Микроорганизм, продуцирующий L-метионин, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, и способ получения L-метионина с использованием этого микроорганизма Российский патент 2024 года по МПК C12N15/77 C12N9/10 C12P13/12 

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-метионин, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, и способу получения L-метионина с использованием этого микроорганизма.

2. Уровень техники

L-метионин, одну из незаменимых аминокислот в организме, применяют в качестве корма, медицинского исходного вещества, такого как синтетическое исходное вещество для медицинских растворов, медицинских расходных материалов и так далее, и пищевой добавки. Метионин представляет собой важную аминокислоту, вовлеченную в реакцию переноса метальной группы в организме, и играющую роль в обеспечении серой.

В химическом синтезе метионина используют главным образом способ получения метионина в форме смеси L- и D-изомеров путем гидролиза 5-(β-метилмеркаптоэтил)гидантоина. Однако такой химический синтез приводит к получению смешанной формы из L- и D-изомеров.

Между тем, L-метионин также можно получать биологическим способом. Более конкретно, один способ получения L-метионина с использованием микроорганизмов заключается в получении метионина путем прямого сульфгидрилирования с использованием О-ацилгомосерина (О-ацетилгомосерина или О-сукцинилгомосерина) и сероводорода в качестве субстратов. Например, известно, что фермент, кодируемый геном metY у Corynebacterium, выполняет функцию прямого сульфгидрилирования. Другой способ получения L-метионина с помощью микроорганизмов заключается в получении метионина путем транссульфурации с использованием О-ацилгомосерина (О-ацетилгомосерина или O-сукцинилгомосерина) и цистеина в качестве субстратов. Например, известно что фермент, кодируемый геном metB у Corynebacterium, выполняет функцию транссульфурации. Однако, существуют недостатки, которые заключаются в том, что фермент, кодируемый metB, продуцирует много побочных продуктов, и ген metY получает ингибирование по типу обратной связи, и следовательно, его трудно применить для получения L-метионина в промышленном масштабе (Kromer JO et al., J Bacteriol 188(2):609-618, 2006; Yeom HJ et al., J Microbiol Biotechnol 14(2):373-378, 2004 и так далее).

Автор настоящего изобретения поставил задачу разработать белок, который может заменить указанный белок, и в результате обнаружил, что микроорганизм, в который введен белок, кодируемый геном metZ, продуцирует L-метионин с высоким выходом, тем самым выполняя настоящее изобретение.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения заключается в предоставлении микроорганизма, продуцирующего L-метионин, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ.

Задача настоящего изобретения также заключается в предоставлении способа получения L-метионина, включающего культивирование микроорганизма в среде, содержащей тиосульфат.

Задача настоящего изобретения также заключается в предоставлении композиции для получения L-метионина, содержащей этот микроорганизм и тиосульфат.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 представлено изображение плазмиды pDCM2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Далее настоящее изобретение описано более подробно. Между тем, каждое описание и воплощение, раскрытое в настоящем описании, также можно применить к другим описаниям и воплощениям. То есть, все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем описании, попадают в объем настоящего изобретения. Далее, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, раскрытым здесь ниже.

Далее, специалист в данной области техники понимает или способен определить с помощью только рутинных экспериментов множество воплощений, эквивалентных определенным воплощениям описания, раскрытым здесь. Далее, эти эквивалентные воплощения следует интерпретировать как попадающие в объем настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий L-метионин, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-метионина, включающий культивирование микроорганизма, продуцирующего L-метионин в среде, содержащей тиосульфат.

Как его используют здесь, термин "ген metZ" обозначает ген, кодирующий фермент, вовлеченный в сульфгидрацию с использованием ацилгомосерина в качестве субстрата.

Как его используют здесь, термин "ацилгомосерин" относится к соединению, в котором ацильная группа присоединена к гомосерину, и включает как сукцинилгомосерин, так и ацетилгомосерин. Например, ацилгомосерин может представлять собой О-сукцинилгомосерин или О-ацетилгомосерин, но не ограничиваясь ими.

Как его используют здесь, фермент, кодируемый геном metZ, может представлять собой сукцинилгомосерин-сульфгидрилазу, ацетилгомо серии-сульфгидрилазу или фермент, вовлеченный в сульфгидрацию с использованием О-сукцинилгомосерина в качестве субстрата, но не ограничиваясь ими.

Как его используют здесь, термин "сульфгидрация" можно использовать взаимозаменяемо с термином "сульфгидрилирование", и он относится к реакции, которая предоставляет сульфгидрильную группу (-SH) для определенной молекулы. В отношении задачи настоящего изобретения этот термин может относиться к реакции в процессе синтеза метионина, но не ограничиваясь этим. Фермент, вовлеченный в "сульфгидрацию" также можно называть "сульфгидрилазой", но не ограничиваясь этим.

При традиционном ферментировании метионина фермент, экспрессируемый геном metZ, использовали в следующих реакциях in vitro:

CH₃SH + O-ацетил-L-гомосерин => ацетат + метионин

CH₃SH + О-сукцинил-L-гомосерин => сукцинат + метионин

Другими словами, в способе получения метионина, включающем первую стадию получения предшественника метионина с использованием микроорганизма, и вторую стадию проведения ферментативной реакции in vitro путем добавления метилмеркаптана и метионин-конвертирующего фермента в ферментируемый раствор, содержащий предшественник метионина, фермент, экспрессируемый геном metZ, использовали в качестве метионин-конвертирующего фермента in vitro (смотрите US 2010-0184164 A1).

Между тем, при ферментировании метионина в микроорганизме рода Corynebacterium используют два пути сульфгидрации (этапы сульфгидрилирования) (Hwang BJ et al., J Bacteriol 184(5): 1277-1286, 2002). Один из них представляет собой превращение (9-ацетилгомосерина (ацетилгомосерин: АН) в цистатионин с помощью фермента, кодируемого геном metB. В этом случае цистеин используют в качестве источника серы. Другими словами, реакция, при которой происходит превращение ацилгомосерина и цистеина в качестве взаимодействующих соединений в цистатионин, носит название "транссульфурация", и фермент, вовлеченный в эту реакцию, носит название "транссульфураза". Другой путь представляет собой превращение О-ацетилгомосерина в гомоцистеин с помощью фермента, кодируемого геном metY. В этом случае в качестве источника серы используют неорганическое соединение серы, такое как сероводород и так далее. В этой реакции, в которой происходит превращение ацилгомосерина и сероводорода в качестве реагирующих веществ в гомоцистеин, не образуется цистатионин в качестве промежуточного соединения в процессе получения гомоцистеина, который является предшественником метионина, в отличие от описанной выше транссульфурации. Эту реакцию называют прямым сульфгидрилированием.

Другими словами, путь сульфгидрилирования может относиться к пути реакции, в которой ацилгомосерин превращается в другое соединение путем реакции с источником серы, и по большому счету может быть разделен на транссульфурацию и прямую сульфгидрацию.

Однако, у штаммов Corynebacterium оба фермента, вовлеченные в сульфгидрацию, имеют недостатки. Например, при использовании ацетилгомосерина и гомоцистеина белок, кодируемый геном metB, продуцирует побочный продукт гомолантионин дополнительно к цистатионину (Kromer JO et al., J Bacteriol 188(2):609-618, 2006). Далее, известно, что метионин ингибирует ген metY по типу обратной связи (Yeom HJ et al., J Microbiol Biotechnol 14(2):373-378, 2004).

Согласно настоящему изобретению чужеродный ген metZ вводят в штамм Corynebacterium для биологического получения метионина путем только одностадийной реакции, и показано, что введение гена metZ полезно применять при ферментировании метионина.

В пути синтеза метионина, в который вовлечен белок, кодируемый геном metZ по настоящему изобретению, образование побочных продуктов может быть уменьшено. Побочный продукт может представлять собой гомолантионин. Уменьшение образования побочных продуктов может относиться к уменьшению образования побочных продуктов по сравнению с образованием побочных продуктов у микроорганизма дикого типа или в пути синтеза, в который вовлечен белок, кодируемый геном metB, но не ограничиваясь этим.

Следовательно, микроорганизм по настоящему изобретению, в который введен чужеродный ген metZ, и способ получения метионина, включающий культивирование этого микроорганизма, могут демонстрировать уменьшение образования побочных продуктов по сравнению с микроорганизмом, продуцирующим метионин, в который не введен чужеродный ген metZ, и способом получения метионина с использованием этого микроорганизма. Белок, кодируемый геном metZ, по настоящему изобретению, может не регулироваться метионином по типу обратной связи.

Белок, кодируемый геном metZ, по настоящему изобретению представляет собой O-ацилгомосеринсульфгидрилазу, которая может использовать сероводород в качестве источника серы, и также является О-ацилгомосеринтранссульфуразой, которая в качестве источника серы может использовать цистеин. Более конкретно, белок может представлять собой O-ацетилгомосеринсульфгидрилазу, О-ацетилгомосеринтранссульфуразу, O-сукцинилгомосеринсульфгидрилазу или О-сукцинилгомосеринтранссульфуразу. Следовательно, белок, кодируемый геном metZ, по настоящему изобретению может представлять собой белок, обладающий активностью O-ацилгомосеринсульфгидрилазы, и в частности, он может представлять собой белок, обладающий одной или более чем одной активностью из О-ацетилгомосеринсульфгидрилазы, O-ацетилгомосеринтранссульфуразы, О-сукцинилгомосеринсульфгидрилазы и O-сукцинилгомосеринтранссульфуразы.

Например, чужеродный ген metZ по настоящему изобретению может представлять собой ген, имеющий происхождение из микроорганизмов, отличных от микроорганизма, продуцирующего L-метионин, в который введен этот ген, или может быть отличным от гена, исходно присутствующего в микроорганизме, продуцирующем L-метионин, в который введен этот ген. В частности, ген может представлять собой ген, называемый metZ, имеющий происхождение из Chromobacterium violaceum, Hyphomonas neptunium или Rhodobacter sphaeroides, но не ограничиваясь ими. Относительно задачи настоящего изобретения ген может включать любой ген без ограничения, при условии, что он может усиливать способность продуцировать L-метионин. Последовательность гена metZ доступна из известной базы данных GenBank от NCBI (the National Center for Biotechnology Information, Нацилнальный центр биотехнологической информации) и в качестве способа получения соответствующей последовательности применимы различные способы, известные в данной области техники.

В настоящем изобретении белок, кодируемый чужеродным metZ, может включать любую одну или более чем одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 60, 61 и 62; и аминокислотных последовательностей (полипептидных последовательностей), на 90% или более гомологичных или идентичных SEQ ID NO: 60, 61 и 62, но не ограничиваясь ими. Например, белок может включать полипептидную последовательность, на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 97,7%, 97,8%, 98%, 98,5%, 98,7%, 98,8%, 99%, 99,5%, 99,7%, 99,8% или менее чем на 100% гомологичную или идентичную любой полипептидной последовательности из SEQ ID NO: 60, 61 и 62. Например, белок может включать любую полипептидную последовательность из SEQ ID NO: 66-71 и последовательность, выбранную из полипептидных последовательностей, на 90% или более гомологичных SEQ ID NO: 66-71, но не ограничиваясь ими.

Ген metZ по настоящему изобретению может включать любую одну или более чем одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 63, 64 и 65; и полинуклеотидной последовательности, на 90% или более гомологичной или идентичной SEQ ID NO: 63, 64 и 65, но не ограничиваясь ими. Например, ген может включать любую одну или более чем одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, 64 и 65, и полинуклеотидную последовательность на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 97,7%, 97,8%, 98%, 98,5%, 98,7%, 98,8%, 99%, 99,5%, 99,7%, 99,8% или менее чем на 100% гомологичную или идентичную SEQ ID NO: 63, 64 и 65.

Как его используют здесь, термин "полинуклеотид" относится к цепи ДНК, имеющей заданную длину или длину более заданной, представляющий собой длинноцепочечный полимер из нуклеотидов, образованный путем соединения нуклеотидных мономеров ковалентными связями.

В настоящем изобретении при условии, что ген metZ включает полинуклеотид, кодирующий белок, кодируемый одной или более чем одной полинуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 63, 64 и 65, или полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий эффективность, соответствующую белку, имеющему одну или более чем одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60, 61 и 62, очевидно, что любой полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, в которой часть последовательности удалена, модифицирована, заменена или добавлена, также может попадать в объем настоящего изобретения.

Например, ген metZ может представлять собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую частичную замену, например, 1-20 аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 60, 61 и 62. В другом воплощении ген metZ может представлять собой последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую вставку последовательностей из 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или 11 или менее аминокислот перед аминокислотной последовательностью/после этой аминокислотной последовательности. Еще в одном воплощении ген metZ может представлять собой последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую все вышеописанные замены и вставки, но не ограничиваясь ими.

Далее, зонд, который может быть получен из известной нуклеотидной последовательности, например, полинуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, комплементарной полной полинуклеотидной последовательности или ее части в строгих условиях, также может быть включен без ограничения.

Другими словами, хотя в настоящем описании он описан как "полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность с определенным номером последовательности", "полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с определенным номером последовательности" или "полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность с определенным номером последовательности", очевидно, что любой полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, в которой часть последовательности вырезана, модифицирована, заменена, заменена консервативной заменой или добавлена, может быть включен в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает такой же активностью как полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, состоящей из полинуклеотида с определенным номером последовательности, или соответствующей активностью. Например, это может быть случай, где на N-конце и/или С-конце аминокислотной последовательности добавлена последовательность, которая не изменяет функцию белка, природная мутация, молчащая мутация или консервативная замена.

Как его используют здесь, термин "консервативная замена" относится к замене аминокислоты другой аминокислотой, имеющей похожие структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может происходить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатка.

Как его используют здесь, термин "гомология" или "идентичность" относится к степени родства между двумя данными нуклеотидными последовательностями, которая может быть выражена в процентах.

Термины "гомология" и "идентичность" часто можно использовать взаимозаменяемо друг с другом.

Гомологию или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов можно определить с помощью стандартных алгоритмов выравнивания и можно применять штраф за пропуск в последовательности, установленный по умолчанию в используемой программе. По существу, обычно ожидают, что гомологичные или идентичные последовательности гибридизуются по всей длине или по меньшей мере примерно на 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от полной длины последовательностей в умеренно строгих или очень строгих условиях. Также в гибридизующихся полинуклеотидах рассматривают полинуклеотиды, содержащие вырожденные кодоны вместо обычных кодонов.

Обладают ли две любые полинуклеотидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, можно определить с помощью известного компьютерного алгоритма, такого как программа "FASTA" согласно Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 с использованием параметров по умолчанию. Альтернативно, это можно определить с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), который выполняют с помощью программы "Needleman" пакета "EMBOSS" (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al.., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно определить с помощью "BLAST" или "ClustalW" от Национального центра биотехнологической информации (США).

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов можно определить путем сравнения информации о последовательностях с использованием, например, компьютерной программы "GAP", например как описано в Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как раскрыто в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Коротко, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность как величину, полученную путем деления числа одинаково выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных символов и 0 для не идентичных) и взвешенную матрицу сравнения от Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (альтернативно, матрицу замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 от EMBOSS); (2) штраф 3,0 за каждый пропуск и дополнительно штраф 0,10 за каждый символ в каждом пропуске (или штраф за открытие пропуска 10 и штраф за продление пропуска 0,5); и (3) отсутствие штрафа за окончание пропуска.

Далее, обладают ли две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью друг с другом, можно определить путем сравнения последовательностей в эксперименте с гибридизацией по Саузерну в строгих условиях как определено, и определенные подходящие условия гибридизации известны в данной области техники и могут быть определены способом, хорошо известным специалисту в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

Далее, в полинуклеотид по настоящему изобретению могут быть внесены различные модификации в кодирующей области при условии, что они не изменяют полипептидную последовательность вследствие вырожденности генетического кода или с учетом кодонов, предпочтительных для организма, в котором полинуклеотид должен экспрессироваться. Далее, зонд, который может быть получен из известной последовательности гена, например, любой полинуклеотидной последовательности, которая может гибридизоваться с последовательностью, комплементарной полной нуклеотидной последовательности или ее части в строгих условиях, и который может повышать продуктивность по L-метионину, в то же время не являясь последовательностью, в природе присутствующей в микроорганизме, в который вводят эту последовательность, может быть включен без ограничения. Термин "строгие условия" относится к условиям, обеспечивающим специфическую гибридизацию между полинуклеотидами. Такие условия специально описаны в различных литературных источниках (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) и хорошо известны в данной области техники. Например, строгие условия могут включать условия, в которых гены, обладающие высокой степенью гомологии или идентичности, составляющей 40% или выше, в частности, 70% или выше, 80% или выше, 85% или выше, 90% или выше, более конкретно 95% или выше, более конкретно 97% или выше, и особенно конкретно 99% или выше, гибридизуются друг с другом, и гены, обладающие более низкой степенью гомологии или идентичности, чем перечисленные выше значения гомологии или идентичности, не гибридизуются друг с другом, или обычные условия промывки для гибридизации по Саузерну, то есть, однократная промывка, в частности двукратная или трехкратная промывка при концентрации соли и температуре, соответствующей 60°С, 1×SSC, 0,1% SDS, в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS и более конкретно 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS.

