Способ получения производных винбластина Советский патент 1983 года по МПК C07D519/04 A61K31/475 A61P35/00 

1 Изобреэение относитхзя к способу п лучения новых производных винбласт№ на обшей формулы ВЗ где метоксигруппа; ацетил; 3„ d -ЭТИЛ, или к -- гиаро -о4 этил к Воцороа;; м.етил, линейный Со-Сл « пки .изобутил или бензил, обладающих цито статическими свойствами. Известен способ получения произво ного алкалоида винбластина, именно в Кристина, путем окисления в1шбластин или его солей хромовой з ислотой при низкой, температуре 11 . . . Цель изобретения - получение новы производных винбластина. Цель аостигаетск тем, что согласн спйсобу, основанному на известном м де (1) и заключающемуся в том, что соедннение обшей формулы гх-ч. ,.а I к - €Ня ОИ где | -R - имеют; ул-г,азанные значения ит1 их кислотно-аацктиБные соли попве гагот взаимодействию с . молярным избытком спирта общей форм лы R-OH(Ш гае R siiMeeT указан1 ые значений, при чем связанный с OFJ.-c-руппой ;пирта 72 атом углерода должен быть первичным или вторишым, в слабокислой слеае, в прису1х:твии трюхокиси хрома, хлорированных углеводородов или низших али- фатических кетонов при (-.60)(5О)С и затем при рН реакционной смеси 8-1,0 выделяют целевой продукт, который при желании очищают. Реакцию проводят желательно в атмосфере защитного газа. Протекание реакции моясно контролировать с помошью подходящих аналитическ1-1х ме1Х)доБ, на« пример с помощью тонкослойной хрома-, тографии. Продолткительность реакции зависит от природы применяемого спирта обшей формулы (Ш) и сос.тавляет 20 60мин. Полученный сырой продукт выделяют из реакционной смеси путем экстракции и упаривания. Он может при этом содержать некоторое количество N -дезметильного или N .-.дезметип-М-формильного производного, от которьк его можно отде лить с помощью хроматографии, В качестве адсорбента предпочтительно применять частично дезактивированную окись алюминия или мелкодисперсный силикагель. Выделенный продукт при иселании можло подв€;ргнуть очистке перекристаллизациейI Пример 1. N - ЦезметилЧ « {метоксиметил)-В1Шбластин, 1,О г (1Д моль) сульфата винбласткка раст.воряют в смеси 240 мл Ебсо,;ютного, не соцерясашего примесей спирта, дихлор метана, 8,0 мл метанола и 25 мл ле- аяной уксусной кислоты н о.хлажцают по- лученный раствор GO 5,. К раствору В1шбластина добавляют в течение 5 мин в токе cy:ioro азота, при интенсивном перемешиЕйнии охлажденный цо . раствор .0,5 г (5,0 ммоль) трехокиси хрома в 40 мл уксусного ангидрида. Нельзя, чтобы гемператур а реа.кционной смеси повышалась при этом выше . 50 С. Протекание окисления контролируют с помошью тонкослойной хроматографин (ацсорбент:алЮ /инн&зая дюльга для тонкослой-чой хрома тографив.силикагель .54- 5554j поцвжкнап фаза| смесь цизтилового &ф-:ра, этанола, бензола и диэтиламвдш в соотношении 10;Os5;0,). Окисление заканчивается чзрез 20.-ЗО мин.. После этого к реекционнсй смеси добавляют 190 мл, кокцен т рй рованн ого воп н ого расвво ра амшшка и 20О г льда для поддержания .низкой темпе эатуры. Температура смеси

поанимается цо О-С (). Охлажцение прекращают и смесь, рН которюй равно 8,5-9 энергично перемешивают в течение 10 мин. Фйзы разаеляют, из водной фазы трижды проводят экстрак- цшо цюслорметаном, порциями по 30 мл Экстракты четырежды промьтают раз-бавпенным 1:1 аммишсом, порциями по 25 мл, а затем пважпы ЗО мл воды, высушивают нап сульфатом магния, фильтруют и фильтрат упаривают в ввкууме. В результате полу-шют 0,85 г сырого продукта, из которых О,3 г подвергают хроматографии на колонке, заполненной окисью алюминия активности И-, используя в качестве элюента цихлорметан. Сорбент фракции по 6 мл, который анализируют с помощью тонкослойной хроматографии (ад- сорбент: алюминиевая фольга для тонко- слойной хроматографии - силикагель б0р254 1 Art 5554; подвгокная фа.за; смесь дихлорметана и метанола в соот нетлении 5:0,4; проявление с помошью паров иоца или УФ-света с длиной воЛ ны 252 нм).

