Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP вируса Марбург в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и рекомбинантный белок GP-MARV, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-GP-MARV и используемый для получения иммунобиологических препаратов Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 C12N15/79 C12N15/85 C07K14/07 

Область техники

Изобретение относится к интегративному плазмидному вектору pVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающему экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP вируса Марбург (MARV) в эукариотической системе клеток млекопитающих, штамму рекомбинантной клеточной линии СНО-K1-GP-MARV и рекомбинантному белку GP-MARV, продуцируемому указанной клеточной линией СНО-GP-MARV и может быть использовано в области генной инженерии и биотехнологии.

Рекомбинантный поверхностный гликопротеин GP-MARV может служить для создания диагностикумов геморрагической лихорадки Марбург, а также для решения лабораторных задач, таких как получение фаговых библиотек.

Интегративный плазмидный вектор PVEAL3- GP-MARV-Trim депонирован в коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Уровень техники

Геморрагическая лихорадка Марбург - острое природно-очаговое заболевание, характеризующееся тяжелым течением, геморрагическим синдромом, высоким уровнем контагиозности и летальности [Siegert R.,Shu H.L., Slenczka W. Peters D, Müller G. On the etiology of an unknown human infection originating from monkeys. DMW. 1967; 92 (51):2341-3].

Периодически возникающие эпидемии в Западной Африке указывают важность разработки вакцин и профилактических препаратов против заболеваний, вызванных филовирусами, для общественного здравоохранения. Вакцина против филовирусных инфекций, прежде всего, нужна исследователям и врачам, непосредственно имеющих контакт с вирусом [Hensley L.E., Jones S.M., Feldmann H., et al. Ebola and Marburg viruses: pathogenesis and development of countermeasures // Curr. Mol. Med. - 2005. - V. 5. - №8. - Р.761-762].

В настоящее время не существует терапевтических препаратов или вакцин, одобренных для лечения или профилактики геморрагической лихорадке, вызванной вирусом Марбург. Поддерживающая терапия остается единственным одобренным медицинским вмешательством для инфицированных лиц. Поэтому существует необходимость иметь безопасную и эффективную вакцину или противовирусные препараты, которые можно было бы использовать для защиты медицинских работников и других лиц из группы риска.

Основные усилия разработчиков вакцин против болезней, вызванных филовирусами, сосредоточены на использовании в качестве антигена GP, так как он содержит иммуногенные эпитопы [Hevey M., Negley D., VanderZanden L., et al. Marburg virus vaccines: comparing classical and new approaches // Vaccine. - 2001. - V.20. - № 3. - P. 586-593], которые являются мишенью нейтрализующих антител (NAbs) вирус. Наличие гуморального иммунного ответа, направленного на GP, является основным элементом защиты организма [Ascenzi P., Bocedi A., Heptonstall J., et al. Ebolavirus and Marburgvirus: insight the Filoviridae family // Molecular aspects of medicine. - 2008. - V. 29. - №. 3. - P. 151-185]. GP единственный поверхностный белок MARV, тримеры которого образуют шипы на поверхности вириона, которые прикрепляются к клетке, с помощью него РНК MARV проникает в чувствительные клетки. Поэтому основным и важным компонентом любой кандидатной вакцины против MARV, является высокогликозилированный гликопротеиновый комплекс GP, представленный на поверхности вириона [Волкова Н.В., Казачинская Е.И., Щербаков Д.Н. Экспериментальные вакцины для профилактики геморрагической лихорадки Марбург и биомодели для изучения ее патогенеза. Проблемы особо опасных инфекций. 2018;(3):8-15]. Важным фактором для получения GP MARV является выбор системы экспрессии. Наиболее перспективными являются клетки млекопитающих, поскольку позволяют получать целевой белок в наиболее близкой к нативной форме, т.е. прошедший необходимые пострансляционные модификации, что весьма важно для иммуногенности рекомбинантного белка.

Ближайшие аналоги

Предыдущие попытки получить стабильный гликопротеин MARV были раскрыты, например, в международных заявках на патент WO/2017/037196, в которой были описаны определенные стабилизирующие мутации гликопротеина филовируса. Отличием от нашего изобретения является система экспрессии тримера гликопротеина. В данной заявке тримеризованные варианты были получены в клетках млекопитающих Expi293.