Для гибридизации необходимо, чтобы два полинуклеотида имели комплементарные последовательности, хотя несоответствия между основаниями возможны в зависимости от строгости условий гибридизации. Термин "комплементарный" используют для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденозин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать выделенные полинуклеотидные фрагменты, комплементарные полной последовательности, а также полинуклеотидные последовательности по существу сходные с ними.

В частности, полинуклеотиды, обладающие гомологией или идентичностью, можно выявить с использованием условий гибридизации, включающих этап гибридизации при значении T_m 55°С в вышеописанных условиях. Далее, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничиваясь ими, и может быть подходящим образом отрегулировано специалистом в данной области техники в зависимости от его задач.

Подходящая степень строгости условий для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов, и эти переменные хорошо известны в данной области техники (смотрите Sambrook et al., выше, 9.50 9.51, 11.7-11.8).

Как его используют здесь, термин "введение белка" обозначает, что микроорганизм проявляет активность определенного белка, которой он изначально не обладал, или обозначает, что микроорганизм проявляет повышенную активность по сравнению с его собственной активностью или активностью этого белка до модификации. Например, это может означать введение определенного белка, введение в хромосому микроорганизма полинуклеотид а, кодирующего этот определенный белок, или введение в микроорганизм вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий этот определенный белок, что таким образом дает возможность проявления его активности. В настоящем изобретении введение белка также может быть выражено как повышение активности белка у микроорганизма, не обладающего определенной активностью белка.

Введение белка может быть выполнено путем введения чужеродного полинуклеотид а, кодирующего белок, проявляющий активность, идентичную/сходную с активностью вышеописанного белка, или путем введения кодон-оптимизированного варианта его полинуклеотида в клетку-хозяина. Любую чужеродную полинуклеотидную последовательность можно использовать без ограничения по ее происхождению или последовательности при условии, что она демонстрирует активность, идентичную/сходную с активностью вышеописанного белка. Далее, чужеродный полинуклеотид можно вводить в клетку-хозяина после оптимизации его кодонов таким образом, чтобы обеспечить оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине. Это введение можно проводить путем известного способа трансформации, подходящим образом выбранного специалистом в данной области техники, и белок может быть получен путем экспрессии введенного полинуклеотида в клетке-хозяине, и в результате его активность может быть увеличена.

Повышение активности введенного белка может быть выполнено путем:

1) увеличения числа внутриклеточных копий гена или полинуклеотида, кодирующего белок,

2) замены области регуляции экспрессии гена в хромосоме, кодирующей белок, на последовательность, обладающую высокой активностью,

3) модификации нуклеотидной последовательности стартового кодона или 5'-UTR (нетранслируемой)-области белка,

4) модификации нуклеотидной последовательности на хромосоме для повышения активности белка, или

5) комбинации этих способов, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "вектор" относится к ДНК-конструкции, содержащей целевую полинуклеотидную последовательность, функционально связанную с подходящей регуляторной последовательностью, так что целевой ген может быть введен в подходящего хозяина. Регуляторная последовательность включает промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания с рибосомой мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации подходящей клетки-хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина и сам может интегрироваться в геном хозяина. Например, целевой полинуклеотид в хромосоме может быть заменен на модифицированный полинуклеотид с помощью вектора для вставки в хромосому. Вставку полинуклеотида в хромосому можно выполнять с помощью любого способа, известного в данной области техники, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь этим.

Вектор по настоящему изобретению специально не ограничен, можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и так далее, и в качестве плазмидного вектора можно использовать векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и так далее. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и так далее.

Как его используют здесь, термин "трансформация" относится к процессу введения вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, что таким образом дает возможность экспрессии белка, кодируемого этим полинуклеотидом, в клетке-хозяине. При условии, что трансформирующий полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, не имеет значения, вставлен ли он в хромосому клетки-хозяина и локализован в ней или находится вне хромосомы, и оба случая могут быть включены. Дополнительно, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, терминатор транскрипции, домен связывания с рибосомой и терминатор трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Дополнительно, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как таковой и быть функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь этим.

Далее, как его используют здесь, термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между вышеописанной последовательностью гена и последовательностью промотора, которая инициирует транскрипцию и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению.

Способ трансформации вектором по настоящему изобретению включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку, и он может быть выполнен путем выбора подходящего стандартного способа, известного в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, способ может включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцию, полиэтиленгликолевый (PEG) метод, DEAE (диэтиламиноэтил)-декстрановый метод, катионно-липосомный метод, метод с ацетатом лития-DMSO (диметилсульфоксид) и так далее, но не ограничиваясь ими.

Микроорганизм по настоящему изобретению может включать микроорганизм дикого типа и микроорганизм, генетически модифицированный естественным путем или искусственно. Любой микроорганизм, в который введен или включен чужеродный ген metZ, как описано в настоящем изобретении, может быть включен без ограничения.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, продуцирующий L-метионин, включающий один или более чем один чужеродный ген metZ по настоящему изобретению; кодируемый им белок и вектор, включающий ген metZ.

Как его используют здесь, термин "микроорганизм, продуцирующий L-метионин" включает все микроорганизмы дикого типа или микроорганизмы, модифицированные естественным путем или искусственно, и он может представлять собой микроорганизм, в котором определенный механизм ослаблен или усилен вследствие вставки чужеродного гена или повышения либо инактивации активности эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, включающий генетическую модификацию для продукции желаемого L-метионина.

Микроорганизм, продуцирующий L-метионин, может представлять собой микроорганизм, включающий белок, кодируемый чужеродным геном metZ, по настоящему изобретению для получения повышенной способности продуцировать L-метионин по сравнению с родительским штаммом или немодифицированным микроорганизмом.

Как его используют здесь, термин "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" может относиться к самому штамму дикого типа или штамму природного типа, не исключая штамм, включающий мутацию, которая может произойти у микроорганизма естественным путем, или к штамму до изменения его признака, который изменен вследствие генетического изменения, вызванного природными или искусственными факторами. Термины "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "немодифицированный штамм", "штамм немодифицированного типа", "немодифицированный микроорганизм", "микроорганизм немодифицированного типа" или "референтный микроорганизм". Альтернативно, они могут обозначать микроорганизм, в котором уровни экспрессии генов, вовлеченных в путь биосинтеза L-метионина не регулируются, или микроорганизм, в который изначально отсутствующий ген metZ не введен.

Микроорганизм, продуцирующий L-метионин, по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-метионин вследствие повышения активности части белков в пути биосинтеза L-метионина или вследствие снижения активности части белков в пути расщепления L-метионина.

В частности, примеры белков или генов, экспрессию которых можно регулировать для усиления пути биосинтеза L-метионина или для ослабления/инактивации пути расщепления L-метионина, являются следующими: белки, репрезентативные гены, кодирующие эти белки, и репрезентативные номера ЕС описаны по порядку. Названия белков начинаются с заглавной буквы, и названия генов обозначены курсивом. Например, путь биосинтеза L-аминокислоты может быть усилен, или путь расщепления L-аминокислоты может быть ослаблен путем повышения активности части одного(одной) или более чем одного(одной) белка или системы, выбранного(ной) из: тиосульфат-сульфотрансферазы, такой как Rdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, NCgll369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCG12678, NCgl2890 и так далее; сульфитредуктазы, су si; транспортной системы тиосульфат/сульфат, cysPUWA (ЕС 3.6.3.25); 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфатредуктазы, cysH (ЕС 1.8.4.8); сульфитредуктазы, cysJI (ЕС 1.8.1.2); цистеинсинтазы A, cysK (ЕС 2.5.1.47); цистеинсинтазы В, cysM (ЕС 2.5.1.47); серинацетилтрансферазы, cysE (ЕС 2.3.1.30); системы расщепления глицина, gcvTHP-Ipd (ЕС 2.1.2.10, ЕС 1.4.4.2, ЕС 1.8.1.4); липоилсинтазы, lipA (ЕС 2.8.1.8); липоат-протеинлигазы, lipB (ЕС 2.3.1.181); фосфоглицератдегидрогеназы, serA (ЕС 1.1.1.95); 3-фосфосеринфосфатазы, serB (ЕС 3.1.3.3); 3-фосфосерин/фосфогидрокситреонин-амино трансферазы, serC (ЕС 2.6.1.52); серингидроксиметилтрансферазы, glyA (ЕС 2.1.2.1); аспартокиназы I (ЕС 2.7.2.4); гомосериндегидрогеназы I, thrA (ЕС 1.1.1.3); аспартаткиназы, lysC (ЕС 2.7.2.4); гомосериндегидрогеназы, horn (ЕС 1.1.1.3); гомосерин-О-ацетилтрансферазы, metX (ЕС 2.3.1.31); гомосерин-О-сукцинилтрансферазы, metA (ЕС 2.3.1.46); цистатионин-галша-синтазы, metB (ЕС 2.5.1.48); β-C-S-лиазы, aecD (ЕС 4.4.1.8, бета-лиазы); цистатионин-бета-лиазы, metC (ЕС 4.4.1.8); В12-независимой гомоцистеин-S-метилтрансферазы, metE (ЕС 2.1.1.14); метионинсинтазы, metH (ЕС 2.1.1.13); метилентетрагидрофолат-редуктазы, metF (ЕС 1.5.1.20); экспортера L-метионина BrnFE; экспортера валина YgaZH (В2682, В2683), ygaZH (B2682, B2683); экспортера YjeH, b4141; пиридиннуклеотид-трансгидрогеназы PntAB, pntAB (ЕС 1.6.1.2) и фосфоенолпируваткарбоксилазы, Рус (ЕС 4.1.1.31), или путем сверхэкспрессии полинуклеотидов, кодирующих эти белки. Альтернативно, активность одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из глюкозо-6-фосфат-изомеразы, pgi (ЕС 5.3.1.9); гомосеринкиназы, thrB (ЕС 2.7.1.39); S-аденозилметионин-синтазы, metK (ЕС 2.5.1.6); дигидродипиколинат-синтазы, dapA (ЕС 4.2.1.52); фосфоенолпируваткарбоксилазы, рек (ЕС 4.1.1.49); формилтетрагидрофолат-гидролазы, purU (ЕС 3.5.1.10); пируваткиназы I, pykF (ЕС 2.7.1.40); пируваткиназы II, pykA (ЕС 2.7.1.40); цистатионин-у-лиазы, cg3086 (ЕС 4.4.1.1); цистатионин-β-синтазы, cg2344 (ЕС 4.2.1.22); регуляторного белка Cg3031, cg3031; белка-репрессора биосинтеза метионина и цистеина McbR, mcbR; белка-репрессора транскрипции L-метионина (Met), metJ; транспортера L-метионина MetQNI, metQ, metN, metl; N-ацилтрансферазы, yncA; fnrS малой РНК (sRNA) и транспортера L-метионина, metP, может быть инактивирована или снижена, или экспрессия генов, кодирующих эти белки, может быть супрессирована или устранена.

В одном конкретном воплощении микроорганизм, продуцирующий L-метионин, по настоящему изобретению дополнительно к введению metZ может включать одну или более чем одну генетическую модификацию, выбранную из группы, состоящей из ослабления или инактивации активности цистатионин-гамма-синтазы; ослабления или инактивации активности O-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы; ослабления или инактивации активности белка-репрессора биосинтеза метионина-цистеина; повышения активности метионинсинтазы и повышения активности сульфитредуктазы. Альтернативно, генетическая модификация может включать одну или более чем одну модификацию, выбранную из группы, состоящей из делеции/игибирования экспрессии гена metB; делеции гена metY; делеции/игибирования экспрессии гена mcbR и усиления экспрессии генов metH и cysI. Например, ген metB, ген metY, ген mcbR, ген metH и ген cysI могут включать полинуклеотидную последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичную или идентичную полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40, соответственно, но не ограничиваясь ими. Вышеприведенное описание, касающееся гомологии или идентичности, также применимо к генам metB, metY, mcbR, metH и cysI.

Однако эти гены приведены только в качестве примера, и гены не ограничены ими, и микроорганизм может представлять собой микроорганизм, в котором активность различных известных белков пути биосинтеза L-метионина повышена или активность белков пути расщепления L-метионина инактивирована или снижена.

Как его используют здесь, термин "повышение" активности полипептида или белка обозначает увеличение активности полипептида или белка по сравнению с его собственной активностью. Термин "повышение" можно использовать взаимозаменяемо с термином "повышающая регуляция", "сверхэкспрессия", "увеличение" и так далее. Здесь, "увеличение" может включать как проявление изначально отсутствующей активности, так и проявление улучшенной активности, по сравнению с собственной активностью или активностью до модификации. Термин "собственная активность" обозначает активность определенного полипептида или белка, изначально присутствующего у родительского штамма до трансформации или у немодифицированного микроорганизма, когда признак изменен вследствие генетической модификации, вызванной природным или искусственным фактором. Этот термин можно использовать взаимозаменяемо с термином "активность до модификации". Выражение "активность полипептида или белка повышена или увеличена по сравнению с собственной активностью" обозначает, что активность улучшена по сравнению с активностью определенного полипептида или белка, изначально присутствующей у родительского штамма до трансформации или у немодифицированного микроорганизма. "Увеличение активности" может быть достигнуто путем введения чужеродного полипептида или белка или путем повышения активности собственного полипептида или белка, в частности, путем повышения активности собственного полипептида или белка. Повышена ли активность полипептида или белка, можно определить по степени активности соответствующего полипептида или белка, уровню его экспрессии или увеличению количества продукта соответствующего белка.

В данной области техники хорошо известны различные способы, которые можно применять для повышения активности полипептида или белка, и способ не ограничен при условии, что он может повышать активность желаемого полипептида или белка по сравнению с таковой у микроорганизма до модификации. Способ может представлять собой способ использования генетической инженерии и/или белковой инженерии, хорошо известный специалисту в данной области техники, представляющий собой рутинный способ молекулярной биологии (Sitnicka et al. "Functional Analysis of Genes". Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16; Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и так далее), но не ограничиваясь этим.

Такой способ повышения активности полипептида или белка с использованием генетической инженерии может быть выполнен, например, с помощью:

1) способа увеличения числа внутриклеточных копий гена или полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок;

2) способа замены области регуляции экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид или белок, на последовательность, имеющую высокую активность,

3) способа модификации нуклеотидной последовательности стартового кодона или области 5'-UTR полипептида или белка,

4) способа модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для увеличения активности полипептида или белка,

5) способа введения чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность полипептида или белка, или введения варианта полинуклеотида, полученного путем оптимизации кодонов полинуклеотида, или

6) комбинации этих способов, но не ограничиваясь этим.

Способ повышения активности полипептида или белка с использованием белковой инженерии может быть выполнен, например, с помощью способа анализа третичной структуры полипептида или белка, выбора его экспонированного участка и затем изменения или химической модификации этого участка, но не ограничиваясь этим.

1) Способ увеличения числа внутриклеточных копий гена или полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения в клетку-хозяин а вектора, функционально связанного с геном или полинуклеотидом, кодирующим соответствующий полипептид или белок, и обладающего способностью реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина. Альтернативно, он может быть выполнен путем введения в клетку-хозяина вектора, функционально связанного с геном и обладающего способностью вставлять ген или полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, но не ограничиваясь этим. Вектор является таким же, как описано выше.

2) Способ замены области регуляции экспрессии гена (или последовательности регуляции экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид или белок, на последовательность, имеющую высокую активность, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения мутации в последовательность путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в нуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного повышения активности области регуляции экспрессии или путем замены последовательности на нуклеотидную последовательность, имеющую более высокую активность. Область регуляции экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и так далее, но специально не ограничиваясь этим. Этим способом можно специфически присоединять сильный гетерологичный промотор вместо исходного промотора, но не ограничиваясь этим.

Примеры известных сильных промоторов могут включать промоторы cj1 - cj7 (Патент США No. 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор фага лямбда PR, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13(sm3) (Патент США No. 10584338 В2), промотор O2 (Патент США No. 10273491 В2), промотор tkt, промотор уссА и так далее, но не ограничиваясь ими.

3) Способ модификации нуклеотидной последовательности стартового кодона или области 5'-UTR полипептида или белка может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем замены собственного стартового кодона полипептида или белка на другой стартовый кодон, обеспечивающий более высокий уровень экспрессии полипептида или белка, чем собственный стартовый кодон, но не ограничиваясь этим.

4) Способ модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для увеличения активности полипептида или белка может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем индуцирования мутации в последовательности регуляции экспрессии путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены нуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного повышения активности полинуклеотидной последовательности или путем замены последовательности на полинуклеотидную последовательность, которая улучшена так, чтобы иметь более высокую активность. Замена может представлять собой специфическую вставку гена в хромосому путем гомологичной рекомбинации, но не ограничиваясь этим.

Вектор, который можно использовать здесь, может дополнительно включать селективный маркер для идентификации вставки в хромосому. Селективный маркер является таким же как описано выше.