Фракции, содержащие и тот же алкалоиа, объединяют. Полученные группы фракций упаривают по ютаельности. Целевое соединение содержится в фракциях 6-25, В результате получают N -дезметил |Ч-(метоксиметил) винбластин (хроматографическая чисто та 64%), т.пл. 205-21О С (этанол).

( 23° ( хлороформ).

Масс спектрометрия Гп /е:840( % 810, 8О9, 781, 751, 681, 651, 65О 601, 499, 355, 282, 243, 241, 154 149,

Пример 2.N аезметиЛ-Н -(изобутоксиметил).виибластин. 0,5 г (0,55 ммоль) сульфата винбластина растворяют в смеси 120 мл абсолютного цихлорметана, 3,7 мл изобутанола и 12,5 мл ледяной уксусной кислоты

и охлаждают полученный раствор цо -« 55 С. К раствору добавляют . ценный цо -55 С раствор 0,25 г (2,5 ммоль) трехокиси хрома в 4О мл уксусного ангидрида. Ход реакции конгр лируют с помощью тонкослойной хроматографии (адсорбент:пластиковая пленка для тонкослойной хроматографии - сили кагель 60 р254 5735; растворитель: смесь эфира, этанола, бензола и циэтиламина в соотношении 10:О,5: i:O,5:p,5) описанным в примере 1 способом. Продолжительность .реакции

14О мин. После окончания реакции реакционную смесь обрабатывают далее описанным в приме): 1 способом. В peaynf.тате получают 0,65 г сырого продукта, ко1Х)рый подвергают очистке хроматогра- фией на колонке, заполненной силикаге-лем (Art 9385), испо;и,-|3уя в качостпо элюента аихлорэтан. Собиртют фракппр.

по 1О мл В первых ЗЗО мл элюента

/ не соцеркится алкалоидов, Зпгоиро шние

процогпкают далее пихлорметапом, со-дер кац1им 3% ме га-юла. В г ервых ОО мл полученного элюата соцеркится целевое соединение, iKOiXJpoe выделяют ynapi ванием элюата. Выход 169 мг (35%). т.пл. 215-218 С. ИК (КВч): 3400 (НН,ОП), 1730, (COgCn), 16О5, 122О см (ОАс), viacc--(;iK3KTpON erpJ: i m./er 8--2 (, 1ОО%), 864, 851, 823, 81О, 779, 751,723, 651, 514, 355, 346, 329, 154.

Пример 3 . N Дезметил М-(гептоксиметпл)- в1шбластнн. Процесс провопят таким же образоМ; .как и л ст-.учае примера 2, но в качестве реаг нта i используют 3,7 мл 1-гепта1юла. Про- цолжнте.чьность реакции .вляет около 90 мин. После переработки реакционной смеси получают около 4 г сырого продукта, который растворяют в 30 мл дихлорметана и вводят в заполненную силикагелем 6О колонку. Элюирование осуществляют с помощью анхлорметана, Собгфают фракции по 10 мл. В Т1ер.вых ЗОО мл не содержится «лкапоицов. Цап1 неГгшее элюиро.вание осуществляют с помощью дюслорлетана., содержащего 3% метанола, В первых 120 мл полученно- го элюата содержится целевсн проагукт. Выхоц 21%, т.пл. 2ОО,20..С (смесь ацетона и эфира). ИК (КВч): 3450, (ОНМН), 174О (С02СНз). 1610, 1220 см-- (ОАс). Масс-спектрометрия fn/e: (AV, 1ОО%), 906, 893, 865, 822, 810, 765, 751, 737, 651, 650, 649, 469, 455, 355, 282, 154, 135, 122.

Пример 4 . W -дезметил-М-(бензилоксиметил)ВШ1бластш, Процесс проводят таким же образом, как и в случае примера 2, с той разницей, что вместо изобутанола используют 4,3 мл бензилового спирта. Реакция продолжается в течение 45 мин. В результате получают 4 мл сырого продукта в виде маслянистой жидкости, который выделяют с помощью препаративной хроматг

графин на (адсорбент: силика гель Pp-jjr- -«366, растворитель смесь 100 мл цяхлорметана и- 8 мл метано

ла)„ Е)ыхоа: 75 г (15% от теоретич.). т.пп. 215.-2,1.8 С (смесь метиленхлорк--. 5 да и эфира).

ИК (КВч); 3400 (OH,RH)i 1740, (COgCHg), 1610, 1230 СМ--1 (ОАс). Масс спектрометрия ,гп/е: 916 (.М , 100%), 885, 857, 822, 810, 796,

779,757, 751, 737, .651, 650, 649/ 514., 355, 346, 329, 282, 154, 135.

