140

gtcagagtgc ggatggcttc gtggtactcg ccttgccagc cgtcgacaat atcccatggc 4200

agtccctggc cttcagccca ctcttcacgc tgaccaaact cctgacccat gaaaagcagc 4260

ttcttgcctg ggtgtgacca catgtacgca aggaaggtgc gaagaccagc ggccttgttc 4320

cacgtatcgc caggcatacg gtcccacagg gaacccttgc cgtggacgac ttcatcgtga 4380

gagatcggaa gtacaaaacg ctcagagaat gcgtacacca aggagaaagt gagctcactg 4440

tggtggaatg cgcggtgcac agggtttttg gagaagtact ctaaggtgtc gtgcatccag 4500

cccatgttcc acttgaggga gaatccca 4528

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 9

tcgagctcgg tacccagcaa gctagccttg cgcat 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 10

cagacataca gtactgtcag gttccttaag aaatt 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 11

gaacctgaca gtactgtatg tctgagtatg gcaaa 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 12

ctctagagga tccccttgtc gacggctggc aaggc 35

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 13

ccaggtgttt ggggtgcagg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 14

agtttggtca gcgtgaagag 20

<210> 15

<211> 3161

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 15

agacgattct ggaaggccac tttcttttga tcctggcggc gatttttcgg tgcttggtag 60

cggaatgtca atcgagacca agcgtccccc ggcgggtcga ttttttggtc tcgaatgaca 120

gtttcgctct ctggaaactc tcagtgtcag gtcagtggtg aaccaccatc cttagcaagg 180

agttcatcat gtccatcccc ttctcagtcc ttcaggacta cctggatctg atcagtcccg 240

aagccttacc ccagatccca cagcccccgg cccctgcccc cacagcaccc cagctaccac 300

cggcgccgga cccacacagc atcgagtggc cgatcttccc accagatcga atctccgcca 360

acgggcgacg ctactacgag ccacaaacac gactcgagtt catgcggatc tacaccaccc 420

tgccgcacgg ctaccgccag cccttcctta aagccaacaa catcggccac tgcaccgttc 480

gaacctggct agcagcaata agcaccttca gccgacttcc ccatgctttt gatgatgccc 540

accgcttcgg gatcgaacgc accaccccag tcgacgatgt caccacacta acggctgatg 600

acaaacgtga cctggtcata ggatacttag ctcaaccaca cggtcagggc cagcaattcc 660

tcacgtttta ccaactccgt aagcacacca tcatggcctg gtgcgccgct atgaccgacg 720

gggacttaga cgctgatatc tcaccccgcc agatcgggtt gatgaccacc cgaaccgtgg 780

tcgaaatcgt tcgactacgc cacatgattg cccaacaact agaaagagcc acgatcatgg 840

aaaacgagta cctcaaagaa atcgcagcgc tgaagaaaga actcgcgcac tacaagcaaa 900

aagaccatca gaatcaaatg gtgatcgata tcttgggaaa agctattggg accaggccca 960

atcctggcga gggcttagac gaggaggacg ccacctaaac gtggatgagc aacgcgcctt 1020

tgatcaagga ctcaaggaag aaaacacctt gatcacagat ctcaccacct gtgccaggct 1080

gagccataac aaggcattac ggctgatcaa gctgtcgaaa tcaacggcgt attaccgcaa 1140

caagccgcgt ccccgtcctg caccgaaacc tgtcctgcag gccgtgccag caccaacagc 1200

acctggtgtg gaacccacac cagagccttg gcaggggaag gagccagcag tgtcgtcggt 1260

gcgtcaagcg ttggcagaac acgaacgcca gttcattgtt gatgcgatca ccgcgtaccc 1320

acaactgagc gttagtgggg tgtttaacat gttgtttaac aaaggcatct accgcgcatc 1380

actacgtaca tggtggcgtg ttgccaagca gcacaagttg ttacacaaag accgagtcag 1440

tgccctgtcc ccggggaaac gatcaccaac gccacgggtt aagccgaggt tggaagcaac 1500

acagcctggt caggtggtgt gttgggatgt gacgttcttg ccgtcgctgg tacgtggtaa 1560

gacctatgcg ttgcatctgg cgattgattt gttttcccgc aagattgttg gggcgaaggt 1620

cgcgccgacg gaaaatacct ccaccgcggt ggagttgtta acgcaggtgt tagcggataa 1680

tccgggtgtg gtgacggtgc attcggataa tgggtcggcg atgacatcga cgagggtgcg 1740

gcggttgtta gcggatcatg gtgtggcgtt gtcgttgatt cggccgcggg tgagtgatga 1800

taatgcgttt gtggagtcgg tgtttcatac gttgaagtat cggccgtttt atccgaaggt 1860

gtttgcatcg atggatcagg cccgggtgtg ggtggaggag tttgtggtgt attacaacac 1920

ggttcatccg cattctggtg tggctgggca tactccgcag tcggtgtttg atggtagttg 1980

gagggcggct cataggttgc gtgtgcaggc gttggatgcc cattaccggc agttcccgca 2040

gcggtatgtg gggcggccgg tggttcagga agttgctggt gtggtgcgtc ttaatggtgc 2100

gcgtgatgat gggtctgtac aggagagggt tggtggtgta gcgtcgctgt taagtgcttg 2160

agttagcatg tgttcttatc gcccccctgg ttcacaaacc cctggcagcg agcggaaaag 2220