5) Способ введения чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность полипептида или белка, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, проявляющий активность, идентичную/похожую на таковую полипептида или белка, или кодон-оптимизированного варианта его полинуклеотида. Любой чужеродный полинуклеотид можно использовать без ограничения по его происхождению или последовательности при условии, что он проявляет активность, идентичную/похожую на таковую полипептида или белка. Далее чужеродный полинуклеотид можно вводить в клетку-хозяина после оптимизации кодонов, так чтобы происходила его оптимизированная транскрипция и трансляция в клетке-хозяине. Введение может быть выполнено известным способом трансформации, подходящим образом выбранным специалистом в данной области техники, и полинуклеотид, введенный в клетку-хозяина, экспрессируется с получением полипептида или белка, и в результате его активность может быть повышена.

Наконец, (6) может быть выполнена комбинация способов путем применения любого одного или более чем одного способа из (1)-(5).

Такое повышение активности полипептида или белка может представлять собой увеличение активности или концентрации соответствующего полипептида или белка относительно активности или концентрации полипептида или белка, экспрессируемого в штамме дикого типа или штамме микроорганизма до модификации, или увеличение количества продукта, полученного из соответствующего полипептида или белка, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "инактивация" или "ослабление" активности полипептида или белка обозначает понятие, включающее все случаи, когда активность уменьшена, или активность отсутствует, по сравнению с собственной активностью. Термины "инактивация" или "ослабление" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "понижающая регуляция", "уменьшение", "снижение" и так далее. Понятия "инактивация" или "ослабление" также могут включать случай, когда активность самого белка снижена или устранена вследствие мутации в гене, кодирующем белок, и так далее, по сравнению с активностью белка, изначально присутствующей у микроорганизма, случай, когда общий уровень внутриклеточной активности белка ниже, чем таковой у нативного штамма вследствие ингибирования экспрессии или ингибирования трансляции гена, кодирующего этот белок, случай, когда ген совсем не экспрессируется, и случай, когда белок не проявляет активность, несмотря на то, что экспрессируется. Термин "собственная активность" обозначает активность определенного полипептида или белка, изначально присущую родительскому штамму до трансформации или немодифицированному микроорганизму, когда признак изменен вследствие генетической модификации, вызванной природным или искусственным фактором. Этот термин можно использовать взаимозаменяемо с термином "активность до модификации". Выражение "активность полипептида или белка снижена по сравнению с собственной активностью" обозначает, что активность снижена по сравнению с активностью определенного полипептида или белка, изначально присущей родительскому штамму до трансформации или немодифицированному организму.

Инактивация или ослабление активности белка может быть достигнута(то) различными способами, хорошо известными в данной области техники (Nakashima N et at, "Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing". Int J Mol Sci. 2014; 15(2):2773-2793; Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и так далее), но не ограничиваясь ими.

Примеры способа могут включать:

1) способ делетирования всего гена, кодирующего белок, или его части;

2) способ модификации области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии), с тем чтобы уменьшить экспрессию гена, кодирующего белок;

3) способ модификации последовательности гена, кодирующей белок, с тем чтобы устранить или ослабить активность белка;

4) способ введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего белок;

5) способ добавления последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, выше по ходу транскрипции от последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего белок, для образования вторичной структуры, что таким образом ингибирует присоединение рибосомы; и

6) способ с использованием технологии обратной транскрипции (RTE) с добавлением промотора на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок, с тем чтобы обеспечить обратную транскрипцию этого гена; и способ может быть выполнен путем их комбинирования, но специально не ограничиваясь этим.

В частности, способ делетирования всего гена, кодирующего белок, или его части может быть выполнен путем замены полинуклеотида, кодирующего желаемый эндогенный белок в хромосоме, на полинуклеотид, имеющий частичную делецию нуклеотидной последовательности или маркерный ген, с помощью вектора для вставки в хромосому микроорганизма. Этот способ делетирования всего полинуклеотида или его части может быть выполнен, например, с помощью способа делетирования полинуклеотида путем гомологичной рекомбинации, но не ограничиваясь этим.

Далее, способ делетирования всего гена или его части может быть выполнен путем индуцирования мутации с использованием излучения, такого как УФ (ультрафиолет), или химического соединения с последующим отбором штамма с делецией целевого гена среди полученных мутантов. Способ делетирования гена включает способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Технологию рекомбинантной ДНК можно применять, например, путем введения нуклеотидной последовательности или вектора, включающего нуклеотидную последовательность, обладающую гомологией с целевым геном, в микроорганизм для индукции гомологичной рекомбинации. Дополнительно, нуклеотидная последовательность или вектор, подлежащая(щий) введению, может включать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь этим.

Дополнительно, способ модификации последовательности регуляции экспрессии может быть выполнен путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники. Примеры способа могут быть выполнены путем индукции мутации в области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в полинуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного снижения активности области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) или путем замены последовательности на полинуклеотидную последовательность, имеющую более низкую активность. Область регуляции экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и так далее, но не ограничиваясь этим.

Дополнительно, способ модификации последовательности гена может быть выполнен путем индукции мутации в последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в последовательности гена или их комбинации для дополнительного снижения активности полипептида или путем замены последовательности на последовательность гена, улучшенную так, чтобы снизить активность, или на последовательность гена, улучшенную так, чтобы устранить активность, но не ограничиваясь этим.

Например, экспрессия гена может быть супрессирована или ослаблена путем введения мутации в последовательность гена для образования стоп-кодона.

Однако вышеописанный способ приведен только для примера, и способы повышения или инактивации активности белка и способы управления генами известны в данной области техники и, следовательно, микроорганизм, продуцирующий L-метионин, может быть получен путем применения различных известных способов.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium.

В настоящем изобретении термин "микроорганизм рода Corynebacterium" может включать любые микроорганизмы рода Corynebacterium, в частности, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens и более конкретно Corynebacterium glutamicum.

Среда и другие условия культивирования, используемые для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, могут представлять собой любую среду, обычно используемую для культивирования микроорганизмов рода Corynebacterium, без какого-либо специального ограничения. В частности, микроорганизм по настоящему изобретению можно культивировать в аэробных или анаэробных условиях в обычной среде, содержащей подходящий источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамин и так далее, при регулировании температуры, рН и так далее.

В настоящем изобретении источник углерода может включать углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и так далее; сахарные спирты, такие как маннит, сорбит и так далее; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота, лимонная кислота и так далее; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, лизин и так далее. Дополнительно можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, меласса, сырая меласса, рисовые отруби, маниока, меласса сахарного тростника, жидкий кукурузный экстракт и так далее, и в частности, можно использовать такие углеводы как глюкоза, стерилизованная предварительно обработанная меласса (то есть меласса, превращенная в редуцирующий сахар). Дополнительно подходящее количество различных других источников углерода можно использовать без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более чем двух из них, но не ограничиваясь этим.

Источник азота может включать неорганические источника азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и так далее; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, глутамин и так далее; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее переработки, обезжиренный соевый жмых или продукты его переработки и так далее. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более чем двух из них, но не ограничиваясь этим.

Источник фосфора может включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрийс о держащие соли и так далее. Неорганическое соединение может включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и так далее.

Источник серы может включать алкансульфонат, такой как метансульфонат и этансульфонат, органические и неорганические серосодержащие соединения, такие как сульфат, сульфит, сероводород, такой как H₂S, сульфид, производные сульфида, смесь органического и неорганического серосодержащего соединения и тиосульфата, такого как тиогликолят, тиоцианат и/или тиомочевина, либо источник серы может не включать другие вещества, кроме тиосульфата, но не ограничиваясь этим.

Способ получения L-метионина по настоящему изобретению может включать культивирование микроорганизма в среде, содержащей тиосульфат. В частности, микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, содержащий чужеродный metZ и использующий тиосульфат в качестве источника серы. Тиосульфат можно использовать в качестве источника серы для микроорганизма, но не ограничиваясь этим.

В качестве неорганического соединения можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, карбонат кальция и так далее. Дополнительно среда может включать витамины и/или подходящие предшественники и так далее. Среду или предшественник можно добавлять в культуральную среду периодическим или непрерывным способом, но не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении рН культуральной среды можно регулировать во время культивирования микроорганизма путем добавления в культуральную среду подходящим образом такого соединения как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота и так далее. Далее во время культивирования может быть добавлен пеногаситель, такой как полигликоле вый сложный эфир жирной кислоты, для предупреждения образования пены. Дополнительно, кислород или кислородсодержащий газ можно вводить в культуральную среду для поддержания аэробного состояния культуральной среды; или можно не вводить газ, или можно вводить азот, водород или углекислый газ в культуральную среду для поддержания анаэробного или микро аэробно го состояния, но не ограничиваясь этим.

Температура культуральной среды может составлять 25°С-40°С, и более конкретно, 28°С-37°С, но не ограничиваясь этим. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества полезных веществ и, в частности, в течение от 1 часа до 100 часов, но не ограничиваясь этим.

Способ получения метионина по настоящему раскрытию может включать выделение L-метионина из микроорганизма или среды.

Целевые серосодержащие аминокислоты или производные серосодержащих аминокислот можно выделять из среды подходящим способом, известным в данной области техники, в соответствии со способом культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например, периодическим, непрерывным способом культивирования или периодическим способом культивирования с подпиткой. Например, такие способы как центрифугирование, фильтрование, обработка осадителем, вызывающим кристаллизацию белка (способ высаливания), экстракция, обработка ультразвуком, ультрафильтрация, диализ, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и так далее, и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) можно использовать по отдельности или в комбинации, но способы не ограничены этим.

Способ может включать дополнительный процесс очистки. В процессе очистки можно использовать подходящий способ очистки, известный в данной области техники.

Еще в одном аспекте настоящего раскрытия предложена композиция для получения L-метионина, включающая микроорганизм и тиосульфат.

Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно включать любые подходящие эксципиенты, обычно используемые в композициях для получения L-метионина, и эти эксципиенты могут включать, например, консерванты, увлажняющие вещества, диспергирующие вещества, суспендирующие вещества, буферные вещества, стабилизирующие вещества, изотонические вещества и так далее, но не ограничиваясь ими.

Еще в одном аспекте настоящего раскрытия предложен способ получения микроорганизма, продуцирующего L-метионин, включающий стадию введения в микроорганизм белка, кодируемого чужеродным геном metZ.

Еще в одном аспекте настоящего раскрытия предложено применение микроорганизма, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, для продуцирования L-метионина.

Микроорганизм, чужеродный ген metZ, и кодируемый им белок, и введение этого белка являются такими как описано выше.

Здесь и далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры воплощений. Однако эти примеры воплощений предназначены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены никаким образом ограничивать объем настоящего изобретения.

Референсный Пример 1: Получение плазмиды

Плазмида (pDCM2, Фиг. 1, SEQ ID NO: 81) была сконструирована для вставки и замены гена в хромосоме Corynebacterium, и плазмиду синтезировали с использованием сервиса синтеза генов от Bionics Со. Плазмида была сконструирована так, чтобы включать сайт рестрикции, который легко использовать для клонирования, со ссылкой на статью, в которой рассматривается общеизвестная система sacB (Gene, 145 (1994) 69-73). Синтезированная таким образом плазмида pDCM2 имела следующие характеристики:

1) способность к саморепликации в Е. coli, но отсутствие способности к саморепликации в Corynebacterium вследствие наличия ориджина репликации, который работает только в Е. coli;

2) наличие в плазмиде pDCM2 гена устойчивости к канамицину в качестве селективного маркера;

3) наличие в плазмиде pDCM2 гена левансахаразы (sacB) в качестве вторичного положительного селективного маркера; и

4) плазмида pDCM2 не оставляет никакой генетической информации, имеющей происхождение из нее, в конечном полученном штамме.

Пример 1: Получение рекомбинантного вектора для делеции гена mcbR

В этом примере для получения штамма, продуцирующего метионин, для получения вектора для инактивации mcbR, кодирующего ранее раскрытый белок-репрессор биосинтеза метионина-цистеина (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003), использовали штамм АТСС13032 дикого типа.

Более подробно, для делетирования гена mcbR из хромосомы Corynebacterium АТСС13032 был получен рекомбинантный плазмидный вектор следующим способом. На основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в GenBank от Национального института здравоохранения США (NIH), был получен ген mcbR и окружающая его последовательность (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum.

Для получения делетированного гена mcbR проводили ПЦР на матрице хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 с использованием праймеров SEQ ID NO: 2 и 3 и SEQ ID NO: 4 и 5 (Таблица 1).

ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК 700 п.н., соответственно.

Вектор pDCM2, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты гена mcbR обрабатывали рестриктазой smal для введения в хромосому. После реакции клонирования изотермической сборкой продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB (лизогенная среда), содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставкой делетированных фрагментов целевых генов, отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид была получена плазмида, затем получившая название pDCM2-AmcbR.

Пример 2: Получение и культивирование штамма с делецией гена mcbR

Штамм АТСС13032 трансформировали путем гомологичной рекомбинации на хромосоме с помощью вектора pDC-AmcbR, полученного в Примере 1, путем электропорации (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). После этого проводили вторичную рекомбинацию на твердой среде, содержащей сахарозу. Трансформированный штамм Corynebacterium glutamicum, в котором была завершена вторичная рекомбинация, подвергали ПЦР с использованием SEQ ID NO: 6 и 7 (Таблица 2) для идентификации штамма с делецией гена mcbR. Этот рекомбинантный штамм получил название Corynebacterium glutamicum СМ02-0618.

Этот штамм СМ02-0618 был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов, международном депозитарии, 4 января 2019 года, в соответствии с положениями Будапештского договора и присвоением номера доступа No. KCCM12425P.

Для анализа способности полученного штамма СМ02-0618 продуцировать L-метионин штамм культивировали вместе с его родительским штаммом, штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС13032, следующим образом.

Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 и Corynebacterium glutamicum СМ02-0618 по настоящему раскрытию инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 25 мл среды, описанной далее, соответственно, и затем культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 20 часов. После этого 1 мл посевной культуральной среды инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 24 мл продукционной среды, и затем культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Состав посевной среды и продукционной среды является следующим. В продукционной среде (NH₄)₂S₂O₃, представляющий собой тип тиосульфата, использовали в качестве источника серы.

<Посевная среда (рН 7,0)>

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды).

<Продукционная среда (рН 8,0)>

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃, 1 мкг цианокобаламина (Витамина В12) (на основе 1 л дистиллированной воды).

После культивирования вышеописанным способом анализировали концентрацию L-метионина в культуральной среде, и она представлена в Таблице 3 ниже.

В результате в штамме, из которого был удален только mcbR, наблюдали продукцию L-метионина.

Пример 3-1: Получение векторов для введения трех чужеродных генов metZ

Была сделана попытка преодолеть недостатки существующего способа биосинтеза метионина при одновременном повышении продукции метионина путем введения чужеродного metZ в штамм Corynebacterium. Более подробно, были получены векторы для введения metZ, полученные из Chromobacterium violaceum, Hyphomonas neptunium, Rhodobacter sphaeroides.

Более подробно, рекомбинантные плазмидные векторы для дополнительной вставки каждого из трех типов чужеродных генов metZ в хромосому Corynebacterium АТСС13032 были получены следующими способами.

Сначала для вставки metZ был получен вектор для удаления Ncgl1021 (транспозаза). На основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в GenBank от Национального института здравоохранения США (NIH), были получены Ncgl1021 и окружающая его последовательность (SEQ ID NO: 8) из Corynebacterium glutamicum. Для получения делетированного гена Ncgl1021 проводили ПЦР на матрице хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и 10 и SEQ ID NO: 11 и 12 (Таблица 4).

ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены соответствующие фрагменты ДНК. Вектор pDCM2, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты гена Ncgl1021 обрабатывали рестриктазой smal для введения в хромосому. После реакции клонирования изотермической сборкой продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставкой делетированных фрагментов целевых генов, отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид была получена плазмида, затем получившая название pDCM2-ANcgl1021.

Для получения генов metZ (имеющих происхождение из Chromobacterium violaceum, Hyphomonas neptunium и Rhodobacter sphaeroides) проводили ПЦР на хромосомной ДНК каждого из Chromobacterium violaceum, Hyphomonas neptunium и Rhodobacter sphaeroides в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID NO: 13 и 14, SEQ ID NO: 15 и 16 и SEQ ID NO: 17 и 18. Для экспрессии трех типов генов metZ, соответственно, использовали промотор Pspl1, и Pspl1 подвергали ПЦР с использованием ранее раскрытой векторной ДНК spll-GFP (KR 10-1783170 В1) в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 19 и 20, SEQ ID NO: 19 и 21, SEQ ID NO: 19 и 22 (Таблица 5). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут.