Известно изобретение по патенту RU 2752858, МПК С12N 15/74, опубл. 11.08.2021 г. В данном патенте используется наиболее близкий интеграционный вектор pVEAL2 для создания стабильного продуцента вирусного белка RBD SARS-CoV-2 c использованием клеточной линии CHO-K1.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является стабилизированный тример гликопротеина вируса Марбург (патент США №11603390, МПК C07К 14/08, опубл. 14.03.2023 г.). В изобретении предусмотрены филовирусные гликопротеиновые мутации, стабилизирующие тримерную форму гликопротеина. Гликопротеин GP MARV TRIM имеет определенные аминокислотные замены в определенных позициях в последовательности указанного гликопротеина. GP MARV TRIM, описанный в описании изобретения, имеет улучшенный процент образования тримера и/или улучшенный выход тримера по сравнению с гликопротеином, который не имеет одной или нескольких из указанных аминокислотных замен. Также представлены молекулы и векторы нуклеиновых кислот, кодирующие гликопротеин GP MARV TRIM. Плазмидный вектор представляет аденовирусный вектор. Клетка-хозяин содержит молекулу нуклеиновой кислоты или аденовирусный вектор. В качестве клетки-хозяина используют линию клеток человека Expi293.

Однако все еще имеется необходимость в получении тримеров гликопротеина вируса Марбург GP MARV TRIM в более корректной форме для расширения спектра средств профилактики и диагностики указанного вируса.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной конструкции и нового рекомбинантного штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка, продуцирующего поверхностный гликопротеин GP MARV в более корректной форме и способного взаимодействовать с антителами иммунизированного животного.

Технический результат достигается созданием интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающего экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP MARV в клетках млекопитающих, имеющего размер 5919 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 и содержащего в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:

- 5'ITR_SB, имеющий координаты с 88 по 317 п.н.;

- Плечо интеграции 5'IFR, имеющий координаты с 318 по 368 п.н.;

- CMV enhancer, имеющий координаты с 369 по 733 п.н.;

- CmV promoter, имеющий координаты с 734 по 937 п.н.;

- Ген GP-MARV-Trim, имеющий координаты с 1033 по 2442 п.н. и кодирующий поверхностный гликопротеин GP MARV;

- Foldon, имеющий координаты с 2443 по 2523 п.н.;

- Последовательность 10his, имеющий координаты с 2524 по 2553 п.н. и являющийся полигистидиновым тэгом для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии;

- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющий координаты с 2603 по 3177 п.н.;

- BleoR - ген устойчивости к антибиотику блеомицину, имеющий координаты с 3182 по 3189 п.н.;

- PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты с 3190 по 3789 п.н.;

- T3 promoter, имеющий координаты с 3799 по 3806 п.н.;

- SV40 poly(A) signal, имеющий координаты с 3824 по 3945 п.н.;

- Плечо интеграции 3'IFR, имеющий координаты с 3969 по 4016 п.н.;

- 3'ITR_SB, имеющий координаты с 4017 по 4246 п.н.;

- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты с 4433 по 5248 п.н.;

- Участок начала репликации Ori, имеющий координаты с 5311 по 5898 п.н.

Технический результат был достигнут также созданием штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, полученного путем трансфекции клеток экспрессионным вектором PVEAL3-GP-MARV-Trim по п. 1 и продуцирующего поверхностный гликопротеин GP MARV.

Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный белок GP MARV (поверхностный гликопротеин), продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, молекулярную массу 162 кДа и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.

Для разработки продуцента была выбрана клеточная линия СНО-К1, поскольку экспресcионная система позволяет получать наиболее корректную форму белка, обеспечивая все необходимые процессы посттрансляционной модификации. Для получения эффективной культуры-продуцента в заявленном изобретении проведен отбор наиболее продуктивных клонов. Это дополнительно увеличивает выход целевого продукта, поскольку поликлональная клеточная культура содержит клоны с разной способностью к продукции рекомбинантного белка. Описан способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV продуцента рекомбинантного поверхностного гликопротеина MARV, содержащего генетическую конструкцию (SEQIDNO:1), введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток проводили при помощи антибиотика Puromycin B.