tgcattttta ggccaagggc cctcggatct tcgagcgctt tggtctcttt tgcacgtctg 2280

accgaaccag atcacctaga aacgccaaag gccccgcaag tatcaaacct gcggggcctt 2340

tgaggtacct gtttcctatt ttgttgactt aggaagctgc gcacggcgga taaccaaacc 2400

gcacagcaag gcagccactc cccacgcggt gagccagaac tgctccacga cataaacctg 2460

aatagttgga agcaaacgac ttacgatcac cagggctaca gcgatgctca aagaaatgat 2520

ctgtgtcttt gagcttggct cgtacttgct ggtggtagcg aatgcgccga gaatgatcga 2580

ggcaacgagg atcagaagga atcctggagt gatcacaaat gggctcagca tgccggcggt 2640

aaacagctca attgctgcaa acaccaacaa aaccagacct aaggctacga aagctccacc 2700

gatgcggatt gctgccggaa ctttacgcca gctggcacgg ccttcgaggc tggtgagctt 2760

ttttaatgat cttcccgatg ctgaactcat aatgtgacat accctactag ttctcgtacc 2820

atccccacac aattgacctg ccaagagtgt ggaaatacag gttgaagcct agaacagtgg 2880

gggtagcgtc gggggcgatg tcgagttttt ccacatcaag tgcatgaact gcgaagaggt 2940

aacggtgcgg tgcgtggcca gctggaggtt gcgctccgta gaagccacgc ttgccggaat 3000

cacccttgag ggaaactacg ccttcgatgc cgccgagggt ttcatcgcca gcaccggtgg 3060

ggatctccgt gacagttgtg gggatgttaa acactgccca gtgccagaaa ccagcgccgg 3120

ttggggcatc tgggtcgagg caggtgatcg cgagggattt g 3161

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 16

tcgagctcgg tacccttttt tggtctcgaa tgaca 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 17

catgctaaca gtactgttta ggtggcgtcc tcctc 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 18

cacctaaaca gtactgttag catgtgttct tatcg 35

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 19

ctcagaggat cccccccacc ggtgctggcg atga 34

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 20

cgccacctaa acagtgaagc ctaaaaacga ccgag 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 21

caaggttgta gtcatgttgt gtctcctcta aagat 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 22

tagaggagac acaacatgac tacaaccttg actcg 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 23

acacatgcta acagtcatgt cccagcgatg agtgc 35

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 24

ctggcggcga tttttcggtg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 25

cgcgatcacc tgcctcgacc 20

<210> 26

<211> 5666

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

tgtcatgctt ccggaggtgc gcagggctcg agactccgga aagctatttg ccactccgat 60

gtttgggtca ctcgacgaga tacgtgctga tcacctaatt tggtgcacag ggtttcggcc 120

ggcgattagg ccagttcgtc aacttctcaa acacggacaa ccaaaggttc ctggtcttta 180

tttagtaggc tacggagatt ggacgggacc tgggtctgcg actatcacag gggtcgggct 240

ttatgccaag cgagcagcca aagagattgc cgcgtcagtc ggcaaagtcg ttaaatagtt 300

tgaaggctaa gaacttaatg ttaaagcgaa aattgttttg acacctcaac taatgcagcg 360

atgcgttctt tccagaatgc tttcatgaca gggatgctgt cttgatcagg caggcgtctg 420

tgctggatgc cgaagctgga tttattgtcg cctttggagg tgaagttgac gctcactcga 480

gaatcatcgg ccaaccattt ggcattgaat gttctaggtt cggaggcgga ggttttctca 540

attagtgcgg gatcgagcca ctgcgcccgc aggtcatcgt ctccgaagag cttccacact 600

ttttcgaccg gcaggttaag ggttttggag gcattggccg cgaacccatc gctggtcatc 660

ccgggtttgc gcatgccacg ttcgtattca taaccaatcg cgatgccttg agcccaccag 720

ccactgacat caaagttgtc cacgatgtgc tttgcgatgt gggtgtgagt ccaagaggtg 780

gcttttacgt cgtcaagcaa ttttagccac tcttcccacg gctttccggt gccgttgagg 840

atagcttcag gggacatgcc tggtgttgag ccttgcggag tggagtcagt catgcgaccg 900

agactagtgg cgctttgcct gtgttgctta ggcggcgttg aaaatgaact acgaatgaaa 960

agttcgggaa ttgtctaatc cgtactaagc tgtctacaca atgtctactt cagttacttc 1020

accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat gcgttggcaa accatgtgtt 1080

gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt gacctggacg tggaaaagga 1140

tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac acccgccctg atgtgttgag 1200

gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg gttgagacca atacttttgg 1260

ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat cgttgccgtg agcttgccta 1320

caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg gggccgggcc gaaacggcat 1380

gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag cttccatcgc tgggccatgc 1440

accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg cttggcatca tcgacggtgg 1500

tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt caggtcaagg ctgcggttca 1560

cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg cccattattt gccacgtcac 1620

cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc ggtgccgcgt tgacagcgct 1680

gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc accggcccag atgagatgag 1740

cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct gtgtcggtga tgcctaacgc 1800

aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca cttgaggctg aggatttggc 1860

gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc atggtgggtg gttgttgtgg 1920

caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg gttggtgttc cagagcagga 1980

aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag caggcctccc gcgaggtgga 2040

gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca ttgtcccagg aaaccggcat 2100

ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag gcattccgtg aggcaatgct 2160

gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag caaacccgcg atggtgcaca 2220

catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc accgccgata tggcgacctt 2280

ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg attgactcca ccgagccaga 2340

ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc atcgttaact ccgtcaactt 2400

tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc atgaaactgg taaagcagca 2460

cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc caggcacgta ccgctgagca 2520

caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc ggcagctacg gcctggatat 2580

caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct actggccagg aagaaaccag 2640

gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg aagaagctct acccagaaat 2700

ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg aaccctgctg cacgccaggt 2760

tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt ctggactctg cgattgcgca 2820

cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc cagcgcgaag tggcgttgga 2880

tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg caggaattca tgcagctgtt 2940

tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct gaacagctgg ccgctatgcc 3000

tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat aagaatggcc ttgaggatga 3060

tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc atcaacgagg accttctcaa 3120

cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag atgcagctgc cattcgtgct 3180

gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg gaaccgttca tggaagagga 3240

agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc aaaatcgtcg tggccaccgt 3300

caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac atcattttgt ccaacaacgg 3360

ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc gccatgttgg aagcagcgga 3420

agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt gtgaagtcca ccgtggtgat 3480

gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc aattacccag tcattttggg 3540

tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc aacgaggtgt acaccggtga 3600

ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg atggatgagg tgatggcaga 3660

aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct attgagcagg cgaagaagaa 3720

ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt gccgcggagc gtaaagctaa 3780

tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc accgatactc caaccgcggc 3840

accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc ttggcggagt tcttgggcaa 3900

ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg aaatccaccc gcggcaacga 3960

gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga ccacgcctgc gctactggct 4020

ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc ttggtgtatg gctacttccc 4080

agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc ccggatccac acgcagccga 4140

acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg ttcttgtgca tcgcggattt 4200

cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg gacgtcatgc cattccagct 4260

ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag ttgttcgcag ccaatgaata 4320

ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc accgaagcat tggccgagta 4380

ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac ggtggatctg tcgctgattt 4440

tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac cgcggcgccc gcttctcctt 4500

tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag ctggtggaat tgctcgagcc 4560

aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg cacccagagc agtccacaga 4620

cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac gtctaacacc tttgagaggg 4680