В результате были получены три типа чужеродных генных фрагментов metZ (SEQ ID NO: 63 - 65) и соответствующие промоторные фрагменты spl1 для экспрессии трех типов генов metZ, соответственно. Вектор pDCM2-ΔNcgl1021, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали рестриктазой scaI. После реакции клонирования изотермической сборкой амплифицированных промоторных фрагментов spll с фрагментами metZ в соответствии с каждым штаммом, каждым продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставкой целевого гена, отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид были получены в общей сложности три типа плазмид, затем получившие названия pDCM2-ΔNcgl1021-PsplCvimetZ (Chromobacterium violaceum metZ), pDCM2-ΔNcgl1021-PsplHnemetZ (Hyphomonas neptunium metZ) и pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ (Rhodobacter sphaeroides metZ), соответственно.

Пример 3-2: Получение вектора для введения гена metZ

Дополнительно были получены векторы для последовательностей ранее известных шести генов metZ, имеющих происхождение из Rhodobacter sphaeroides. Таким же способом как в Примере 3-1 (смотрите US 2013-0273614 A1 и US 2018-0355389 A1), были получены векторы с генами metZ, каждый из которых кодирует аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 66-71, соответственно. Гены metZ получили названия RspmetZ_long, RspmetZ_3, RspmetZ_65, RspmetZ_104, RspmetZ_196 и RspmetZ_3_65_104, соответственно, и праймеры, используемые для введения каждого гена, были следующими.

Сначала, для получения RspmetZlong проводили ПЦР на матрице хромосомной ДНК Rhodobacter sphaeroides с использованием праймеров SEQ ID NO: 19 и 22 и SEQ ID NO: 72 и 18.

В результате были получены генный фрагмент и промоторный фрагмент spl1.

Вектор pDCM2-ΔNcgl1021, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали рестриктазой scaI. После реакции клонирования изотермической сборкой амплифицированных промоторных фрагментов spl1 с фрагментами metZ в соответствии с каждым штаммом, каждым продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставкой целевого гена, отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид была получена плазмида, затем получившая название pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_long.

Для получения RspmetZ_3, RspmetZ_65, RspmetZ_104, RspmetZ_196 и RspmetZ_3_65_104 проводили ПЦР на матрице вектора pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ long с использованием SEQ ID NO: 72 и 73, 74 и 18 (RspmetZ_3), SEQ ID NO: 72 и 75, 76 и 18 (RspmetZ_65), SEQ ID NO: 72 и 77, 78 и 18 (RspmetZ_104), SEQ ID NO: 71 и 79, 80 и 18 (RspmetZ 196), SEQ ID NO: 72 и 73, 74 и 75, 76 и 77, 77 и 18 (RspmetZ_3_65 104). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут.

В результате было получено в общей сложности десять фрагментов.

Вектор pDCM2-ΔNcgl1021, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали рестриктазой scaI. После реакции клонирования изотермической сборкой RspmetZ_3 и фрагмента 1, фрагмента 2, RspmetZ_65 и фрагмента 3, фрагмента 4, RspmetZ_104 и фрагмента 5, фрагмента 6, RspmetZ_196 и фрагмента 7, фрагмента 8, RspmetZ_3_65_104 и фрагмента 1, фрагмента 11, фрагмента 12, фрагмента 6, затем каждым продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставкой целевого гена отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид были получены в общей сложности шесть типов плазмид, затем получивших названия pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_long, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_3, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_65, PDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_104, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_196, PDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_3_65_104, соответственно.

Пример 4: Получение и культивирование штамма с введенным чужеродным metZ

Девять типов чужеродных генов metZ были введены в штамм СМ02-0618, представляющий собой штамм, продуцирующий метионин, полученный в Примере 2, соответственно.

Более подробно, штаммом СМ02-0618, представляющим собой штамм, продуцирующий метионин, полученный в Примере 2, трансформировали путем гомологичной рекомбинации на хромосоме векторами pDCM2-ANcgl1021, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplCvimetZ, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplHnemetZ, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_long, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_3, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_65, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_104, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_196 и pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_3_65_104, полученными в Примере 3 путем электропорации, соответственно (van der Rest et al., ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545, 1999).

После этого проводили вторичную рекомбинацию на твердой среде, содержащей сахарозу. Трансформированный штамм Corynebacterium glutamicum, в котором была завершена вторичная рекомбинация, подвергали ПЦР с использованием SEQ ID NO: 23 и 24 для выявления штамма с делецией гена Ncgl1021 и штамма с делецией Ncgl1021 и вставкой metZ. Рекомбинантные штаммы, каждый из которых получен путем введения одного из девяти типов векторов в СМ02-0618, получили названия CM02-0618/ANcgl021 и СМ02-0757, СМ02-0758, СМ02-0759-1, СМ02-0759-2, СМ02-0759-3, СМ02-0759-4, СМ02-0759-5 и СМ02-0759, соответственно.

Для изучения способности полученных штаммов продуцировать L-метионин каждый штамм культивировали вместе с их родительским штаммом СМ02-0618 следующим образом.

Каждый из штаммов инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 25 мл описанной ниже среды, и затем культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 20 часов. После этого 1 мл посевной культуральной среды инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 24 мл продукционной среды, и затем культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Состав посевной среды и продукционной среды является следующим.

<Посевная среда (рН 7,0)>

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды)

<Продукционная среда (рН 8,0)>

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃, 1 мкг кобаламина (Витамина В12) (на основе 1 л дистиллированной воды).

Далее, для сравнения с источником серы, используемым существующим метионин-превращающим ферментом, источник серы, используемый в продукционной среде, был заменен с тиосульфата (S₂O₃) на метилмеркаптан (CH₃SH), и штаммы культивировали таким же образом. После завершения культивирования каждого штамма измеряли концентрацию L-метионина в каждой культуральной среде, и результаты представлены в Таблице 8.

В результате при введении девяти типов генов metZ, соответственно, продуктивность по L-метионину повышалась на 266% или более по сравнению с контрольным штаммом, показывая, что чужеродный metZ по настоящему раскрытию значительно повышает продуктивность по L-метионину путем сульфгидрилирования, и в частности, эффективность является высокой по сравнению с таковой при использовании метилмеркаптана в качестве источника серы в существующем способе. Это можно объяснить так, что в отличие от metB и metY Corynebacterium glutamicum, чужеродный metZ по настоящему раскрытию не претерпевал ингибирования по типу обратной связи, и таким образом выход метионина увеличился.

Штаммы СМ02-0757, СМ02-0758 и СМ02-0759 депонировали в Корейском центре культур микроорганизмов, международном депозитарии, 2 мая 2019 года в соответствии с положениями Будапештского договора и присвоением номеров доступа No. KCCM12506P, KCCM12507P, KCCM12508P, соответственно.

Пример 5: Получение рекомбинантного вектора для делеции генов metB и metY

Для изучения функции (активности) белка, кодируемого metZ, по настоящему раскрытию и для сравнения его активности с активностью metY и metB, metB и metY, присутствующие у Corynebacterium glutamicum, были делетированы, соответственно. Более подробно, для делетирования генов metB и metY, соответственно, следующим способом были получены рекомбинантные плазмидные векторы. На основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в GenBank от Национального института здоравоохранения США (NIH), были получены гены metB и metY и окружающие их последовательности (SEQ ID NO: 25 и 26) из Corynebacterium glutamicum.

Для осуществления делетирования генов metB и metY, соответственно, проводили ПЦР с хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID NO: 27 и 28 и SEQ ID NO: 29 и 30 (metB) и праймеров SEQ ID NO: 31 и 32 и SEQ ID NO: 33 и 34 (metY) (Таблица 9).

ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК 700 п.н., соответственно.

Вектор pDCM2, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные фрагменты генов metB и metY обрабатывали рестриктазой smaI для введения в хромосому, соответственно. После лигирования с помощью ДНК-лигазы затем продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные каждым вектором со вставками делетированных фрагментов целевого гена, отбирали путем ПЦР, и каждую плазмиду получали методом выделения плазмид, и затем полученные плазмиды получили названия pDCM2-ΔmetB и pDCM2-ΔmetY, соответственно.

Пример 6: Получение штаммов с делецией генов metB или metY из трех типов штаммов с усиленным metZ и культивирование полученных штаммов

Штаммы СМ02-0618, СМ02-0757, СМ02-0758 и СМ02-0759 трансформировали путем гомологичной рекомбинации на хромосоме векторами pDCM2-ΔmetB и pDCM2-ΔmetY, полученными, как описано выше, путем электропорации, соответственно (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем проводили вторичную рекомбинацию на твердой среде, содержащей сахарозу. Трансформированные штаммы Corynebacterium glutamicum, в которых вторичная рекомбинация была завершена, исследовали на наличие делеции генов metB и metY с использованием SEQ ID NO: 35 и 36 (metB) и SEQ ID NO: 37 и 38 (metY) (Таблица 10), соответственно.

Эти рекомбинантные штаммы получили названия Corynebacterium glutamicum CM02-0618/ΔmetB CM02-0757/ΔmetB, CM02-0758/ΔmetB, CM02-0759/ΔmetB, CM02-0618/ΔmetY, CM02-0757/ΔmetY, CM02-0758/ΔmetY, CM02-0759/ΔmetY, соответственно.

Для анализа способности полученных штаммов CM02-0618/ΔmetB, СМ02-0757/ ΔmetB, CM02-0758/ΔmetB, CM02-0759/ΔmetB, CM02-0618/ΔmetY, CM02-0757/ΔmetY, CM02-0758/ΔmetY и CM02-0759/ΔmetY продуцировать L-метионин их культивировали следующим способом, соответственно.

СМ02-0618, СМ02-0757, СМ02-0758 и СМ02-0759 в качестве родительских штаммов и CM02-0618/ΔmetB, СМ02-0757/ ΔmetB, CM02-0758/ΔmetB, СМ02-0759/ ΔmetB, CM02-0618/ΔmetY, CM02-0757/ΔmetY, CM02-0758/ΔmetY и CM02-0759/AmetY, полученные как указано выше, инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 25 мл среды, описанной ниже, соответственно, и затем культивировали с встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 20 часов. После этого 1 мл каждой культуральной среды инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 24 мл продукционной среды, и затем культивировали с встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Состав посевной среды и продукционной среды является следующим.

<Посевная среда (рН 7,0)>

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды)

<Продукционная среда (рН 8,0)>

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃, 1 мкг кобаламина (витамина В12) (на основе 1 л дистиллированной воды).

Анализировали концентрации L-метионина и побочного продукта гомолантионина в каждой культуральной среде, культивируемой описанным выше способом культивирования,, и они представлены в Таблице 11.

Эти результаты подтверждают, что чужеродный metZ выполняет такую же функцию как metB, то есть продуцирует метионин путем транссульфурации, используя цистеин в качестве источника серы. Другими словами, даже несмотря на делецию metB или metY, продуцирование метионина может поддерживаться с высоким выходом посредством использования metZ, и следовательно, этот ген может быть заменен на чужеродный metZ для компенсации недостатков metB и/или metY у Corynebacterium.

Далее, в штамме, в котором присутствует metB, и в который введен чужеродный metZ, продукция метионина была повышена, а продукция гомолантионина составила только примерно 20% относительно контроля (СМ02-0618), указывая на то, что продукция побочного продукта, гомолантионина, была снижена при усилении metZ. Гомолантионин представляет собой вещество, синтезированное путем потребления О-ацетилгомосерина, и, следовательно, продуцирование гомолантионина снижает продукцию метионина. Чужеродный metZ, который ингибирует продуцирование побочного продукта, компенсирует недостатки metB путем ингибирования продукции побочного продукта и усиления синтеза метионина.

Вышеприведенные результаты впервые выявили, что metZ по настоящему раскрытию может опосредовать транссульфурацию путем использования цистеина, и metZ по настоящему раскрытию можно использовать не только для увеличения продукции метионина, но также для компенсации недостатков metB у штамма рода Corynebacterium.

Пример 7: Получение рекомбинантного вектора для одновременного усиления metH и cysI

В настоящем примере для получения штамма, продуцирующего метионин, в котором mcbR не делетирован, был получен вектор для усиления metH, кодирующего метионинсинтазу (Ncgll450), и cysI, кодирующего сульфитредуктазу (Ncgl2718), одновременно.

Более подробно, для дополнительной вставки генов metH и cysI в хромосому Corynebacterium АТСС 13032 следующим способом был получен рекомбинантный плазмидный вектор. На основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в GenBank от Национального института здравоохранения США (NIH), был получен ген metH и окружающая его последовательность (SEQ ID NO: 39) и ген cysI и окружающая его последовательность (SEQ ID NO: 40) из Corynebacterium glutamicum.

Для получения генов metH и cysI проводили ПЦР с хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID NO: 41 и 42 и SEQ ID NO: 43 и 44. Промотор Pcj7 использовали для усиления экспрессии гена metH и промотор Pspl1 использовали для усиления экспрессии гена cysI. Для получения каждого промотора проводили ПЦР: для Pcj7 на хромосомной ДНК Corynebacterium ammoniagenes АТСС6872 в качестве матрицы с использованием SEQ ID NO: 45 и 46 и для Pspl1 с использованием ДНК ранее раскрытого вектора spl1-GFP (KR 10-1783170 В1) в качестве матрицы с использованием SEQ ID NO: 47 и 48. Последовательности используемых праймеров представлены в Таблице 12 ниже.

ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 4 минут, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК metH и cysI, промотора Pcj7 и промотора Pspl1, соответственно.

Вектор pDCM2-ΔNcgl1021, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали рестриктазой scaI, и четыре амплифицированных фрагмента ДНК обрабатывали scaI для введения в хромосому. После реакции IST (иодат-сульфит-тиосульфат) продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором, в который были вставлены делетированные фрагменты целевого гена, отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид получали плазмиду, которая затем получила название pDCM2-ANcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI.

Пример 8: Получение штамма для одновременного усиления metH и cysI и продуцирование L-метионина с использованием этого штамма

Штамм АТСС 13032 трансформировали путем гомологичной рекомбинации на хромосоме векторами pDCM2-ANcgl1021 и pDCM2-ANcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI, полученными как описано выше путем электропорации (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), соответственно. После этого проводили вторичную рекомбинацию на твердой среде, содержащей сахарозу. Трансформированные штаммы Corynebacterium glutamicum, в которых была завершена вторичная рекомбинация, исследовали на наличие делеции гена Ncgl1021 и вставки гена Pcj7-metH-Pspl1cysI с использованием SEQ ID NO: 23 и 24, соответственно. Рекомбинантные штаммы получили названия 1303 2/ΔNcgl1021 и СМ02-0753, соответственно.

Для исследования способности полученных штаммов 13032/ΔNcgl1021 и СМ02-0753 продуцировать L-метионин их культивировали вместе с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 следующим способом, соответственно.

Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и штаммы 13032/ΔNcgl1021 и СМ02-0753, полученные как описано выше, инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 25 мл описанной ниже среды, соответственно, и затем культивировали с встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 20 часов. После этого 1 мл каждой посевной среды инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 24 мл продукционной среды, и затем культивировали с встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Состав посевной среды и продукционной среды является следующим.

<Посевная среда (рН 7,0)>

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды)

<Продукционная среда (рН 8,0)>

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃, 1 мкг кобаламина (витамина В12) (на основе 1 л дистиллированной воды).

Анализировали концентрации L-метионина в каждой культуральной среде, культивируемой вышеописанным способом культивирования, и они представлены в Таблице 13.

В результате было подтверждено, что способность продуцировать L-метионин штамма, сверхэкспрессирующего metH и cysI, в котором все еще присутствует mcbR, была повышена на 0,03 г/л по сравнению с контрольным штаммом.

Пример 9-1: Получение вектора для усиления генов metZ в сайтах, отличных от сайта Ncgl1021

Для вставки трех типов чужеродных генов metZ в сайты, отличные от существующего сайта на хромосоме Corynebacterium АТСС13032, рекомбинантные плазмидные векторы были получены следующим способом.

Сначала для вставки metZ был получен вектор для делеции Ncgl2748 (транспозаза). На основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в GenBank от Национального института здравоохранения США (NIH), были получены Ncgl2748 и окружающая его последовательность (SEQ ID NO: 49) из Corynebacterium glutamicum. Для осуществления делетирования гена Ncgl2748 проводили ПЦР на хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID NO: 50 и 51 и SEQ ID NO: 52 и 53 (Таблица 14). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены соответствующие фрагменты ДНК.

Вектор pDCM2, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, и амплифицированные генные фрагменты Ncgl2748 обрабатывали рестриктазой smaI для введения в хромосому. После реакции 1ST продуктом затем трансформировали Е. coli DH5a с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставками делетированных целевых генных фрагментов, отбирали путем ПЦР, и методом выделения плазмид получали плазмиду, которая затем получила название PDCM2-ANcgl2748.

Для получения трех типов генов metZ (Chromobacterium violaceum, Hyphomonas neptunium, Rhodobacter sphaeroides) проводили ПЦР с полученными векторами pDCM2-ΔNcgl1021-PsplCvimetZ (metZ Chromobacterium violaceum), pDCM2-ΔNcgl1021-PsplHnemetZ (metZ Hyphomonas neptunium) и pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ (metZ Rhodobacter sphaeroides) в качестве матрицы с использованием SEQ ID NO: 54 и 55, 54 и 56, и 54 и 57 (Таблица 15). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 минут, в общей сложности 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 53°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут. В результате были получены три фрагмента ДНК.