Таким образом, заявляемая группа изобретений обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка GP MARV в иммунологически корректной форме, что является хорошей платформой для создания иммунобиологических препаратов и вакцин. Технические решения соответствуют критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Осуществление изобретения

Описание фигур

Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1 - 6.

На фиг. 1 изображена физическая и генетическая карта универсального интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim.

На фиг.2 представлено электрофоретическое разделение образца культуральной жидкости, содержащей тримеризованный рекомбинантный белок GP-MARV, в 15%-ном ПААГ-SDS.

Примечание:

1 - белковые маркеры молекулярной массы (кДa);

2 - образец культуральной жидкости, содержащей тримеризованный рекомбинантный белок GP-MARV.

На фиг. 3 представлены результаты иммуноферментного анализа взаимодействия отобранных клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с моноклональным антителом MR191 против MARV.

Примечание: MR191 - человеческое моноклональное антитело против MARV, ранее описанное в статье King L.B., Fusco M.L., Flyak A.I. et al. The Marburgvirus-Neutralizing Human Monoclonal Antibody MR191 Targets a Conserved Site to Block Virus Receptor Binding // Cell host & microbe. - 2018. - V. 23. - №. 1. - P. 101-109, полученное в отделе биоинженерии.

В качестве отрицательного контроля использовали тримеризованный вариант RBD поверхностного белка S SARS-CoV-2, полученный в отделе биоинженерии. В качестве положительного контроля использовали вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности поверхностный гликопротеин MARV, полученные в отделе биоинженерии.

На фиг. 4 представлены результаты исследования антигенности тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с помощью дот-блот анализа. В качестве положительного контроля использовали вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности поверхностный гликопротеин MARV, полученные в отделе биоинженерии.

На фиг. 5 приведена нуклеотидная последовательность интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, а на фиг. 6 - аминокислотная последовательность поверхностного гликопротеина GP MARV.

В таблице 1 представлены последовательности синтезированных олигонуклеотидов, использованных для получения плазмиды PVEAL3-GP-MARV-Trim.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K. et al. Science. 1988, 239(4839):487-491; Sanger F. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74:5463-5467].

Пример 1. Конструирование интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающего экспрессию поверхностного гликопротеина GP MARV

Для получения тримеризованного варианта GP MARV взята нуклеотидная последовательность, кодирующая гликопротеин GP MARV, из базы данных GenBank (CAA82539.1). Далее была проведена кодон - оптимизация под клеточную линию яичников китайского хомячка СНО-K1 в онлайн сервисе https://www.thermofisher.com для увеличения выхода целевого белка. Синтез праймеров (табл. 1) и нуклеотидной последовательности, кодирующей тример GP MARV, был осуществлен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).

В состав вектора PVEAL3 была клонирована искусственно синтезированная последовательность, кодирующая тримеризованный вариант GP MARV (фиг.1). Последовательности синтезированных праймеров, использованных для сборки интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Последовательности синтезированных олигонуклеотидов, использованных для получения интегративного плазмидного вектора PVEAL3-GP-MARV-Trim Название Последовательность F-GP 5’- aaaaaagctagGCTAGCGCCACCATGAAGAC -3’ R-GP 5’-aaaaaaGTCGACTTAATGGTGATGGTGGT -3’

С помощью ПЦР была амплифицирована нуклеотидная последовательность GP-MARV-Trim, кодирующая тримеризованный гликопротеин GP MARV. ПЦР проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл, содержащая 2 мкг ДНК (плазмида pGH-GP-MARV-Trim), 10 пкМ каждого праймера (F-GP и R-GP) (таблица 1), 10 мкл 5х Q5 реакционного буфера, 10 мкл 5хQ5 High GC Enhancer, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 0.5 ед. Q5 High-Fidelity ДНК-полимеразы, реакцию осуществляли при следующих параметрах: 10с - 98°С (1 цикл), 10 с - 58°С, 70 с - 72°С (30 циклов). Готовый ПЦР-продукт был выделен и очищен из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Предварительно наработанную и очищенную плазмиду PVEAL3 и ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AsuNHI и SalI. Реакцию гидролиза проводили в условиях, рекомендованных производителем. С целью очистки линеаризованного вектора, плазмидную ДНК наносили на 1%-й агарозный гель и выделяли из геля с использованием набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакция проводилась при +4°С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамм Neb Stable.