aaaactttcc cgcacattgc agatcgtgcc actttaacta aggttgacgg catgattaag 4740

gcgattttct gggacatgga cggcacgatg gtggactctg agccacagtg gggcattgct 4800

acctacgagc tcagcgaagc catgggccgc cgcctcaccc cggagctccg ggaactcacc 4860

gtcggctcga gcctgccgcg caccatgcgc ttatgcgcag agcacgcagg cattacattg 4920

agcgacgcgg actacgagcg ctaccgggct ggcatgttcg cccgggtcca tgagcttttc 4980

gacgaatccc tcgtcccaaa tccaggcgtc accgaactcc tgacagagtt gaaggccctc 5040

gagatcccca tgttggtcac caccaacaca gagcgcgatc tcgcgacccg ttcagtcgca 5100

gccgtgggaa atgagttctt catcggttct atcgctggtg atgaagtccc aacagcaaag 5160

ccagcccccg acatgtacct cgaagcagca cgacgtgtgg gctttgaccc atcagagtgc 5220

ctcgtgttcg aagattccta caacggcatg ctgggcgctg ttactgcagg ttgccgcgtc 5280

attggtctgc acccagaaga agtccaagcg ccagaaggtg tagtgccttt gcgttccctc 5340

cacggtaaaa actctttcga aggtgtcacc gctgagatgg tcactgcctg gtaccaccag 5400

atcgagccgg caggtgtcgc aaaataaaac caggtggggg agtgaaatta ttcgactaat 5460

atcctccccc aaacacacat tgataactgt tgtgtggaag aatgtaccga gtgaagacat 5520

ttgactcgct gtacgaagaa cttcttaacc gtgctcagac ccgccctgaa gggtctggaa 5580

ccgtggccgc cttggataaa ggcatccatc atctaggtaa gaaggtcatc gaagaagccg 5640

gagaggtctg gattgcagcc gagtat 5666

<210> 27

<211> 3613

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 27

tcctgtgggg tgaacttgac ctgtgctggg ccacgacgtc cgaaaacgtg cacttcagtg 60

gccttgtttt ctttgaggga gtcgtagacg ttgtcggaaa tttcggtgac tttgagctcg 120

tcgcctgtct tagccaggat gcgggctacg tcgaggccga cgttaccaac gccgataaca 180

gcgacggact gtgcagacag atcccaggag cgctcgaagc gtgggttgcc gtcgtagaag 240

ccaacgaact cgccggcacc gaaggagcct tctgcttcaa ttccggggat gttgaggtcg 300

cggtctgcaa ctgcgccggt ggagaacacg actgcatcgt agtagtcgcg gagttcttcg 360

acggtgatgt ctttgccgat ttcaatgtta ccgagcaggc gcaggcgtgg cttgtccaac 420

acgttgtgca gggacttaac gatgcccttg atgcgtgggt ggtctggagc aacgccgtaa 480

cggatgagtc cgaacggtgc aggcatttgc tcgaaaaggt caacgaacac ttcgcgctct 540

tcattgcgga tgaggaggtc ggatgcgtaa atgccagcag ggccagctcc gatgacggct 600

acgcgcaggg gagttgtcat gtgtttgaag ttgcctttcg tgagcccttt tatggaaaca 660

agggtgtgaa aatcaagtag ttaaaggtgt ttcaagtcca ggctgtttaa cactcctaga 720

ccgcttggtc tgtaaacgta gcagcgaaat gcgacaatgc gaagactttt gcttaattaa 780

attcaaactc catgaaaaaa ctagacagat cggtctatta tattcacggt gaacctaacc 840

taatatcccc aggttaattc atttaaacgg gcattaggtg actccattgc tttcagtctc 900

atgaatctaa tggttggtct agacagagcg gtacgtctaa gtttgcggat agatcaaacc 960

gagtgacatg tacttcacta gctctttaag gattaactcc ccatgacaac aaccaccgga 1020

agtgcccggc cagcacgtgc cgccaggaag cctaagcccg aaggccaatg gaaaatcgac 1080

ggcaccgagc cgcttaacca tgccgaggaa attaagcaag aagaacccgc ttttgctgtc 1140

aagcagcggg tcattgatat ttactccaag cagggttttt cttccattgc accggatgac 1200

attgccccac gctttaagtg gttgggcatt tacacccagc gtaagcagga tctgggcggt 1260

gaactgaccg gtcagcttcc tgatgatgag ctgcaggatg agtacttcat gatgcgtgtg 1320

cgttttgatg gcggactggc ttcccctgag cgcctgcgtg ccgtgggtga aatttctagg 1380

gattatgctc gttccaccgc ggacttcacc gaccgccaga acattcagct gcactggatt 1440

cgtattgaag atgtgcctgc gatctgggag aagctagaaa ccgtcggact gtccaccatg 1500

cttggttgcg gtgacgttcc acgtgttatc ttgggctccc cagtttctgg cgtagctgct 1560

gaagagctga tcgatgccac cccggctatc gatgcgattc gtgagcgcta cctagacaag 1620

gaagagttcc acaaccttcc tcgtaagttt aagactgcta tcactggcaa ccagcgccag 1680

gatgttaccc acgaaatcca ggacgtttcc ttcgttcctt cgattcaccc agaattcggc 1740

ccaggatttg agtgctttgt gggcggtggc ctgtccacca acccaatgct tgctcagcca 1800

cttggttctt ggattccact tgatgaggtt ccagaagtgt gggctggcgt cgccggaatt 1860

ttccgcgact acggcttccg acgcctgcgt aaccgtgctc gcctcaagtt cttggtggca 1920

cagtggggta ttgagaagtt ccgtgaagtt cttgagaccg aatacctcga gcgcaagctg 1980