Вектор pDCM2-ANcgl2748, не реплицируемый в Corynebacterium glutamicum, обрабатывали рестриктазой scaI. Затем, после реакции 1ST с амплифицированными фрагментами в соответствии с каждым штаммом, продуктом трансформировали Е. coli DH5α с последующим нанесением полученных клеток на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором со вставками целевого гена, отбирали путем ПЦР, и были получены в общей сложности три плазмиды методом выделения плазмид, которые затем получили названия pDCM2-ANcgl2748-PsplCvimetZ (Chromobacterium violaceum metZ), pDCM2-ANcgl2748-PsplHnemetZ (Hyphomonas neptunium metZ), pDCM2-ANcgl2748-PsplRspmetZ (Rhodobacter sphaeroides metZ), соответственно.

Пример 9-2: Получение вектора для усиления генов metZ в сайтах, отличных от сайта Ncgl1021

Дополнительно для исследования того, повышается ли также продукция метионина у штамма, в который введен ген metZ, имеющий 99% или более гомологии последовательности, были дополнительно получены векторы для пяти генов metZ из Примеров 3-2.

Векторы, в каждый из которых введен один из шести генов metZ, были получены таким же способом как в Примере 9-1.

Всего были получены шесть векторов, под названиями pDCM2-ANcgl2748-PsplRspmetZlong, ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_3, pDCM2-ANcgl2748-PsplRspmetZ_65, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ 104, pDCM2-ANcgl2748-PsplRspmetZ_196 и pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_3_65_104, соответственно, следующим образом. Для получения этих векторов ANcgl102l-PsplRspmetZ_long pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_3, pDCM2-ANcgl 1021-PsplRspmetZ_65, pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_104, pDCM2-ANcgl1021-PsplRspmetZ_196 и pDCM2-ΔNcgl1021-PsplRspmetZ_3_65_104, полученные в Примере 4, использовали в качестве ДНК-матрицы, соответственно, и обычно использовали праймеры SEQ ID NO: 54 и 57. Другие методики были такими же как в Примере 9-1.

Пример 10: Разработка штамма, усиленного чужеродным metZ, на основе имеющего mcbR штамма, продуцирующего L-метионин, и получение L-метионина с использованием этого штамма

Штамм СМ02-0753 трансформировали путем гомологичной рекомбинации на хромосоме векторами pDCM2-ANcgl2748, pDCM2-ANcgl2748-PsplCvimetZ, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplHnemetZ, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ long, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_3, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_65, pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_104, PDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_196 и pDCM2-ΔNcgl2748-PsplRspmetZ_3_65_104, полученными как описано выше путем электропорации, соответственно (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541 545, 1999). После этого проводили вторичную рекомбинацию на твердой среде, содержащей сахарозу. Трансформированные штаммы Corynebacterium glutamicum, в которых была завершена вторичная рекомбинация, исследовали на вставку каждого чужеродного гена metZ в сайте Ncgl2748 с использованием SEQ ID NO: 58 и 59 (Таблица 16), соответственно.

Эти рекомбинантные штаммы получили названия Corynebacterium glutamicum 13032/ANcgl2748, СМ02-0765, СМ02-0766, СМ02-0767-1, СМ02-0767-2, СМ02-0767-3, СМ02-0767-4, СМ02-0767-5, СМ02-0767-6, СМ02-0767, соответственно.

Для исследования способности полученных штаммов продуцировать L-метионин их культивировали вместе с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum СМ02-0753 следующим способом, соответственно.

Каждый штамм инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 25 мл описанной ниже среды, соответственно, и затем культивировали со встряхиванием при 30°С и 200 об./мин в течение 20 часов. После этого 1 мл каждой посевной среды инокулировали в колбу с угловыми перегородками на 250 мл, содержащую 24 мл продукционной среды, и затем культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Состав посевной среды и продукционной среды является следующим.

<Посевная среда (рН 7,0)>

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды)

<Продукционная среда (рН 8,0)>

50 г глюкозы, 12 г (NH₄)₂S₂O₃, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH₂PO₄, 1,2 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃, 1 мкг кобаламина (витамина В12) (на основе 1 л дистиллированной воды).

Анализировали концентрации L-метионина в каждой культуральной среде, культивированной вышеописанным способом культивирования, и они представлены в Таблице 17.

В результате было подтверждено, что при введении чужеродных генов metZ в штамм, продуцирующий метионин, имеющий mcbR, соответственно, выход метионина также увеличивался.

СМ02-0765, СМ02-0766 и СМ02-0767 были депонированы в Корейском центре культур микроорганизмов, международном депозитарии, 2 мая 2019 года, соответствии с положениями Будапештского договора и присвоением номеров доступа No. КССМ12509Р, КССМ12510Р и КССМ12511Р, соответственно.

На основе вышеприведенного описания специалист в данной области техники понимает, что настоящее изобретение может быть выполнено в различных конкретных формах без изменения его технической идеи или существенных признаков. В этом отношении следует понимать, что вышеприведенное описание не является ограничивающим, а является иллюстративным во всех аспектах. Объем настоящего изобретения определяет прилагаемая формула изобретения, а не предшествующее ей описание и, следовательно, подразумевается, что формула изобретения охватывает все изменения и модификации, попадающие в объем формулы изобретения, или их эквиваленты.

Технический эффект изобретения

Микроорганизм, в который введена активность белка, кодируемого metZ, по настоящему раскрытию демонстрирует высокий выход, потому что он производит меньше побочных продуктов по сравнению с metY, и микроорганизм не получает регуляцию по типу братной связи в отличие от metB, получающему ингибирование метионином по типу обратной связи, и следовательно продуцирует L-метионин с высоким выходом, что делает полезным его применение в промышленном производстве L-метионина.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ L-МЕТИОНИН, В КОТОРЫЙ ВВЕДЕН БЕЛОК,

КОДИРУЕМЫЙ ЧУЖЕРОДНЫМ ГЕНОМ metZ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-МЕТИОНИНА

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО МИКРООРГАНИЗМА

<130> OPA20069

<150> KR 10-2019-0134797

<151> 2019-10-28

<160> 81

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 2642

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

ctcccgcgca ctgctgcaat ccgcaccgtg cccaatgatg gtggttcgcc cacctgagaa 60

gattaagaag tagtttcttt taagtttcga tgccccggtt tcctgatttt gtgcagggag 120

gccggggcat tggtgtttgc gggttagttc gggccattcg aaagggagaa accaagggca 180

gccagacaga cgtgccaaga atctggattt ccgccaggtt ttggcacgcc cgtctggttt 240

aggcaatgag ataccgaaca cacgtgccaa aagttcggct ttttcgccga tcttgtcacg 300

cctgcctggt ttgtcttgta aagagtgatt tcatggccga gactcctaaa agtttgacct 360

cacaggattg cttctaaggg cctctccaat ctccactgag gtacttaatc cttccgggga 420

attcgggcgc ttaaatcgag aaattaggcc atcacctttt aataacaata caatgaataa 480

ttggaatagg tcgacacctt tggagcggag ccggttaaaa ttggcagcat tcaccgaaag 540

aaaaggagaa ccacatgctt gccctaggtt ggattacatg gatcattatt ggtggtctag 600

ctggttggat tgcctccaag attaaaggca ctgatgctca gcaaggaatt ttgctgaaca 660

tagtcgtcgg tattatcggt ggtttgttag gcggctggct gcttggaatc ttcggagtgg 720

atgttgccgg tggcggcttg atcttcagct tcatcacatg tctgattggt gctgtcattt 780

tgctgacgat cgtgcagttc ttcactcgga agaagtaatc tgctttaaat ccgtagggcc 840

tgttgatatt tcgatatcaa caggcctttt ggtcattttg gggtggaaaa agcgctagac 900

ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 960

gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtggctgcta gcgcttcagg 1020

caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat cgaccaagcc cccgacagcg 1080

tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt attcgcgtca tcggtattga 1140

tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc tattcccttt tcggatcgaa 1200

ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag ctgtggcgtg aagcgtggcg 1260

tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc atcgcgttct ttgatcagtg 1320

cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac tttcagaatg cggctagtga 1380

gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt gcagcagtgt tagagcaccg 1440

cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag aagaacggct acccaggcac 1500

cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga cttgctggat ctcgattggt 1560

ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct cggcagttgt tgtcggctcc 1620

acctgcggac tactcaattt agtttcttca ttttccgaag gggtatcttc gttgggggag 1680

gcgtcgataa gccccttctt tttagcttta acctcagcgc gacgctgctt taagcgctgc 1740

atggcggcgc ggttcatttc acgttgcgtt tcgcgcctct tgttcgcgat ttctttgcgg 1800

gcctgttttg cttcgttgat ttcggcagta cgggttttgg tgagttccac gtttgttgcg 1860

tgaagcgttg aggcgttcca tggggtgaga atcatcaggg cgcggttttt gcgtcgtgtc 1920

cacaggaaga tgcgcttttc tttttgtttt gcgcggtaga tgtcgcgctg ctctaggtgg 1980

tgcactttga aatcgtcggt aagtgggtat ttgcgttcca aaatgaccat catgatgatt 2040

gtttggagga gcgtccacag gttgttgctg acccaataga gtgcgattgc tgtggggaat 2100

ggtcctgtga ggccaaggga cagtgggaag atcggcgcga ggatcgacat cacgatcatg 2160

aacttcagca tgccgttaga gaatccggat gcgtaatcgt tggtttggaa gctgcggtac 2220

atggacatcg ccatgttgat tgcggtgagg attgcggctg tgatgaacag tggcaaaacg 2280

aaactaagaa cttccgcctg cgtggtgctc aaatatttta gctgctcagt gggcatcgaa 2340

acataagcgg gcagaggcac attgctcacg cgaccagcga ggaaagattc cacttcctca 2400

ggagttagga agccgatcga ctggaagacg ggattttcca aaccaccttc agggcgagcc 2460

atgcggagaa gtgcccagta aagaccaagg acaatcggta tctggatcag cccaggcaca 2520

caacctgcca gcgggttaat gccgtattcc ttattcaaat cattctggcg cttctgcaac 2580

tcccgaatgg acgcttcatc gtactttccc ttgtattctt cccggagcgc agcgcggtga 2640

gg 2642

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 2

tcgagctcgg tacccctgcc tggtttgtct tgta 34

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 3

cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 4

aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 5

ctctagagga tccccgtttc gatgcccact gagca 35

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 6

aatctggatt tccgccaggt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 7

cttcctaact cctgaggaag 20

<210> 8

<211> 3311

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

ctcattccag cgtcacgacg ttccgaaggt actggttacc tggcattggg cactaccgtt 60

tctgcagcac ttggaccagc cctagcactt tttgtcctag gaacatttga ttacgacatg 120

ctgtttatcg tggtcttggc aacctcggtc atctctttga tcgccgtcgt gttcatgtac 180

tttaagacca gcgaccctga gccttctggg gaaccagcca agttcagctt caaatctatt 240

atgaacccaa agatcatccc catcggcatc tttatcttgc ttatttgctt tgcttactct 300

ggcgtcattg cctacatcaa cgcatttgct gaagaacgcg atctgattac gggtgctgga 360

ttgttcttca ttgcctacgc agtatcaatg tttgtgatgc gcagcttcct tggcaaactg 420

caggaccgtc gcggagacaa cgtcgttatt tactttggat tgttcttctt cgttatttcc 480

ttgacgattt tgtcctttgc cacttccaac tggcacgttg tgttgtccgg agtcattgca 540

ggtctgggat acggcacttt gatgccagca gtgcagtcca tcgctgttgg tgtagtagac 600

aaaaccgaat tcggtacggc cttctccact ttgttcctgt ttgtggactt aggttttggc 660

tttggaccta ttatcctggg agcagtttct gcggcaattg gtttcggacc tatgtatgca 720

gcactggcag gtgtgggtgt gattgccgga atcttctacc tgttcacaca cgctcgcacc 780

gatcgagcta agaatggctt tgttaaacac ccagagcctg tcgctttagt tagctagttc 840

tttcagcttt ccctcccgat cagcgtaaac cggcccttcc ggttttgggg tacatcacag 900

aacctgggct agcggtgtag acccgaaaat aaacgagcct tttgtcaggg ttaaggttta 960

ggtatctaag ctaaccaaac accaacaaaa ggctctaccc atgaagtcta ccggcaacat 1020

catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc accatcaccg gcgcttccga 1080

tgcaggtgat tacaccctga tcgaagcaga cgcactcgac tacacctcca cctgcccaga 1140

atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg atgctcattg atttacccat 1200

cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc taccgctgca ccaaccccac 1260

atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct gaccacggta aaaaggtcac 1320

ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt gaccggatga gtgttcacgc 1380

aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc caactagccc tcgatatgtg 1440

ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga gtgtatgtca ttggggtgga 1500

tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat gggtttgtca ccgtgattgt 1560

cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc cggttattag atgtcgtccc 1620

aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc cgcggtgaac agttccgcaa 1680

tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac gccacagcaa gtaaagaact 1740

cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt gtgcggcttg ctggtgacaa 1800

gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac cagcgtcgtg gtttaagcca 1860

ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg cacaagtggt tgagtcctcg 1920

tcagcaagaa agcttggagc agttgtgggc gtatgacaaa gactacgggg cgttaaagct 1980

tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag atgggtaata agcgtgaagc 2040

gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg ttgaaggggc cgaataagga 2100

actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt gatgtgttgg cgtatttcga 2160

tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga cggttggagc atttgcgtgg 2220

gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg cggtgcctta tccattcagg 2280

gcagttggtc cataagatca atgcactcta aaacaggaag agcccgtaaa cctctgacta 2340

gcgtcaccct ctgattaagg cgaccgcgga tttaagagca gaggctgcca cgagcgcatc 2400

ttcacggctg tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460

aagccccaac gccagcaaca catgggatac ctctccggaa ccacaggcag aaccagggga 2520

gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580

gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640

gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700

ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760

tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820

aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880

aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940

caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000

tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060

gggggatagg taggtgatct cgaaatcatg aaacctttca agataagcag cagtttctag 3120

gacactgtca tgctcgatcg gggtggtgat gaggtgccgg ccacgaggat tagctaagca 3180

cgctcctttg atagcgaggt tgttggcttc tgatccaccc gacgtaaacg tcacctgtgt 3240

ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300

gagtcttccc a 3311

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 9

acccggggat cctctagaat gtttgtgatg cgcag 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 10

gtcagagagt acttacgctg atcgggaggg aaagc 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 11

atcagcgtaa gtactctctg actagcgtca ccctc 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 12

ctgcaggtcg actctagaaa agggattgga gtgtt 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 13

atcaaaacag atatcatggc atccgacgcg ccgca 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 14

cgctagtcag agagtttagt caaggccccg caaca 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 15

atcaaaacag atatcatggc ggatgcaccc ggcgg 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 16

cgctagtcag agagttcaca agctgttaag cgaag 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 17

atcaaaacag atatcatgac gaaggactgg aagac 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 18

cgctagtcag agagttcaga tcaccgcgag cgcct 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 19

ccgatcagcg taagtggcgc ttcatgtcaa caatc 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 20