Первичную проверку на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл).

Положительные колонии, культивировали в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNAminikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Первичную структуру экспрессионного вектора подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате был получен интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 (фиг. 3) и обеспечивающий экспрессию белка тримеризованного поверхностного гликопротеина GP MARV.

Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемых генов (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена целевая плазмидная ДНК.

Пример 2. Трансфекция клеток CHO-K1 интегративным плазмидным вектором PVEAL3-GP-MARV-Trim, получение штамма-продуцента клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, продуцирующего тримеризованный поверхностный гликопротеин GP MARV

Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, получен на основе клеточной линии яичников китайского хомячка СНО-K1 с использованием разработанной конструкции PVEAL3-GP-MARV-Trim. Cуспензию клеток CHO-K1, растили в инкубаторе при 5% содержания CO₂, 80%-ной влажности температуре (37±1)°С во влажной атмосфере 5% СО₂ и скорости вращения платформы 185 об/мин. При достижении плотности суспензии 5х10⁶ клеток/мл проводили трансфекцию клеток с помощью полиэтиленамина (PEI 25K™) в соответствии с инструкцией производителя. Трансфецировали клетки смесью плазмид PVEAL3-GP-MARV-Trim и pCMV(CAT)T7-SB100, взятых в соотношении 1:10. Через 48 часов после трансфекции добавляли селективный антибиотик пуромицин в концентрации 2 мкг/мл. Cелекцию проводили в течение 12 суток с постепенным увеличением концентрации антибиотика с 2 до 10 мкг/мл. Полученный пул клеток был криоконсервирован, после чего было проведено клонирование с целью отбора индивидуальных клонов с высокой продукцией. Клонирование выполнялось методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах. Через 14 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон, для которых проводили отбор культуральной жидкости с целью оценки продуктивности клонов при помощи ИФА, из которых и получен заявляемый рекомбинантный штамм CHO-K1-GP-MARV.

Характеристика рекомбинантного штамма CHO-K1-GP-MARV.

Морфология: веретеновидные и эпителиоподобные клетки с круглыми ядрами, содержащими от 1 до 2 ядрышек.

Способ культивирования: суспензионный.

Среда для культивирования: 97% питательная среда HyCell CHO, 2% Glutamax, 1% Pluronic-F68.

Температура культивирования: 37°С.

Посевная концентрация: 1x10⁶ клеток в 1 мл.

Частота пассирования: 3-4 суток.

Условия криоконсервации: питательная среда DМЕМ/F-12 (1:1) - 50 %, сыворотка крови плодов коровы - 40 %, ДМСО - 10 %.

Режим замораживания: при температуре 4°С - 1 ч, минус 80°С - 12 ч, минус 196°С.

Условия хранения: в криопробирках в количестве 5 шт. хранится в жидком азоте при температуре минус 196°С.

Номер пассажа в жидком азоте: 3.

Жизнеспособность после криоконсервации: 85-90 %.

Пример 3. Очистка тримеризованного варианта поверхностного гликопротеина GP MARV

Тримеризованный рекомбинантный белок GP MARV выделяли из культуральной среды с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии с использованием сорбента Ni-IMAC сефарозы (GE Helthcare, США). Связывание белка с колонкой происходило при скорости 1,5 мл/мин. Промывку колонки от не связавшихся белков проводили пятикратным объемом промывочного буфера (40 мМ имидазола, 30 мМ NaH₂PO₄ , 500 мМ NaCl, pH 7,4) при скорости потока 2 мл/мин. Тримеризованный поверхностный гликопротеин GP MARV элюировали в трехкратном объеме элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 30 мМ NaH₂PO₄, 500 мМ NaCl, pH 7,4) при скорости потока 1 мл/мин. Фракции анализировали при помощи SDS-PAAG электрофореза.