atcgatggcc cagttgttac caccaaccct ggctaccgtg accacattgg cattcaccca 2040

caaaaggacg gcaagttcta cctcggtgtg aagccaaccg ttggacacac caccggtgag 2100

cagctcattg ccattgctga tgttgcagaa aagcacggca tcaccaggat tcgtaccacg 2160

gcggaaaagg aactgctctt cctcgatatt gagagaaaga accttactac cgttgcacgc 2220

gacctggatg aaatcggact gtactcttca ccttccgagt tccgccgcgg catcatttcc 2280

tgcaccggct tggagttctg caagcttgcg cacgcaacca ccaagtcacg agcaattgag 2340

cttgtcgacg aactggaaga gcgcctcggc gatttggatg ttcccatcaa gattgcactg 2400

aacggttgcc ctaactcttg tgcacgcacc caggtttccg acatcggatt caagggacag 2460

accgtcactg atgctgacgg caaccgcgtt gaaggtttcc aggttcacct gggcggttcc 2520

atgaacttgg atccaaactt cggacgcaag ctcaagggcc acaaggttat tgccgatgaa 2580

gtgggagagt acgtcactcg cgttgttacc cacttcaagg aacagcgcca cgaggacgag 2640

cacttccgcg attgggtcca gcgggccgct gaggaagatt tggtgtgagt cttcggagga 2700

aacccaatcc caaccgcaac caccctctgt actgcccata ctgcgcggga gaagttcttt 2760

tccccgatga gcaaacagaa ttcgcgtggt tgtgtgcgga ttgcaccaga gtttttgaag 2820

tgaaatatca cggccaggac gatccagtgc acaggccagc accagcaaag tccacatcgc 2880

aagcattaaa agaatctctc gaaagacaca aaagaggtga gtcgcaacaa tgagctttca 2940

actagttaac gccctgaaaa atactggttc ggtaaaagat cccgagatct cacccgaagg 3000

acctcgcacg accacaccgt tgtcaccaga ggtagcaaaa cataacgagg aactcgtcga 3060

aaagcatgct gctgcgttgt atgacgccag cgcgcaagag atcctggaat ggacagccga 3120

gcacgcgccg ggcgctattg cagtgacctt gagcatggaa aacaccgtgc tggcggagct 3180

ggctgcgcgg cacctgccgg aagctgattt cctctttttg gacaccggtt accacttcaa 3240

ggagaccctt gaagttgccc gtcaggtaga tgagcgctat tcccagaagc ttgtcaccgc 3300

gctgccgatc ctcaagcgca cggagcagga ttccatttat ggtctcaacc tgtaccgcag 3360

caacccagcg gcgtgctgcc gaatgcgcaa agttgaaccg ctggcggcgt cgttaagccc 3420

atacgctggc tggatcaccg gcctgcgccg cgctgatggc ccaacccgtg ctcaagcccc 3480

tgcgctgagc ttggatgcca ccggcaggct caagatttct ccaattatca cctggtcatt 3540

ggaggaaacc aacgagttca ttgcggacaa caacctcatc gatcacccac ttacccatca 3600

gggttatcca tca 3613

<210> 28

<211> 3311

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 28

ctcattccag cgtcacgacg ttccgaaggt actggttacc tggcattggg cactaccgtt 60

tctgcagcac ttggaccagc cctagcactt tttgtcctag gaacatttga ttacgacatg 120

ctgtttatcg tggtcttggc aacctcggtc atctctttga tcgccgtcgt gttcatgtac 180

tttaagacca gcgaccctga gccttctggg gaaccagcca agttcagctt caaatctatt 240

atgaacccaa agatcatccc catcggcatc tttatcttgc ttatttgctt tgcttactct 300

ggcgtcattg cctacatcaa cgcatttgct gaagaacgcg atctgattac gggtgctgga 360

ttgttcttca ttgcctacgc agtatcaatg tttgtgatgc gcagcttcct tggcaaactg 420

caggaccgtc gcggagacaa cgtcgttatt tactttggat tgttcttctt cgttatttcc 480

ttgacgattt tgtcctttgc cacttccaac tggcacgttg tgttgtccgg agtcattgca 540

ggtctgggat acggcacttt gatgccagca gtgcagtcca tcgctgttgg tgtagtagac 600

aaaaccgaat tcggtacggc cttctccact ttgttcctgt ttgtggactt aggttttggc 660

tttggaccta ttatcctggg agcagtttct gcggcaattg gtttcggacc tatgtatgca 720

gcactggcag gtgtgggtgt gattgccgga atcttctacc tgttcacaca cgctcgcacc 780

gatcgagcta agaatggctt tgttaaacac ccagagcctg tcgctttagt tagctagttc 840

tttcagcttt ccctcccgat cagcgtaaac cggcccttcc ggttttgggg tacatcacag 900

aacctgggct agcggtgtag acccgaaaat aaacgagcct tttgtcaggg ttaaggttta 960

ggtatctaag ctaaccaaac accaacaaaa ggctctaccc atgaagtcta ccggcaacat 1020

catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc accatcaccg gcgcttccga 1080

tgcaggtgat tacaccctga tcgaagcaga cgcactcgac tacacctcca cctgcccaga 1140

atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg atgctcattg atttacccat 1200

cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc taccgctgca ccaaccccac 1260

atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct gaccacggta aaaaggtcac 1320

ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt gaccggatga gtgttcacgc 1380

aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc caactagccc tcgatatgtg 1440

ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga gtgtatgtca ttggggtgga 1500

tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat gggtttgtca ccgtgattgt 1560

cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc cggttattag atgtcgtccc 1620

aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc cgcggtgaac agttccgcaa 1680

tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac gccacagcaa gtaaagaact 1740

cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt gtgcggcttg ctggtgacaa 1800

gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac cagcgtcgtg gtttaagcca 1860

ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg cacaagtggt tgagtcctcg 1920

tcagcaagaa agcttggagc agttgtgggc gtatgacaaa gactacgggg cgttaaagct 1980

tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag atgggtaata agcgtgaagc 2040

gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg ttgaaggggc cgaataagga 2100

actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt gatgtgttgg cgtatttcga 2160

tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga cggttggagc atttgcgtgg 2220

gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg cggtgcctta tccattcagg 2280

gcagttggtc cataagatca atgcactcta aaacaggaag agcccgtaaa cctctgacta 2340

gcgtcaccct ctgattaagg cgaccgcgga tttaagagca gaggctgcca cgagcgcatc 2400

ttcacggctg tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460

aagccccaac gccagcaaca catgggatac ctctccggaa ccacaggcag aaccagggga 2520

gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580

gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640

gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700

ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760

tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820

aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880

aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940

caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000

tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060

gggggatagg taggtgatct cgaaatcatg aaacctttca agataagcag cagtttctag 3120

gacactgtca tgctcgatcg gggtggtgat gaggtgccgg ccacgaggat tagctaagca 3180

cgctcctttg atagcgaggt tgttggcttc tgatccaccc gacgtaaacg tcacctgtgt 3240

ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300

gagtcttccc a 3311

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 29

acccggggat cctctagaat gtttgtgatg cgcag 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 30

gtcagagagt acttacgctg atcgggaggg aaagc 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 31

atcagcgtaa gtactctctg actagcgtca ccctc 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 32

ctgcaggtcg actctagaaa agggattgga gtgtt 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 33

caacgaaagg aaacaatgtc tacttcagtt acttc 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 34

tagtcagaga gtgatttaga cgttaaagta ctttg 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 35

atcaaaacag atatcatgac aacaaccacc ggaag 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 36

cgctagtcag agagttcaca ccaaatcttc ctcag 35

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 37

ccgatcagcg taagtagaaa catcccagcg ctact 35

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 38

aactgaagta gacattgttt cctttcgttg ggtac 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 39

tactttaacg tctaaggtac cggcgcttca tgtca 35

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 40

ggtggttgtt gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 41

atccccatcg gcatctttat 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 42

cgatcacact gggctgatct 20

<210> 43

<211> 319

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 43

Met Lys Phe Lys Lys Ile Ala Leu Val Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Ser Cys Ser Ser Ala Ser Gly Asp Pro Ala Thr Asn Ala Asp Gly

20 25 30

Ser Ile Asp Leu Ser Lys Val Thr Leu Asn Ile Gly Asp Gln Ile Ala

35 40 45

Gly Thr Glu Gln Val Leu Gln Ala Ser Gly Glu Leu Asp Asp Val Pro

50 55 60

Tyr Lys Ile Glu Trp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Pro Pro Gln Ile Glu

65 70 75 80

Ala Leu Asn Ala Gly Gln Ile Asp Phe Ala Ile Thr Gly Asn Thr Pro

85 90 95

Pro Ile Ile Gly Gly Pro Thr Asn Thr Lys Val Val Ser Ala Tyr Asn

100 105 110

Asn Asp Ala Leu Gly Asp Val Ile Leu Val Ala Pro Asp Ser Ser Ile

115 120 125

Thr Ser Val Ala Asp Leu Ala Gly Lys Lys Val Ala Val Ala Arg Gly

130 135 140

Ser Ser Ala His Gly His Leu Ile Gln Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Ser Val Asp Asp Val Glu Ile Asn Leu Leu Gln Pro Ser Asp Ala Lys