cgcgtcggat gccatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 21

gggtgcatcc gccatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 22

ccagtccttc gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 23

aatggtccag gagctcat 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 24

gatcacctac ctatcccc 18

<210> 25

<211> 3161

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 25

cggtggacga tgagggaaaa cgtttcctcg ccgcccacag aatcataaaa attttctgag 60

gttgtcatgg gtaccagtct aagccctggc cttacgccag taaggtgtta cccatgcgcg 120

aactagcact caacatggcc ggcgtcaccg tgcggcgcgg cgagaaattg cttctcgacg 180

atatctccct ctcaattccg caagggtcgc actgggccgt acttggtcca aatggcgccg 240

gtaaaaccac catgctgaag atcgcagcca ccttgctgta cccatcggaa ggcaccgtgg 300

acatcctggg gcatcgcttt ggtcgggtgg atactcgtga gctgcggaaa acaatcggcc 360

tggtggaccc gaagcaaaga tttaccaacc tgccggccca cgaaattgtg ctgtcggggt 420

taaccgcctc caacgggttg ttgccacggt ggtcggcttc ggcttcggag ttggagcggt 480

gcgctttgat gttggagttg gtgggcatga cagcgcgtgc cgatcgttac tgggccgata 540

tgagccaggg cgaaaaagcc cgcaccctga ttgctcgtgc gctgattatc tcaccgaccc 600

tactgctgct tgatgaaccc accaccggcc ttgacctgcc cggacgtgaa actttgctca 660

gtgtgattga tggtttgcga gccgctcttc ctggtctgac gacagtgatg atcacccacc 720

acgtcgaaga gatcgccgcc tccacgacag atatcctcat gatcaaggac gcccgcatac 780

tggcttcggg gactgtttca gaagtgatga ctcctgaaaa tttgggcgcg ctgtatgaca 840

tgtcggtgtc gttggaaact gtgcgcagcc ggtggttcgc gttcgatgct ctgcattaaa 900

aggggctagt tttacacaaa agtggacagc ttggtctatc attgccagaa gaccggtcct 960

tttagggcca tagaattctg attacaggag ttgatctacc ttgtcttttg acccaaacac 1020

ccagggtttc tccactgcat cgattcacgc tgggtatgag ccagacgact actacggttc 1080

gattaacacc ccaatctatg cctccaccac cttcgcgcag aacgctccaa acgaactgcg 1140

caaaggctac gagtacaccc gtgtgggcaa ccccaccatc gtggcattag agcagaccgt 1200

cgcagcactc gaaggcgcaa agtatggccg cgcattctcc tccggcatgg ctgcaaccga 1260

catcctgttc cgcatcatcc tcaagccggg cgatcacatc gtcctcggca acgatgctta 1320

cggcggaacc taccgcctga tcgacaccgt attcaccgca tggggcgtcg aatacaccgt 1380

tgttgatacc tccgtcgtgg aagaggtcaa ggcagcgatc aaggacaaca ccaagctgat 1440

ctgggtggaa accccaacca acccagcact tggcatcacc gacatcgaag cagtagcaaa 1500

gctcaccgaa ggcaccaacg ccaagctggt tgttgacaac accttcgcat ccccatacct 1560

gcagcagcca ctaaaactcg gcgcacacgc agtcctgcac tccaccacca agtacatcgg 1620

aggacactcc gacgttgttg gcggccttgt ggttaccaac gaccaggaaa tggacgaaga 1680

actgctgttc atgcagggcg gcatcggacc gatcccatca gttttcgatg catacctgac 1740

cgcccgtggc ctcaagaccc ttgcagtgcg catggatcgc cactgcgaca acgcagaaaa 1800

gatcgcggaa ttcctggact cccgcccaga ggtctccacc gtgctctacc caggtctgaa 1860

gaaccaccca ggccacgaag tcgcagcgaa gcagatgaag cgcttcggcg gcatgatctc 1920

cgtccgtttc gcaggcggcg aagaagcagc taagaagttc tgtacctcca ccaaactgat 1980

ctgtctggcc gagtccctcg gtggcgtgga atccctcctg gagcacccag caaccatgac 2040

ccaccagtca gctgccggct ctcagctcga ggttccccgc gacctcgtgc gcatctccat 2100

tggtattgaa gacattgaag acctgctcgc agatgtcgag caggccctca ataaccttta 2160

gaaactattt ggcggcaagc agcttttcaa tataagcaat gcgagcctcc accatgtagc 2220

cgaagagttc gtcagaagtt gagacggact cttcgactgc tttacgggtc agtggcgctt 2280

ccacatctgg gttctcatca agccatggct taggaaccgg agcaaacaca tccggctttt 2340

cgccctctgg acgattgtca aaggtgtagt cagaagtcag ggtgaagctg aagacatcag 2400

ccatcatcat ctcccggatg atggttgctt ccttgaggga cagcccgata tcagtcaaga 2460

acttcaagga ctcctccgca cccgcgattc gcagtgggga agtgccctga gtagagatct 2520

gttcatccag cgcgaccaga agaacacgtg gagtctcacg gaattggtcg cgcaatgagc 2580

tccacagcgt atgaatagat tgccgccaat tgtccggatc aagatcgggc accttgatat 2640

catcgatgat gcgcacccag acgcgatcaa tgatttcttg acgatttagc acatggttat 2700

acagtgcgcg aggggtgaca cccatgtctc gggcgaggcg gttcatggtc acggcagcga 2760

atccttcgcg gccggcaatg tttaaagtgc gctccactat ggattcgacg gaaaggatac 2820

gttgggtggg gcgtccagga cgacgtcccg tggaagtggc cgccagagtt gacgctacgg 2880

ctggtttcat agtttcgcta ggcatgttat atgacgttac gcctttttct acaagacaac 2940

cagcgttttc agcgagatac tggacatatc aactaaaatc cctgaataaa acatctaaca 3000

tgggttttat acagaaaatt catacgaaag gttgatcatg aagaagaaga ttgcggtcgt 3060

taccggagcg accggaggca tgggaattga gatcgtcaaa gacctctccc gcgaccacat 3120

tgtctacgcc ttgggccgaa atccagagca tctggcagct c 3161

<210> 26

<211> 3314

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

gataccggca gctccaccga ccgtgcccat ttcatcacga accatctggc caagtgagcg 60

tccacgccta cgagtagaca cccacagcac taggtagtcc tgcactgcac cggcgaaaat 120

cacaccgagg ataatccaca aggtgcctgg caggtagccc atctgcgcgg ccatgacagg 180

tccaaccaat ggaccggcac ctgcaatagc tgcaaagtgg tggccaaaaa gcacacgacg 240

atccgttggg acatagtcct tgccgtcatt aacgtattcc gccggggttg ctcgctgatc 300

tttcggctta acaactttgt attcaatcag tcgggcatag aaagaaaacg caatgatata 360

ggaaccaact gccgccaaaa ccagccacac agagttgatt gtttcgccac gggagaaagc 420

gattgctccc caacccaccg ccgcgataac cccaaagaca aggagaccaa cgcgggcggt 480

cggtgacatt ttaggggact tcttcacgcc tactggaagg tcagtagcgt tgctgtacac 540

caaatcatcg tcattgatgt tgtcagtctg ttttatggtc acgatcttta ctgttttctc 600

ttcgggtcgt ttcaaagcca ctatgcgtag aaacagcggg cagaaactgt gtgcagaaat 660

gcatgcagaa aaaggaaagt tcggccagat gggtgtttct gtatgccgat gatcggatct 720

ttgacagctg ggtatgcgac aaatcaccga gagttgttaa ttcttaacaa tggaaaagta 780

acattgagag atgatttata ccatcctgca ccatttagag tggggctagt cataccccca 840

taaccctagc tgtacgcaat cgatttcaaa tcagttggaa aaagtcaaga aaattacccg 900

agaataaatt tataccacac agtctattgc aatagaccaa gctgttcagt agggtgcatg 960

ggagaagaat ttcctaataa aaactcttaa ggacctccaa atgccaaagt acgacaattc 1020

caatgctgac cagtggggct ttgaaacccg ctccattcac gcaggccagt cagtagacgc 1080

acagaccagc gcacgaaacc ttccgatcta ccaatccacc gctttcgtgt tcgactccgc 1140

tgagcacgcc aagcagcgtt tcgcacttga ggatctaggc cctgtttact cccgcctcac 1200

caacccaacc gttgaggctt tggaaaaccg catcgcttcc ctcgaaggtg gcgtccacgc 1260

tgtagcgttc tcctccggac aggccgcaac caccaacgcc attttgaacc tggcaggagc 1320

gggcgaccac atcgtcacct ccccacgcct ctacggtggc accgagactc tattccttat 1380

cactcttaac cgcctgggta tcgatgtttc cttcgtggaa aaccccgacg accctgagtc 1440

ctggcaggca gccgttcagc caaacaccaa agcattcttc ggcgagactt tcgccaaccc 1500

acaggcagac gtcctggata ttcctgcggt ggctgaagtt gcgcaccgca acagcgttcc 1560

actgatcatc gacaacacca tcgctaccgc agcgctcgtg cgcccgctcg agctcggcgc 1620

agacgttgtc gtcgcttccc tcaccaagtt ctacaccggc aacggctccg gactgggcgg 1680

cgtgcttatc gacggcggaa agttcgattg gactgtcgaa aaggatggaa agccagtatt 1740

cccctacttc gtcactccag atgctgctta ccacggattg aagtacgcag accttggtgc 1800

accagccttc ggcctcaagg ttcgcgttgg ccttctacgc gacaccggct ccaccctctc 1860

cgcattcaac gcatgggctg cagtccaggg catcgacacc ctttccctgc gcctggagcg 1920

ccacaacgaa aacgccatca aggttgcaga attcctcaac aaccacgaga aggtggaaaa 1980

ggttaacttc gcaggcctga aggattcccc ttggtacgca accaaggaaa agcttggcct 2040

gaagtacacc ggctccgttc tcaccttcga gatcaagggc ggcaaggatg aggcttgggc 2100

atttatcgac gccctgaagc tacactccaa ccttgcaaac atcggcgatg ttcgctccct 2160

cgttgttcac ccagcaacca ccacccattc acagtccgac gaagctggcc tggcacgcgc 2220

gggcgttacc cagtccaccg tccgcctgtc cgttggcatc gagaccattg atgatatcat 2280

cgctgacctc gaaggcggct ttgctgcaat ctagctttaa atagactcac cccagtgctt 2340

aaagcgctgg gtttttcttt ttcagactcg tgagaatgca aactagacta gacagagctg 2400

tccatataca ctggacgaag ttttagtctt gtccacccag aacaggcggt tattttcatg 2460

cccaccctcg cgccttcagg tcaacttgaa atccaagcga tcggtgatgt ctccaccgaa 2520

gccggagcaa tcattacaaa cgctgaaatc gcctatcacc gctggggtga ataccgcgta 2580

gataaagaag gacgcagcaa tgtcgttctc atcgaacacg ccctcactgg agattccaac 2640

gcagccgatt ggtgggctga cttgctcggt cccggcaaag ccatcaacac tgatatttac 2700

tgcgtgatct gtaccaacgt catcggtggt tgcaacggtt ccaccggacc tggctccatg 2760

catccagatg gaaatttctg gggtaatcgc ttccccgcca cgtccattcg tgatcaggta 2820

aacgccgaaa aacaattcct cgacgcactc ggcatcacca cggtcgccgc agtacttggt 2880

ggttccatgg gtggtgcccg caccctagag tgggccgcaa tgtacccaga aactgttggc 2940

gcagctgctg ttcttgcagt ttctgcacgc gccagcgcct ggcaaatcgg cattcaatcc 3000

gcccaaatta aggcgattga aaacgaccac cactggcacg aaggcaacta ctacgaatcc 3060

ggctgcaacc cagccaccgg actcggcgcc gcccgacgca tcgcccacct cacctaccgt 3120

ggcgaactag aaatcgacga acgcttcggc accaaagccc aaaagaacga aaacccactc 3180

ggtccctacc gcaagcccga ccagcgcttc gccgtggaat cctacttgga ctaccaagca 3240

gacaagctag tacagcgttt cgacgccggc tcctacgtct tgctcaccga cgccctcaac 3300

cgccacgaca ttgg 3314

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 27

gaattcgagc tcggtacccg ggccagtaag gtgttaccca tgc 43

<210> 28

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 28

ctgcttgccg ccaaatagtt tagtactggt agatcaactc ctgtaatcag aattcta 57

<210> 29

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 29

tagaattctg attacaggag ttgatctacc agtactaaac tatttggcgg caagcag 57

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 30

tcgactctag aggatccccg ggcgatctca attcccatgc ctc 43

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 31

tcgagctcgg tacccctgca atagctgcaa agtgg 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 32

tgagtctatt taaagcgggt aattttcttg acttt 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 33

caagaaaatt acccgcttta aatagactca cccca 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 34

ctctagagga tccccgcctt aatttgggcg gattg 35

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 35

ttcctggtct gacgacagtg 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 36

gatgtcttca gcttcaccct g 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 37

ccgaggataa tccacaaggt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 38

cgaagcgttc gtcgatttct 20

<210> 39

<211> 5666

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 39

tgtcatgctt ccggaggtgc gcagggctcg agactccgga aagctatttg ccactccgat 60

gtttgggtca ctcgacgaga tacgtgctga tcacctaatt tggtgcacag ggtttcggcc 120

ggcgattagg ccagttcgtc aacttctcaa acacggacaa ccaaaggttc ctggtcttta 180

tttagtaggc tacggagatt ggacgggacc tgggtctgcg actatcacag gggtcgggct 240

ttatgccaag cgagcagcca aagagattgc cgcgtcagtc ggcaaagtcg ttaaatagtt 300

tgaaggctaa gaacttaatg ttaaagcgaa aattgttttg acacctcaac taatgcagcg 360

atgcgttctt tccagaatgc tttcatgaca gggatgctgt cttgatcagg caggcgtctg 420

tgctggatgc cgaagctgga tttattgtcg cctttggagg tgaagttgac gctcactcga 480

gaatcatcgg ccaaccattt ggcattgaat gttctaggtt cggaggcgga ggttttctca 540

attagtgcgg gatcgagcca ctgcgcccgc aggtcatcgt ctccgaagag cttccacact 600

ttttcgaccg gcaggttaag ggttttggag gcattggccg cgaacccatc gctggtcatc 660

ccgggtttgc gcatgccacg ttcgtattca taaccaatcg cgatgccttg agcccaccag 720

ccactgacat caaagttgtc cacgatgtgc tttgcgatgt gggtgtgagt ccaagaggtg 780

gcttttacgt cgtcaagcaa ttttagccac tcttcccacg gctttccggt gccgttgagg 840

atagcttcag gggacatgcc tggtgttgag ccttgcggag tggagtcagt catgcgaccg 900

agactagtgg cgctttgcct gtgttgctta ggcggcgttg aaaatgaact acgaatgaaa 960

agttcgggaa ttgtctaatc cgtactaagc tgtctacaca atgtctactt cagttacttc 1020

accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat gcgttggcaa accatgtgtt 1080

gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt gacctggacg tggaaaagga 1140

tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac acccgccctg atgtgttgag 1200

gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg gttgagacca atacttttgg 1260

ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat cgttgccgtg agcttgccta 1320

caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg gggccgggcc gaaacggcat 1380

gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag cttccatcgc tgggccatgc 1440

accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg cttggcatca tcgacggtgg 1500

tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt caggtcaagg ctgcggttca 1560

cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg cccattattt gccacgtcac 1620

cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc ggtgccgcgt tgacagcgct 1680

gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc accggcccag atgagatgag 1740

cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct gtgtcggtga tgcctaacgc 1800

aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca cttgaggctg aggatttggc 1860

gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc atggtgggtg gttgttgtgg 1920

caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg gttggtgttc cagagcagga 1980

aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag caggcctccc gcgaggtgga 2040

gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca ttgtcccagg aaaccggcat 2100

ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag gcattccgtg aggcaatgct 2160

gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag caaacccgcg atggtgcaca 2220

catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc accgccgata tggcgacctt 2280

ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg attgactcca ccgagccaga 2340

ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc atcgttaact ccgtcaactt 2400

tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc atgaaactgg taaagcagca 2460

cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc caggcacgta ccgctgagca 2520

caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc ggcagctacg gcctggatat 2580

caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct actggccagg aagaaaccag 2640

gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg aagaagctct acccagaaat 2700

ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg aaccctgctg cacgccaggt 2760

tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt ctggactctg cgattgcgca 2820

cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc cagcgcgaag tggcgttgga 2880

tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg caggaattca tgcagctgtt 2940

tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct gaacagctgg ccgctatgcc 3000

tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat aagaatggcc ttgaggatga 3060

tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc atcaacgagg accttctcaa 3120

cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag atgcagctgc cattcgtgct 3180

gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg gaaccgttca tggaagagga 3240

agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc aaaatcgtcg tggccaccgt 3300

caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac atcattttgt ccaacaacgg 3360

ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc gccatgttgg aagcagcgga 3420

agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt gtgaagtcca ccgtggtgat 3480

gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc aattacccag tcattttggg 3540

tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc aacgaggtgt acaccggtga 3600

ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg atggatgagg tgatggcaga 3660

aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct attgagcagg cgaagaagaa 3720

ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt gccgcggagc gtaaagctaa 3780

tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc accgatactc caaccgcggc 3840

accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc ttggcggagt tcttgggcaa 3900

ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg aaatccaccc gcggcaacga 3960

gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga ccacgcctgc gctactggct 4020

ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc ttggtgtatg gctacttccc 4080

agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc ccggatccac acgcagccga 4140

acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg ttcttgtgca tcgcggattt 4200

cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg gacgtcatgc cattccagct 4260

ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag ttgttcgcag ccaatgaata 4320

ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc accgaagcat tggccgagta 4380

ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac ggtggatctg tcgctgattt 4440

tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac cgcggcgccc gcttctcctt 4500

tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag ctggtggaat tgctcgagcc 4560

aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg cacccagagc agtccacaga 4620

cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac gtctaacacc tttgagaggg 4680

aaaactttcc cgcacattgc agatcgtgcc actttaacta aggttgacgg catgattaag 4740

gcgattttct gggacatgga cggcacgatg gtggactctg agccacagtg gggcattgct 4800

acctacgagc tcagcgaagc catgggccgc cgcctcaccc cggagctccg ggaactcacc 4860

gtcggctcga gcctgccgcg caccatgcgc ttatgcgcag agcacgcagg cattacattg 4920

agcgacgcgg actacgagcg ctaccgggct ggcatgttcg cccgggtcca tgagcttttc 4980

gacgaatccc tcgtcccaaa tccaggcgtc accgaactcc tgacagagtt gaaggccctc 5040

gagatcccca tgttggtcac caccaacaca gagcgcgatc tcgcgacccg ttcagtcgca 5100

gccgtgggaa atgagttctt catcggttct atcgctggtg atgaagtccc aacagcaaag 5160

ccagcccccg acatgtacct cgaagcagca cgacgtgtgg gctttgaccc atcagagtgc 5220

ctcgtgttcg aagattccta caacggcatg ctgggcgctg ttactgcagg ttgccgcgtc 5280

attggtctgc acccagaaga agtccaagcg ccagaaggtg tagtgccttt gcgttccctc 5340

cacggtaaaa actctttcga aggtgtcacc gctgagatgg tcactgcctg gtaccaccag 5400

atcgagccgg caggtgtcgc aaaataaaac caggtggggg agtgaaatta ttcgactaat 5460

atcctccccc aaacacacat tgataactgt tgtgtggaag aatgtaccga gtgaagacat 5520

ttgactcgct gtacgaagaa cttcttaacc gtgctcagac ccgccctgaa gggtctggaa 5580

ccgtggccgc cttggataaa ggcatccatc atctaggtaa gaaggtcatc gaagaagccg 5640

gagaggtctg gattgcagcc gagtat 5666

<210> 40

<211> 3613

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 40

tcctgtgggg tgaacttgac ctgtgctggg ccacgacgtc cgaaaacgtg cacttcagtg 60

gccttgtttt ctttgaggga gtcgtagacg ttgtcggaaa tttcggtgac tttgagctcg 120

tcgcctgtct tagccaggat gcgggctacg tcgaggccga cgttaccaac gccgataaca 180

gcgacggact gtgcagacag atcccaggag cgctcgaagc gtgggttgcc gtcgtagaag 240

ccaacgaact cgccggcacc gaaggagcct tctgcttcaa ttccggggat gttgaggtcg 300

cggtctgcaa ctgcgccggt ggagaacacg actgcatcgt agtagtcgcg gagttcttcg 360

acggtgatgt ctttgccgat ttcaatgtta ccgagcaggc gcaggcgtgg cttgtccaac 420

acgttgtgca gggacttaac gatgcccttg atgcgtgggt ggtctggagc aacgccgtaa 480

cggatgagtc cgaacggtgc aggcatttgc tcgaaaaggt caacgaacac ttcgcgctct 540

tcattgcgga tgaggaggtc ggatgcgtaa atgccagcag ggccagctcc gatgacggct 600

acgcgcaggg gagttgtcat gtgtttgaag ttgcctttcg tgagcccttt tatggaaaca 660

agggtgtgaa aatcaagtag ttaaaggtgt ttcaagtcca ggctgtttaa cactcctaga 720

ccgcttggtc tgtaaacgta gcagcgaaat gcgacaatgc gaagactttt gcttaattaa 780

attcaaactc catgaaaaaa ctagacagat cggtctatta tattcacggt gaacctaacc 840

taatatcccc aggttaattc atttaaacgg gcattaggtg actccattgc tttcagtctc 900

atgaatctaa tggttggtct agacagagcg gtacgtctaa gtttgcggat agatcaaacc 960

gagtgacatg tacttcacta gctctttaag gattaactcc ccatgacaac aaccaccgga 1020

agtgcccggc cagcacgtgc cgccaggaag cctaagcccg aaggccaatg gaaaatcgac 1080

ggcaccgagc cgcttaacca tgccgaggaa attaagcaag aagaacccgc ttttgctgtc 1140

aagcagcggg tcattgatat ttactccaag cagggttttt cttccattgc accggatgac 1200

attgccccac gctttaagtg gttgggcatt tacacccagc gtaagcagga tctgggcggt 1260

gaactgaccg gtcagcttcc tgatgatgag ctgcaggatg agtacttcat gatgcgtgtg 1320

cgttttgatg gcggactggc ttcccctgag cgcctgcgtg ccgtgggtga aatttctagg 1380

gattatgctc gttccaccgc ggacttcacc gaccgccaga acattcagct gcactggatt 1440

cgtattgaag atgtgcctgc gatctgggag aagctagaaa ccgtcggact gtccaccatg 1500

cttggttgcg gtgacgttcc acgtgttatc ttgggctccc cagtttctgg cgtagctgct 1560

gaagagctga tcgatgccac cccggctatc gatgcgattc gtgagcgcta cctagacaag 1620

gaagagttcc acaaccttcc tcgtaagttt aagactgcta tcactggcaa ccagcgccag 1680

gatgttaccc acgaaatcca ggacgtttcc ttcgttcctt cgattcaccc agaattcggc 1740

ccaggatttg agtgctttgt gggcggtggc ctgtccacca acccaatgct tgctcagcca 1800

cttggttctt ggattccact tgatgaggtt ccagaagtgt gggctggcgt cgccggaatt 1860

ttccgcgact acggcttccg acgcctgcgt aaccgtgctc gcctcaagtt cttggtggca 1920

cagtggggta ttgagaagtt ccgtgaagtt cttgagaccg aatacctcga gcgcaagctg 1980

atcgatggcc cagttgttac caccaaccct ggctaccgtg accacattgg cattcaccca 2040

caaaaggacg gcaagttcta cctcggtgtg aagccaaccg ttggacacac caccggtgag 2100

cagctcattg ccattgctga tgttgcagaa aagcacggca tcaccaggat tcgtaccacg 2160

gcggaaaagg aactgctctt cctcgatatt gagagaaaga accttactac cgttgcacgc 2220

gacctggatg aaatcggact gtactcttca ccttccgagt tccgccgcgg catcatttcc 2280

tgcaccggct tggagttctg caagcttgcg cacgcaacca ccaagtcacg agcaattgag 2340

cttgtcgacg aactggaaga gcgcctcggc gatttggatg ttcccatcaa gattgcactg 2400

aacggttgcc ctaactcttg tgcacgcacc caggtttccg acatcggatt caagggacag 2460

accgtcactg atgctgacgg caaccgcgtt gaaggtttcc aggttcacct gggcggttcc 2520

atgaacttgg atccaaactt cggacgcaag ctcaagggcc acaaggttat tgccgatgaa 2580

gtgggagagt acgtcactcg cgttgttacc cacttcaagg aacagcgcca cgaggacgag 2640

cacttccgcg attgggtcca gcgggccgct gaggaagatt tggtgtgagt cttcggagga 2700

aacccaatcc caaccgcaac caccctctgt actgcccata ctgcgcggga gaagttcttt 2760

tccccgatga gcaaacagaa ttcgcgtggt tgtgtgcgga ttgcaccaga gtttttgaag 2820

tgaaatatca cggccaggac gatccagtgc acaggccagc accagcaaag tccacatcgc 2880

aagcattaaa agaatctctc gaaagacaca aaagaggtga gtcgcaacaa tgagctttca 2940

actagttaac gccctgaaaa atactggttc ggtaaaagat cccgagatct cacccgaagg 3000

acctcgcacg accacaccgt tgtcaccaga ggtagcaaaa cataacgagg aactcgtcga 3060

aaagcatgct gctgcgttgt atgacgccag cgcgcaagag atcctggaat ggacagccga 3120

gcacgcgccg ggcgctattg cagtgacctt gagcatggaa aacaccgtgc tggcggagct 3180

ggctgcgcgg cacctgccgg aagctgattt cctctttttg gacaccggtt accacttcaa 3240

ggagaccctt gaagttgccc gtcaggtaga tgagcgctat tcccagaagc ttgtcaccgc 3300

gctgccgatc ctcaagcgca cggagcagga ttccatttat ggtctcaacc tgtaccgcag 3360

caacccagcg gcgtgctgcc gaatgcgcaa agttgaaccg ctggcggcgt cgttaagccc 3420

atacgctggc tggatcaccg gcctgcgccg cgctgatggc ccaacccgtg ctcaagcccc 3480

tgcgctgagc ttggatgcca ccggcaggct caagatttct ccaattatca cctggtcatt 3540

ggaggaaacc aacgagttca ttgcggacaa caacctcatc gatcacccac ttacccatca 3600

gggttatcca tca 3613

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 41

caacgaaagg aaacaatgtc tacttcagtt acttc 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 42

tagtcagaga gtgatttaga cgttaaagta ctttg 35

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 43

atcaaaacag atatcatgac aacaaccacc ggaag 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 44

cgctagtcag agagttcaca ccaaatcttc ctcag 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 45

ccgatcagcg taagtagaaa catcccagcg ctact 35

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 46

aactgaagta gacattgttt cctttcgttg ggtac 35

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 47

tactttaacg tctaaggtac cggcgcttca tgtca 35

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 48

ggtggttgtt gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 49

<211> 3261

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 49

cctcactggc gaacacggcc gactcctgga acagcgcaac atggcatgga cgaaactcaa 60

cgaaatccca ggtgtcagct gtgtgaaacc aatgggagct ctatacgcgt tccccaagct 120

cgaccccaac gtgtacgaaa tccacgacga cacccaactc atgctggatc ttctccgtgc 180

cgagaaaatc ctcatggttc agggcactgg cttcaactgg ccacatcacg atcacttccg 240

agtggtcacc ctgccatggg catcccagtt ggaaaacgca attgagcgcc tgggtaactt 300

cctgtccact tacaagcagt agtagttgtt aggattcacc acgaatctca ggatttttga 360

gattcgtggt gaatttttgc gttttccagt caggctcctg caactttcgg accgatttca 420

gaggggcgga gctggtttgt ggtggatcct tgaaatggaa cctcgcagga agctttcagg 480

aagaccaagt tgggcctagg ggtggcggga ttgcaaaaat ccgtccccgg ttcgccatga 540

aatgctgatt ttgatcgaat ctttgcgcta actgtagggc gggttcaggg ggtgaatgca 600

ccacgagcaa cccgaagggt gcgaagtggg cattcgtaga acaatcccag aggaaagccg 660

tacggctttc ctcgacatga tcaatcaagg tatgtcaggt cttgctgcgt ctacagcggt 720

cggggtcagt gaattcaccg ggcgaaagtg ggcgaaggcc gccggggtga aactgacccg 780

cggcccgcga ggtggcaatg cttttgacac cgccgagaaa cttgagattg cagccagcat 840

gctagagaaa ggatgcctac cccgagaaat cggcgagtat gtcggcatga ctcgggccaa 900

tatatcccta tggcgcaaac aaggcccaga caagcttcgc caacgcgcag ccaccttgcg 960

caccggcaag cgagcagctg aattcatcca cgccccggtg atgggccctt attatgggcc 1020

acgcacactc catcaagtgt tgcgtgagga ctacacaaca ctgtttgacg agttatctgc 1080

gttggggttg ccagcacagg tgtgtggggc cttacttcat cttgctccac caccatcatt 1140

acgcttttct tatatgtcgt gtgtagtgcc gttatttgct gatgaaatca aagtcgtagg 1200

acaaggcaca cgattatcgt tagaagagaa aatgatgatc caacgtttcc atgacaccgg 1260

ggtcagtgca gcagaaatcg gtcgacgcct gggtcggtgt cggcaaacaa tttccaggga 1320

acttcgacgt ggtcaagatg atgatggacg ttatcgtgca cgcgactcct atgaaggtgc 1380

gatcaggaaa ctagcgcgtc cgaaaacacc gaaacttgat gccaatcgta ggcttcgggc 1440

tgtggtggtc gaggcgttga ataataaatt atctccggag cagatttctg gtcttttagc 1500

caccgagcat gctaacgata gctctatgca gattagtcat gaaactattt accaggcgtt 1560

atatgttcaa ggtaaagggg cgttgcgtga tgaattgaag gtggagaaat ttcttcgtac 1620

cggtcggaag ggacgtaaac cgcagtcgaa gttgccatcg agaggtaagc cgtgggtgga 1680

gggtgcgttg attagtcaac gcccagcaga agttgctgat cgtgctgtgc ctgggcactg 1740

ggagggcgat ttagtaattg gtggtgaaaa ccaagcgaca gcgttggtga cgttggtgga 1800

gcgcacgagc cggttgacgt tgattaagcg gttgggggtt aatcatgagg cgtcgactgt 1860

gacggatgcg ttggtggaga tgatgggtga tttgccgcag gcgttgcgtc ggagtttgac 1920

gtgggatcag ggtgtggaga tggcagagca tgcgcggttt agcgtggtga ccaagtgtcc 1980

ggtgtttttc tgtgatcctc attcgccgtg gcagcgtggg tcgaatgaga atacgaatgg 2040

attggtcagg gattttttcc cgaagggcac taattttgct aaagtaagtg acgaagaagt 2100

tcagcgggca caggatctgc tgaattaccg gccgcggaaa atgcatggtt ttaaaagcgc 2160

gacgcaggta tatgaaaaaa tcgtagttgg tgcatccacc gattgaattc gcctaggaga 2220

ttgtacgaaa attcgttcgg ctttcggatt tcctggcgat ctgagacgag aagttgaaca 2280

gctaacctgc agaaaccttg caagaatcac aacagcccca atggcctcaa aagtcacgcc 2340

ctcagaatcg ctgccaggcg tctaaatccc ctaaaacggg acaataggtc actgggcgat 2400

cccaagccct taaaacgtga tccttaaata cccactgtcc tctattctgg gttaggcttc 2460

actgggtaaa agtgcctgcc tatgcctgaa acttgagcat ggcaacagca aggagacacc 2520

gtgggaaaac atgcagctga aacatcggaa ccgaagaaaa attcaccgtg gcgcattggt 2580

ttgttgacgt ttttgatttc ttcagttgtc gtgacgctgg tgggcatggt gatgctgtgg 2640

ccggattctg atgatgtggt gttggcggat aacttttcgc agacgtttgc gggaaatcat 2700

gagcaggtgg atggaacgat cacgctcgtt gataattctg cgtgtaattc gccagacacc 2760

ggccgagttt ttgcggaaag ccccacgatt tctgcggagc cggcaacgtt ggagtgcgtg 2820

cgtgcactcg tagacatcac atcgggtgcc aatgaggggc agaaaactca gctgatcact 2880

tacgcgcaac ctggtgatcc ggagttttcc gagggcgaca agatccgcat ggtggaaaca 2940

ccggatacaa atggcgagat catctacacc tttgctgatt accagcgcgg accggcgttg 3000

atcatttggg gtgtggttct cattgtggcg atgggagctt tcgcggcgtg gcgaggtgtg 3060

cgtgcgctgg ttggtttggt cgtcaccttg ggaattgttg gtattttctt gctgccagga 3120

ttggccagcg ggcacgatgc gatgtggttg gcgctggtgt gtggcgcggc gatcttgttg 3180

attgtggtgc cgatggttca cggaatcaac tggaaatcgg cagctgcgtt ggcgggcacg 3240

ctggtggcat tgttgttgtc g 3261

<210> 50

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 50

gtacccgggg atcctctaga cctgggtaac ttcctgtcca 40

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 51

caggttagca gtacttctca agtttctcgg cggtg 35

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 52

aacttgagaa gtactgctaa cctgcagaaa ccttg 35

<210> 53

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 53

gcctgcaggt cgactctaga ctccgcagaa atcgtggggc 40

<210> 54

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 54

cgccgagaaa cttgagaagt ggcgcttcat gtcaa 35

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 55

ctgcaggtta gcagtttagt caaggccccg caaca 35

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 56

ctgcaggtta gcagttcaca agctgttaag cgaag 35

<210> 57

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 57

ctgcaggtta gcagttcaga tcaccgcgag cgcct 35

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 58

ttctccgtgc cgagaaaatc 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 59

gtagatgatc tcgccatttg 20

<210> 60

<211> 394

<212> PRT

<213> Chromobacterium violaceum

<400> 60

Met Ala Ser Asp Ala Pro His Leu Pro Leu His Pro Glu Thr Leu Ala

1 5 10 15

Ile Arg Ala Gly Leu Glu Thr Ser Gln Phe Asn Glu His Ser Gln Gly

20 25 30

Leu Phe Leu Thr Ser Ser Phe Thr Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Ala Ala

35 40 45

Ala Met Phe Leu Gly Glu Ile Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Phe Thr

50 55 60

Asn Pro Thr Val Ala Ala Phe Gln His Arg Leu Ala Gln Met Glu Gly

65 70 75 80

Gly Glu Arg Ala Ile Ala Thr Ala Thr Gly Met Ala Ala Ile Gln Ala

85 90 95

Ile Met Met Thr Leu Leu Gln Ala Gly Asp His Ile Val Ser Ser Gln

100 105 110

Ser Leu Phe Gly Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ala Asn Gln Leu Ala Lys

115 120 125

Phe Ala Val Ala Thr Asp Phe Val Asp Ala Arg Asp Leu Ser Ala Trp

130 135 140

Arg Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Leu Leu Phe Leu Glu Thr Pro

145 150 155 160

Ser Asn Pro Leu Thr Glu Val Ala Asp Ile Ala Ala Ile Ala Asp Ile

165 170 175

Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Cys Ser

180 185 190

Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Met His

195 200 205

Ser Ala Thr Lys Phe Ile Asp Gly His Gly Arg Val Met Gly Gly Ala

210 215 220

Val Val Gly Ser Asp Lys Leu Val Glu Gln Val Tyr Leu His Val Arg

225 230 235 240

Ala Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro Phe Asn Ala Trp Thr Leu Leu Ser