Пример 4. Детекция тримеризованного варианта поверхностного гликопротеина GP MARV с помощью SDS-PAAG электрофореза

Электрофоретическое разделение белков проводили в SDS-ПААГ по Лэммли в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Образцы белков для электрофореза в нередуцирующих условиях смешивали с равным объемом буфера для нанесения и прогревали смесь 15 мин при 95°С. Разделение белков в SDS-ПААГ проводили в камере Mini-PROTEAN (BioRad, США) при постоянном напряжении 150V. Визуализацию белков проводили при окрашивании геля Кумасси Brilliant Blue R-250. На фиг.2 представлено электрофоретическое разделение образца культуральной жидкости, содержащей тримеризованный рекомбинантный белок GP-MARV, в 15%-ном ПААГ-SDS.

Пример 5. Иммуноферментный анализ взаимодействия отобранных клонов тримеризованного GP MARV с моноклональным антителом MR191 против MARV

Для идентификации тримеризованного белка поверхностного гликопротеина GP MARV, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, приведенную на фиг. 6, использовали иммуноферментный анализ. В качестве антитела было использовано нейтрализующее моноклональное антитело MR191 против MARV. В качестве отрицательного контроля был использован тримеризованный вариант RBD поверхностного белка S SARS-CoV-2. Сорбировали антитело MR191 в концентрации 200 нг/лунка в течение 16 часов при 4°С, а затем удалили из лунок путем встряхивания. Блокировка проходила при добавлении в лунки к сорбированным антигенам по 200 мкл блокирующего буфера (фосфатно-солевой буфер (ФСБ) + 1% BSA) и инкубации при 37°С в течении 2 часов. После удаления растворов четырехкратно промыли лунки промывочным буфером ФСБ-0,5% Tween20 (ФСБ-Т). Затем вносили 100 мкл образцов культуральной жидкости индивидуальных клонов в двух повторах и инкубировали 1 ч при 37°С. Затем отмывали лунки четырехкратно промывочным буфером и в лунки вносили по добавляли Goat anti mouse igG (ООО «Bio-rad», США) в разведении 1/1000. Инкубировали 2 часа при 37°С и промыли лунки четырехкратно с ФСБ-Т. Для визуализации результатов в лунки вносили по 100 мкл 0,02% раствора хромогена ТМБ в цитрат-фотфатном буфере с перекисью водорода (БРС). После 15 мин инкубации при 37°С в лунки нанесли по 50 мкл 0,9М раствора серной кислоты в качестве стоп-реагента. Результаты регистрировали в планшетном ридере при длине волны 450 нм. Данные оптической плотности и анализ приведены на фиг. 3. Результаты иммуноферментного анализа подтверждают взаимодействия отобранных клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с моноклональным антителом MR191 против MARV.

Пример 6. Исследование антигенности отобранный клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV

На нитроцеллюлозную мембрану однократно наносили по 1 мкл культуральной среды отобранных клонов тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV под номерами 1, 2, 4, 9, 11 и высушивали на воздухе. В качестве отрицательного контроля на нитроцеллюлозную мембрану наносили 1 мкл бычьего сывороточного альбумина. В качестве положительного контроля на нитроцеллюлозную мембрану наносили 1 мкл ВПЧ MARV. Целлюлозу инкубировали с блокирующим буферным раствором, содержащего 1% казеина + ФСБ-Т. После трехкратной промывки ФСБ-Т наносили антитело MR191 (2 мкг/мл) разбавленном в блокирующем растворе и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После трехкратной промывки добавляли раствора антитела IgG против Fc-участка IgG человека, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Invitrogen, США), в рабочем разведении 1:1000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После трехкратной промывки наносили добавляли BCIP/NBT (Invitrogen, США), инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в темноте. После трехкратной промывки водой нитроцеллюлозную мембрану высушивали на воздухе.