165 170 175

Ala Ala Phe Gln Asn Gly Gln Val Asp Ala Trp Ala Val Trp Asp Pro

180 185 190

Tyr Ser Ser Gln Ala Glu Leu Glu Gly Ala Gln Val Leu Val Arg Gly

195 200 205

Ala Gly Leu Val Ser Gly His Gly Phe Gly Val Ala Ser Asp Glu Ala

210 215 220

Leu Asp Asp Pro Ala Lys Glu Ala Ala Leu Ala Asp Phe Leu Asp Arg

225 230 235 240

Val Ala Asp Ser Tyr Glu Trp Ala Glu Asp Asn Thr Asp Glu Trp Ala

245 250 255

Thr Ile Phe Ser Gln Glu Ser Gly Phe Asp Pro Glu Ala Ser Gln Leu

260 265 270

Asn Thr Arg Ser Leu Arg His Gln Val Pro Leu Asp Glu Ser Val Asn

275 280 285

Thr Tyr Gln Asn Ala Leu Ile Asp Ala Phe Val Ser Ala Gly Leu Val

290 295 300

Glu Asp Phe Asn Phe Glu Asp Thr Val Asp Thr Arg Phe Glu Gly

305 310 315

<210> 44

<211> 243

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 44

Met Thr Ala Thr Leu Ser Leu Lys Pro Ala Ala Thr Val Arg Gly Leu

1 5 10 15

Arg Lys Ser Tyr Gly Thr Lys Glu Val Leu Gln Gly Ile Asp Leu Thr

20 25 30

Ile Asn Cys Gly Glu Val Thr Ala Leu Ile Gly Arg Ser Gly Ser Gly

35 40 45

Lys Ser Thr Ile Leu Arg Val Leu Ala Gly Leu Ser Lys Glu His Ser

50 55 60

Gly Ser Val Glu Ile Ser Gly Asn Pro Ala Val Ala Phe Gln Glu Pro

65 70 75 80

Arg Leu Leu Pro Trp Lys Thr Val Leu Asp Asn Val Thr Phe Gly Leu

85 90 95

Asn Arg Thr Asp Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Glu Arg Ala Ser Ala

100 105 110

Leu Leu Ala Glu Val Lys Leu Pro Asp Ser Asp Ala Ala Trp Pro Leu

115 120 125

Thr Leu Ser Gly Gly Gln Ala Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Leu

130 135 140

Ile Ser Glu Pro Glu Leu Leu Leu Leu Asp Glu Pro Phe Gly Ala Leu

145 150 155 160

Asp Ala Leu Thr Arg Leu Thr Ala Gln Asp Leu Leu Leu Lys Thr Val

165 170 175

Asn Thr Arg Asn Leu Gly Val Leu Leu Val Thr His Asp Val Ser Glu

180 185 190

Ala Ile Ala Leu Ala Asp His Val Leu Leu Leu Asp Asp Gly Ala Ile

195 200 205

Thr His Ser Leu Thr Val Asp Ile Pro Gly Asp Arg Arg Thr His Pro

210 215 220

Ser Phe Ala Ser Tyr Thr Ala Gln Leu Leu Glu Trp Leu Glu Ile Thr

225 230 235 240

Thr Pro Ala

<210> 45

<211> 256

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 45

Met Thr Thr Thr Leu Thr Arg Pro Lys Ile Ala Leu Pro Ala Arg Ile

1 5 10 15

Tyr Ser Pro Leu Ala Val Leu Val Phe Trp Gln Leu Gly Ser Ser Leu

20 25 30

Gly Ala Ile Pro Glu Arg Ile Leu Pro Ala Pro Thr Thr Ile Leu Ala

35 40 45

Ala Ser Trp Glu Val Ala Thr Asn Gly Thr Leu Leu Asp Ala Leu Leu

50 55 60

Val Ser Ser Gln Arg Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Gly Ala Val Leu

65 70 75 80

Gly Ile Ser Leu Gly Val Leu Thr Gly Met Ser Arg Phe Ala Asp Thr

85 90 95

Ala Val Asp Pro Leu Ile Gln Ala Ala Arg Ala Leu Pro His Leu Gly

100 105 110

Leu Val Pro Leu Phe Ile Ile Trp Phe Gly Ile Gly Glu Leu Pro Lys

115 120 125

Val Leu Ile Ile Ser Leu Gly Val Leu Tyr Pro Leu Tyr Leu Asn Thr

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Arg Gln Ile Asp Pro Lys Leu Leu Glu Ala Gly His

145 150 155 160

Val Met Gly Phe Gly Phe Phe Gln Arg Leu Arg Thr Ile Ile Ile Pro

165 170 175

Ser Ala Ala Pro Gln Leu Phe Val Gly Leu Arg Gln Ala Ser Ala Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Leu Ile Val Ala Glu Gln Val Asn Ala Arg Glu Gly