245 250 255

Gly Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Glu Lys His Ser Ala Asn Ala

260 265 270

Leu Glu Leu Ala Arg Trp Leu Glu Ala Gln Pro Asn Val Glu Arg Val

275 280 285

Tyr Tyr Pro Gly Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Leu Arg

290 295 300

Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ala Val Val Ser Phe Val Val Lys Gly Gly

305 310 315 320

Arg Lys Ala Ala Trp Lys Val Val Asp Ala Val Arg Val Ile Ser Arg

325 330 335

Thr Ala Asn Leu Gly Asp Val Lys Thr Thr Leu Thr His Pro Ala Ser

340 345 350

Thr Thr His Ala Arg Val Thr Gln Glu Ala Arg Glu Arg Ala Gly Ile

355 360 365

Val Glu Gly Leu Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Glu Asn Val Arg Asp

370 375 380

Leu Gln Gln Asp Leu Leu Arg Gly Leu Asp

385 390

<210> 61

<211> 399

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Hyphomonas neptunium

<400> 61

Met Ala Asp Ala Pro Gly Gly Asp Lys Lys Gly Trp Lys Pro Ala Thr

1 5 10 15

Gln Ala Val Arg Gly Gly Leu Met Arg Ser Gln His Gly Glu Ile Ser

20 25 30

Glu Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Ala Tyr Asp Ser Ala Glu Gln

35 40 45

Ala Met Arg Arg Met Ala Gly Glu Glu Glu Gly Phe Val Tyr Ser Arg

50 55 60

Tyr Gly Ser Pro Thr Asn Glu Met Leu Gln Gln Arg Leu Ala Leu Ile

65 70 75 80

Glu Gly Ala Glu Ala Cys Arg Val Thr Gly Ser Gly Met Gly Ala Ile

85 90 95

Ser Ser Ala Ile Leu Ala Pro Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val Ala

100 105 110

Ala Thr Ala Leu Phe Gly Ser Cys Arg Trp Ile Ile Ala Asn Gln Met

115 120 125

Pro Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val Phe Val Asp Gly Ala Asp Leu Asp

130 135 140

Ala Trp Lys Arg Glu Ile Asp Lys Gly Cys Gln Leu Val Leu Ile Glu

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asn Pro Leu Leu Asp Gly Val Asp Ile Glu Ala Val Ala

165 170 175

Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Val Phe

180 185 190

Ala Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Met Gly Ala Asp Val Ile

195 200 205

Ala Tyr Ser Ala Thr Lys His Met Asp Gly Gln Gly Arg Val Leu Leu

210 215 220

Gly Ala Ile Leu Thr Asp Ala Lys Arg Met Ser Asp Val Tyr Asp Pro

225 230 235 240

Trp Leu Arg His Met Gly Pro Ala Ala Ser Pro Phe Asn Ala Trp Val

245 250 255

Val Leu Lys Gly Leu Glu Thr Met Gln Leu Arg Val Glu Ala Gln Ser

260 265 270

Arg Thr Ala Ala Arg Leu Ala Asp Val Leu Ala Asp His Pro Ala Val

275 280 285

Asn Ala Val Arg Tyr Pro His Arg Lys Asp His Pro His Tyr Glu Val

290 295 300

His Lys Arg Gln Met Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Ala Leu Ser Leu

305 310 315 320

Lys Gly Gly Gln Asp Ala Ala Phe Arg Phe Leu Asn Gly Leu Gln Leu

325 330 335

Val Asp Ile Cys Asn Asn Leu Gly Asp Thr Lys Ser Leu Ala Cys His

340 345 350

Pro Ser Thr Thr Thr His Arg Ala Leu Ser Asp Glu Asp Gln Ala Ala

355 360 365

Met Gly Leu Asp Arg Ser Trp Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp

370 375 380

Ala Asp Asp Leu Glu Ala Asp Leu Leu Ala Ser Leu Asn Ser Leu

385 390 395

<210> 62

<211> 393

<212> PRT

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 62

Met Thr Lys Asp Trp Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ser Gln Tyr Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln

20 25 30

Gly Phe Val Tyr Asp Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu

35 40 45

Thr Gly Ala Asp Glu Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr

50 55 60

Arg Met Phe Glu Glu Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala

65 70 75 80

Phe Ala Thr Ala Ser Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser

85 90 95

Ile Val Arg Ala Gly Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly

100 105 110

Ser Cys Ile Tyr Ile Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu

115 120 125

Val Thr Phe Val Asp Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val

130 135 140

Arg Pro Gly Thr Lys Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr

145 150 155 160

Leu Glu Val Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val

165 170 175

Gly Ala Leu Val Ile Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser

180 185 190

Thr Ala Val Arg Gln Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys

195 200 205

His Ile Asp Gly Gln Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser

210 215 220

Gln Ala Phe Ile Arg Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly

225 230 235 240

Gly Ser Met Ser Pro Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala

245 250 255

Thr Leu Asp Leu Arg Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile

260 265 270

Ala Arg Ala Leu Glu Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro

275 280 285

Ala Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu

290 295 300

Arg Pro Gly Thr Met Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala

305 310 315 320

Ala Phe Arg Phe Leu Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn

325 330 335

Leu Gly Asp Ala Arg Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His

340 345 350

Gln Arg Leu Ser Asp Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly

355 360 365

Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala

370 375 380

Asp Leu Lys Gln Ala Leu Ala Val Ile

385 390

<210> 63

<211> 1185

<212> DNA

<213> Chromobacterium violaceum

<400> 63

atggcatccg acgcgccgca tcttccgctg caccctgaaa ccctggccat ccgggccggg 60

ttggaaacca gccagttcaa cgagcacagc cagggcctgt tcctgacgtc cagcttcacc 120

tacgaatcgg ccgcgcaggc ggcggcgatg ttcctgggcg agatcgacgg ctacacctat 180

tcccgcttca ccaatccgac cgtcgccgcg ttccagcata ggctggcgca gatggagggc 240

ggggagcgcg ccatcgccac cgccaccggc atggcggcga tccaggccat catgatgact 300

ttgctgcagg ctggcgacca catcgtgtcg tcgcaaagcc tgttcggctc caccaccaat 360

ctgttcgcca accagttggc caagttcgcc gtggccaccg acttcgtcga cgcgcgcgac 420

ctgtccgcct ggcgggaggc gctgcggccg aacaccaagc tgctgttcct ggagacgccg 480

tccaatccct tgaccgaagt ggccgacatc gcggccatcg ccgacatcgc ccacgcgcat 540

ggcgcgctgc tggtggtgga caacagcttc tgttcgccgg ccttgcagca gccgttgaaa 600

ctgggcgccg atctggtcat gcattccgcc accaagttca tcgacggcca tggccgggtg 660

atgggcgggg cggtggtcgg cagcgacaag ctggtcgagc aggtctattt gcacgtgcgc 720

gccgccggtc cctcgctggc gccgttcaat gcctggacgc tgctgtccgg tttggagacg 780

ctgcacctgc ggatggagaa gcacagcgcc aacgcgctgg agctggcgcg ctggctggag 840

gcgcagccca atgtggagcg cgtctattac ccgggcctgg agagccaccc ccagcacgag 900

ctggcgctgc gccagcagaa gagcggcgga gcggtggtgt ccttcgtggt caagggcggc 960

cgcaaggccg cgtggaaagt ggtggacgcg gtcagggtga tctcgcgcac cgccaatctg 1020

ggcgatgtga aaaccaccct cactcatccg gccagcacca cccacgcccg cgtgacgcag 1080

gaggcgcgcg agcgcgccgg catcgtcgag gggctgttgc gcgtcagcgt cggcctggaa 1140

aatgtacggg accttcaaca agatctgttg cggggccttg actaa 1185

<210> 64

<211> 1200

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> Hyphomonas neptunium

<400> 64

atggcggatg cacccggcgg cgacaagaag ggctggaagc ctgcgaccca ggcggtacgc 60

ggcggcctga tgcggtccca gcatggggag atttccgagg cgctgtatct gacctccggc 120

tacgcttacg actcggccga gcaggcgatg cgccggatgg cgggcgagga agaaggcttc 180

gtctattccc gctatggcag cccgaccaat gagatgctgc aacagcgcct cgcgctgatt 240

gaaggcgccg aagcgtgccg ggtgacgggc tctggcatgg gcgcgatttc gtcggccatc 300

ctggcgccgc ttaaagcggg cgaccgggtg gtggcggcga ccgcgctgtt tggctcgtgc 360

cgctggatca ttgccaacca gatgccgaag tttggcatcg aggcagtgtt cgtggacggg 420

gccgatcttg atgcttggaa gcgcgagatc gacaagggct gccagctggt gctgatcgaa 480

agcccggcca atccgttgct cgacggcgtg gacatcgaag cggtcgccag gctcgccaag 540

gcggcgggcg cgctgctggt ggtggacaat gtgtttgcca cgccggtgct tcagcggccg 600

ctggaaatgg gcgccgatgt gatcgcctat tcggccacca aacatatgga cgggcagggc 660

cgcgttctgc tgggcgcgat cctgacggac gccaagcgga tgagtgatgt gtatgatccg 720

tggctgcgcc atatggggcc ggcggcctcg ccgtttaacg cctgggtagt gctgaagggc 780

cttgagacga tgcagctgcg cgtggaagcg cagagccgca cggcggcgcg gctggcggat 840

gttctggccg atcatccggc ggtcaatgcc gtgcgctatc cccaccgcaa ggatcacccg 900

cattatgagg tgcacaagcg ccagatgaaa tcgggcggca cgctgctcgc gctgtcgctc 960

aagggcgggc aggacgcggc gttccgcttc ctcaacgggc tgcagctggt cgacatctgc 1020

aacaaccttg gcgatacgaa atcgctggcc tgtcatccct ccaccacgac gcaccgcgcg 1080

ttgagtgatg aggatcaggc ggcgatgggg cttgaccgca gctgggtccg gctctctgtt 1140

ggtcttgaag acgcagatga tctggaagct gatcttctcg cttcgcttaa cagcttgtga 1200

1200

<210> 65

<211> 1182

<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 65

atgacgaagg actggaagac aaggacgcaa ctcgtccacg ggggcagccg ccggagccag 60

tatggcgaaa tggccgaggc gatcttcctg acccagggct tcgtctacga ctcggccgaa 120

caggccgaag cgcgcttcat cgagaccggc gccgacgaat tcatctatgc ccgctacggc 180

aaccccacga cgcgcatgtt cgaagagcgc atcgcggccg tcgagggcac cgaggatgcg 240

ttcgccaccg cctcgggcat ggccgcgatc cacggcgtgc tcacctcgat cgtgcgggcg 300

ggcgatcatc tggtggcggc gcgcgctctg ttcggctcct gcatctacat cctcgaggag 360

gtgctgggcc gattcggcgt cgaggtgacc ttcgtcgacg gcaccgatct cgatcagtgg 420

cgcgcggcgg tgcggcccgg cacgaaggcc gtgttcttcg agtcggtctc gaatccgacg 480

ctcgaggtgg ccgatatcgg cgccatcgcc gagatcgccc atgccgtggg cgcgctcgtc 540

atcgtggaca atgtcttcgc gacgcccgtc ttctcgacgg cggtgcggca gggcgcggat 600

gtggtgatct attcggccac caagcacatc gacgggcaag ggcgcgcgct cggcggcgtg 660

gtctgcgcct cgcaggcctt catccgcaag gtgctcgaac ccttcatgaa gcacaccggc 720

ggctcgatga gccccttcaa cgcctggctc atgctgaacg ggatggcgac gctcgacctg 780

cgctgccgcg cgatggccga cacggccgag aagatcgccc gcgcgctcga gggccatccg 840

cagctcggcc gcgtgatcca tcccgcgctg gaaagccacc cgcagcacga gatggccaag 900

gcgcagatgg agcgtcccgg cacgatgatc gcgctcgacc tcgccggggg caaggaggcg 960

gccttccgct tcctcgacgc cctgaggatc gtgaagatct ccaacaatct gggcgatgcc 1020

cgctcgatcg cgacccaccc ggcaacgacc acccaccagc gtctttccga cgcgcagaag 1080

gcccatctcg gcatcacgcc cgggctcgtg cggctgtcgg tggggctcga ggatgcggac 1140

gacctgatcg ccgatctgaa acaggcgctc gcggtgatct ga 1182

<210> 66

<211> 404

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RspmetZ_long

<400> 66

Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

385 390 395 400

Leu Ala Val Ile

<210> 67

<211> 404

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RspmetZ_3

<400> 67

Met Gly Asn Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

385 390 395 400

Leu Ala Val Ile

<210> 68

<211> 404

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RspmetZ_65

<400> 68

Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Tyr Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

385 390 395 400

Leu Ala Val Ile

<210> 69

<211> 404

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RspmetZ_104

<400> 69

Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Ala Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

385 390 395 400

Leu Ala Val Ile

<210> 70

<211> 404

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RspmetZ_196

<400> 70

Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Ile Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

385 390 395 400

Leu Ala Val Ile

<210> 71

<211> 404

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RspmetZ_3_65_104

<400> 71

Met Gly Asn Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Tyr Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Ala Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

385 390 395 400

Leu Ala Val Ile

<210> 72

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 72

atcaaaacag atatcatggg tatcgcgttt cgtga 35

<210> 73

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 73

ccttcacgaa acgcgttacc catgatatct g 31

<210> 74

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 74

cagatatcat gggtaacgcg tttcgtgaag g 31

<210> 75

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 75

tagcgggcat agatgtattc gtcggcgccg g 31

<210> 76

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 76

ccggcgccga cgaatacatc tatgcccgct a 31

<210> 77

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 77

acgatcgagg tgagcgcgcc gtggatcgcg g 31

<210> 78

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 78

ccgcgatcca cggcgcgctc acctcgatcg t 31

<210> 79

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 79

cgggcgtcgc gaagatattg tccacgatga c 31

<210> 80

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 80

gtcatcgtgg acaatatctt cgcgacgccc g 31

<210> 81

<211> 5803

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pDCM2

<400> 81

gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60

ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120

tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180

agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300

tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 360

cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420

tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 960

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1140

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1200

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1260

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1320

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1380

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560

tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620

cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680

tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740

ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800

gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860

ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920

acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980

gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040

ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100

taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt 2160

tatcgagatt ttcaggagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 2220

ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 2280

ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 2340

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 2400

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 2460

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 2580

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 2700

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760

tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820

gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880

ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940

ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000

aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060

gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg 3120

acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180

ggcggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca 3240

gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300

gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg 3360

ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt 3420

ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc 3480

gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540

ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca 3600

gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc 3660

agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720

tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780

gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt 3840

ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa 3900

cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg 3960

tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga 4020

tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg 4080

atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc 4140

caaacgtcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa 4200

acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata 4260

tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga 4320

gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac 4380

tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt 4440

ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata 4500

tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560

ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620

gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680

ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740

gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800

tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920

gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980

agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040

acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100

gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220

ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280

agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340

aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400

ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460

cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520

acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 5580

attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640

gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700

cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760

ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения L-метионина, включающий культивирование микроорганизма, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, в среде, содержащей тиосульфат. Также предложена композиция для получения L-метионина, содержащая микроорганизм, продуцирующий L-метионин, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, и тиосульфат. Изобретение обеспечивает повышение выхода метионина. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 17 табл., 10 пр.

1. Способ получения L-метионина, включающий культивирование микроорганизма, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, в среде, содержащей тиосульфат.

2. Способ получения L-метионина по п. 1, где белок обладает активностью O-ацилгомосеринтранссульфуразы.

3. Способ получения L-метионина по п. 1, где белок имеет происхождение из Chromobacterium violaceum, Hyphomonas neptunium или Rhodobacter sphaeroides.

4. Способ получения L-метионина по п. 1, где белок включает любой один или более чем один белок, выбранный из группы, состоящей из полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 60, 61 и 62 и полипептидных последовательностей, гомологичных или идентичных SEQ ID NO: 60, 61 и 62 на 90% или более.

5. Способ получения L-метионина по п. 1, где микроорганизм включает одну или более чем одну генетическую модификацию, выбранную из группы, состоящей из ослабления или инактивации активности цистатионингаммасинтазы, ослабления или инактивации активности O-ацетилгомосеринсульфгидрилазы, ослабления или инактивации активности белка-репрессора биосинтеза метионина-цистеина, повышения активности метионинсинтазы и повышения активности сульфитредуктазы.

6. Способ получения L-метионина по п. 1, где микроорганизм представляет собой микроорганизм рода Corynebacterium.

7. Способ получения L-метионина по п. 6, где микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum.

8. Способ получения L-метионина по п. 1, включающий выделение L-метионина из микроорганизма или среды.

9. Композиция для получения L-метионина, содержащая микроорганизм, продуцирующий L-метионин, в который введен белок, кодируемый чужеродным геном metZ, и тиосульфат.