На фиг. 4 представлены результаты исследования, подтверждающие антигенность тримеризованного рекомбинантного белка GP-MARV с помощью дот-блот анализа. В качестве отрицательного контроля использовали бычий сывороточный альбумин.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, содержащий в своем составе ген, кодирующий тримеризованный поверхностный гликопротеин GP MARV. Транфецированная рекомбинантной плазмидой культура клеток CHO-K1 осуществляет синтез и секрецию тримеризованного поверхностного гликопротеина GP MARV.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Интегративный

плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-09-05">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU-PVEAL3-GP-MARV-Trim</ApplicationNumberText

>

<FilingDate>2023-09-05</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>RU-PVEAL3-GP-MARV-Trim</ApplicantFileReferenc

e>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU-PVEAL3-GP-MARV-Trim</ApplicationNumberText

>

<FilingDate>2023-09-05</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ГНЦ ВБ &quot;Вектор&quot;

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>State Research Center of Virology and

Biotechnology VECTOR</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle

languageCode="ru">PVEAL3-GP-MARV-Trim</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5919</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5919</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaagaaaggcccacccgtgaaggtgagccagtgagttgattgcagtcc

agttacgctggagtctgaggctcgtcctgaatggatccctatacagttgaagtcggaagtttacatacac

ttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttg

gcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagat

tatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttcgactcc

tctgcagaatgcggcgatgtttcggtaaggggtccgctactagttattaatagtaatcaattacggggtc

attagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg

cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcc

attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc

aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctta

tgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggc

agtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaa

tgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg

caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaaccca

ctgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccgctagcgcc

accatgaagaccacctgtctgttcatctccctgatcctgatccagggcatcaagaccctgcctatcctgg

aaatcgcctccaacaaccagcctcagaacgtggactctgtgtgcagcggcaccctgcagaaaaccgagga

tgtgcacctgatgggcttcaccctgagcggccagaaagtggccgattctccactggaagcctccaagaga

tgggccttcagaacaggcgtgccacctaagaacgtcgagtacaccgagggcgaagaggccaagacctgct

acaacatctccgtgaccgatccttccggcaagtccctgctgctggatcctcctaccaacatccgggacta

ccccaagtgcaagaccatccaccacatccagggccagaatcctcacgctcagggaatcgctctgcatctg

tggggcgcctttttcctgtacgaccggatcgccagcaccaccatgtacagaggcagagtgtttaccgagg

gcaatatcgccgccatgatcgtgaacaagaccgtgcacaagatgatcttcagccggcaaggccagggcta

cagacacatgaacctgacctccaccaacaagtactggaccagcaacaacggcacccagaccaacgacacc

ggctgttttggtgccctgcaagagtacaactccaccaagaaccagacctgcgctcccagcaagatcccct

ctcctttgcctactgctcggcccgagatcaagcctacctctacacctaccgacgccaccacactgaacac

ccagcacctggtgtacttccggaaaaagcggtccatcctttggcgcgagggcgatatgttccctttcctg

gacggcctgatcaacgcccctatcgacttcgaccctgtgcctaacaccaagacaatcttcgacgagtcct

cctcctctggcgcctctgctgaagaggatcagcacgcctctccaaacatctctctgaccctgagctactt

ccccaacatcaacgagaacaccgcctactccggcgagaacgagaacgactgtgatgccgagctgcggatt

tggagcgtgcaagaggatgatctggctgccggcctgagctggatccctttctttggacctggcatcgagg

gcctgtataccgccggactgatcaagaatcagaacaacctcgtgtgccggctgcgcagactggctaatca

gaccgccaagagcctggaactgctgctgagagtgaccaccgaggaacggaccttctctctgatcaaccgg

cacgccatcgactttctgctgaccagatggggcggcacatgcaaagtgctgggccctgactgttgcatcg

gaatcgaggacctgagccggaacatcagcgagcagatcgaccagatcaagaaggacgagcagaaagaagg

caccggcgcctccggctacatccctgaggcccctagagatggccaggcctatgtgagaaaggatggcgag

tgggtgctgctgtctacctttctgcatcaccaccatcatcaccatcaccaccactaagcttaagtttaaa

ccgctgatcagcctcgtcgaccgagcggttcccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccg

aagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggc

aatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgcca

aaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaac

gtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagcca

cgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaa

gagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtat

gggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggcc

ccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatgaccgagt

acaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgtt

cgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaa

gaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtgg

cggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccga

gttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggag

cccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcg

tgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaa

cctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacc

tggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgattcgcatatgggttaatgcttcgagcagacatgataagat

acattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtga

tgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagtttaccgtcgacctctagctagagct

actcgggaccccttaccgaaacatcgccgcattctgcagaggagtcgagtgtatgtaaacttctgaccca

ctgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctctctactattattctgatatttcaca

ttcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaa

ttgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtataggga

tccgctcaatactgaccatttaaatcatacctgacctccatagcagaaagtcaaaagcctccgaccggag

gcttttgacttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgt

attttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgagccatattcaacgggaaacgtct

tgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatg

tcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaaca

tggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaggctaaactggctgacggaatttatg

cctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatcccag

ggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagt

gttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacggcgatcgcgtatttcgtctg

gctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttggtgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggct

ggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactca

tggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacga

gtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcat

tacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcacttgat

gctcgatgagtttttctaatgagggcccaaatgtaatcacctggctcaccttcgggtgggcctttctgcg

ttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgatgctcaagtcagaggt

ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgt

tccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagc

tcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccg

ttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatc

gccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttg

aagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtta

cctcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtt

tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgattttctac</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>470</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..470</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MKTTCLFISLILIQGIKTLPILEIASNNQPQNVDSVCSGTLQKTEDVHL

MGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPTNIRDYPKC

KTIHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRIASTTMYRGRVFTEGNIAAMIVNKTVHKMIFSRQGQGYRHM

NLTSTNKYWTSNNGTQTNDTGCFGALQEYNSTKNQTCAPSKIPSPLPTARPEIKPTSTPTDATTLNTQHL

VYFRKKRSILWREGDMFPFLDGLINAPIDFDPVPNTKTIFDESSSSGASAEEDQHASPNISLTLSYFPNI

NENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAK

SLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSRNISEQIDQIKKDEQKEGTGA

S</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP MARV в клетках млекопитающих. Также описан рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-GP-MARV, продуцирующий рекомбинантный поверхностный гликопротеин GP MARV и содержащий интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim. Также описан рекомбинантный белок GP MARV, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии CHO-K1-GP-MARV. Техническим результатом изобретения является создание плазмиды, штамма-продуцента клеток СНО-K1-MARV, продуцирующего поверхностный гликопротеин GP MARV в более корректной форме. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного поверхностного гликопротеина GP MARV в клетках млекопитающих, имеющий размер 5919 п.н. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и содержащий в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, следующие элементы:

- 5'ITR_SB, имеющий координаты с 88 по 317 п.н.;

- Плечо интеграции 5'IFR, имеющий координаты с 318 по 368 п.н.;

- CMV enhancer, имеющий координаты с 369 по 733 п.н.;

- CmV promoter, имеющий координаты с 734 по 937 п.н.;

- Ген GP-MARV-Trim, имеющий координаты с 1033 по 2442 п.н. и кодирующий поверхностный гликопротеин GP MARV;

- Foldon, имеющий координаты с 2443 по 2523 п.н.;

- Последовательность 10his, имеющий координаты с 2524 по 2553 п.н. и являющийся полигистидиновым тэгом для очистки рекомбинантного белка с помощью металл-хеллатной хроматографии;

- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющий координаты с 2603 по 3177 п.н.;

- BleoR - ген устойчивости к антибиотику блеомицину, имеющий координаты с 3182 по 3189 п.н.;

- PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты с 3190 по 3789 п.н.;

- T3 promoter, имеющий координаты с 3799 по 3806 п.н.;

- SV40 poly(A) signal, имеющий координаты с 3824 по 3945 п.н.;

- Плечо интеграции 3'IFR, имеющий координаты с 3969 по 4016 п.н.;

- 3'ITR_SB, имеющий координаты с 4017 по 4246 п.н.;

- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, имеющий координаты с 4433 по 5248 п.н.;

- Участок начала репликации Ori, имеющий координаты с 5311 по 5898 п.н.

2. Рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV, продуцирующий рекомбинантный поверхностный гликопротеин GP MARV и содержащий интегративный плазмидный вектор PVEAL3-GP-MARV-Trim по п. 1.

3. Рекомбинантный белок GP MARV, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-GP-MARV по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, молекулярную массу 162 кДа и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.