195 200 205

Leu Gly Phe Leu Ile Asn Asn Ala Arg Asp Phe Tyr Arg Thr Asp Leu

210 215 220

Val Ile Phe Gly Leu Ile Val Tyr Ala Ser Leu Gly Leu Leu Ser Glu

225 230 235 240

Ala Leu Ile Arg Ala Trp Glu Arg His Thr Phe Arg Tyr Arg Asn Ala

245 250 255

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты. Способ включает культивирование генетически модифицированного микроорганизма в культуральной среде, содержащей тиосульфат, где микроорганизм содержит генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, где серосодержащая аминокислота или производное серосодержащей аминокислоты включает по меньшей мере одну(одно), выбранную(ое) из группы, состоящей из метионина, цистеина, цистина, лантионина, гомоцистеина, гомоцистина, гомолантионина и таурина. Изобретение позволяет получать серосодержащую аминокислоту или производное серосодержащей аминокислоты с высокой степенью эффективности. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 табл., 8 пр.

1. Способ продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты, включающий культивирование генетически модифицированного микроорганизма в культуральной среде, содержащей тиосульфат, где микроорганизм содержит генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, где серосодержащая аминокислота или производное серосодержащей аминокислоты включает по меньшей мере одну (одно), выбранную(ое) из группы, состоящей из метионина, цистеина, цистина, лантионина, гомоцистеина, гомоцистина, гомолантионина и таурина.

2. Способ по п. 1, где белок, кодируемый геном ssuABC, обладает активностью транспортера тиосульфата.

3. Способ по п. 1, где белок, кодируемый геном ssuABC, представляет собой комплекс белков SsuA, SsuB и SsuC, и микроорганизм обладает повышенной активностью по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белков SsuA, SsuB и SsuC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

4. Способ по п. 3, где белок SsuA содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43.

5. Способ по п. 3, где белок SsuB содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 44.

6. Способ по п. 3, где белок SsuC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 45.

7. Способ по п. 1, где микроорганизм представляет собой микроорганизм, принадлежащий роду Corynebacterium sp. или роду Escherichia sp.

8. Способ по п. 1, дополнительно включающий выделение серосодержащей аминокислоты и производного серосодержащей аминокислоты из микроорганизма или культуральной среды.

9. Способ по п. 1, где генетическая модификация для повышения активности белка достигается путем: 1) увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок, в клетке; 2) замены области регуляции экспрессии полинуклеотида, кодирующего белок, на последовательность с более высокой активностью; 3) модификации инициирующего кодона или 5′-UTR (5’-нетранслируемой области) полинуклеотида, кодирующего белок; 4) модификации нуклеотидной последовательности на хромосоме для повышения активности белка; 5) введения чужеродного полинуклеотида, обеспечивающего проявление активности белка, или кодон-оптимизированного варианта полинуклеотида, кодирующего белок, или 6) их комбинации.

10. Микроорганизм, продуцирующий серосодержащую аминокислоту и производное серосодержащей аминокислоты и содержащий генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, где серосодержащая аминокислота или производное серосодержащей аминокислоты включает по меньшей мере одну (одно), выбранную(ое) из группы, состоящей из метионина, цистеина, цистина, лантионина, гомоцистеина, гомоцистина, гомолантионина и таурина.

11. Микроорганизм по п. 10, где микроорганизм продуцирует серосодержащую аминокислоту или производное серосодержащей аминокислоты с использованием тиосульфата в качестве источника серы.

12. Микроорганизм по п. 10, где генетическая модификация для повышения активности белка достигается путем: 1) увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок, в клетке; 2) замены области регуляции экспрессии полинуклеотида, кодирующего белок, на последовательность с более высокой активностью; 3) модификации инициирующего кодона или 5′-UTR полинуклеотида, кодирующего белок; 4) модификации нуклеотидной последовательности на хромосоме для повышения активности белка; 5) введения чужеродного полинуклеотида, обеспечивающего проявление активности белка, или кодон-оптимизированного варианта полинуклеотида, кодирующего этот белок, или 6) их комбинации.

13. Композиция для продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты, содержащая микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, или его культуру; и тиосульфат, где серосодержащая аминокислота или производное серосодержащей аминокислоты включает по меньшей мере одну (одно), выбранную(ое) из группы, состоящей из метионина, цистеина, цистина, лантионина, гомоцистеина, гомоцистина, гомолантионина и таурина.

14. Применение микроорганизма, содержащего генетическую модификацию для повышения активности белка, кодируемого геном ssuABC, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, для продуцирования серосодержащей аминокислоты или производного серосодержащей аминокислоты, где серосодержащая аминокислота или производное серосодержащей аминокислоты включает по меньшей мере одну (одно), выбранную(ое) из группы, состоящей из метионина, цистеина, цистина, лантионина, гомоцистеина, гомоцистина, гомолантионина и таурина.