П р и м ер 5 , Н -аезметил-М ™(метолс1 м-етип)ЕИнбластин, 5 г; е

5,5 ммоль) сульфата винбластина раст зоряют в 15О мл воды. Добавлением к ,, раствору концентрированного раствора аммиака (рН 8) перевоцят сульфат аинбластина в основание винбластина,20

которое экстрагируют четырежды ци- хлорметаном порциями по 50 мл, Орга нкческую фазу высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме досуха. В р езультате получают 25 4 г основа.иия винбпастина, которое растворяют в смеси 100О мл не содержащего примесей спирта цихлорметана, 120 мл ксусной кислоты и 6 мл метанола и полученньгй раствор до ™-55 С. д К этому раствору добавляют в течение примерно 5 мин охлажденный цо -55 С встзср 2,5 г} (25 ммоль) трехоккси тТрома в 47С мл уксусного ангидрида. Реакционную смесь перемешивают в те чекие 45 мян при -55с к затем вливают ее в смесь 940 мл концентрированного раствора аммги.ха и 940 мл л.8дя 5ЮЙ Браы. Пр5 sToivs нужно следить за тем, нгобь; .гем пера тура смеси не подлималась вькле .,Затем фазь разде --. ляют и оргелигческую фазу встряхивают Б целительной гзорои.ке с 1 л 1%.ного раствору аммка са. Затем оргаиггческую фазу отцелЕют, вые;/иияают каа сульфа« .. TOEvt натрия,- ф 1льтр5 от и упаривают в вакууме посуха. 3,8 г полученного сырого проау- та поавергагот очистке с помомью ;роматограф:;и; на колонке, Ко-лопку заполняют 2йО г :.кмсп аглюминий шстивяостЕ ll.«l;ll (ВгйС1ч1-шпп) к уВ -гтажнкют последнюю бензолом. Сырей пр-оцукт растворяют ь 20 мл смеси бен-зола и хлоро(рорМ((а, взятыл; в сооткотлении

S;2 V. заливают полученный раствор в колонку, Злюирование осугиествлию7 с

помошь-о этой же смаси |:1а-:;тво;Айтелей (около 8л), отбира- Лраютк по 100 мп,. Фракции. соцерх ад5 з оцикак;вые

ства, объединяют и упаривают (адсорбент: силилагель; подввд ная фаза} смесь бензола, этанола, дяэтиламина и циэти лового эфира в соотношбНРяи 5:5:5:100) В р- зультате получают 2,1 г продукта. После перекристаллизации из 6. мл этанола получают 1,5 г целевого продукта с такими же физическими константами, Kaj и у продукта, полученного по способу в соответствии с npnMepOivi 1.

Пример 6 ; N -аезметил-М- -(пропоксиметил )-винбластин. Процесс проводят таким же образом, как это описано в примере 5, но вместо метанола берут 4,5 мл пропанола. В резуль тате получают 0,6 г целевого продукта с т,пл. 20О.210°С, ( d-) и (31,2-, , хлора{)орм), IH-ЯМР (CfiClg, 100 МГц):сГ9,05 (9, 1Н, ), 8,06 (S, IH.NaH), 7,3 4 (щ , 1К, C-ig, Н), 7,3 4-7,12 (т, ЗН, Сд, С;,ф Н), 6,68 (5, 1Н, Сд.-Н), 6,55 (S, 1Н, С,,.-П), 5,84 (с1с1ДН, СЦ4-), 5,36 (5, 1Н, Cf,-H), 5,28 (d, IH, ), 4,75, 4,15 (2Н, ЭдцЮ-Гц, Ja CH2-0-), 4,18 (S, IH, C2--H), 3,78 (5, ЗН, ), 3/75 (5, ЗН, С,ОСН.), 3,62 (S, ЗН, COgCH.j), 2,73 (S, .,2--Н),„ 2,09 (S, ЗЬГ, ОСОСП), 0,65 (m. ,9П, СН -группы).

Пример 7 . цез 4етил-гМ пметоксиметил)-винбластйп. Процесс про вопят таким. же образом как это описано в примере; 1, но в качестве исход- кого соединения вместе сульфата винблас используют Еикблзстанцигицр 5хлорна Выход получунного продукта составляет 28%. Физические константы его такие же. Kaj; и продукта, полученного по .способу в соответствии с примерокз 1.

П р и м е р

-дезметил-1 и

-- (ме токе т в л) -в ш-1 бл ас rmi. П pcme ее дровоцят таким же образом, как это списано в примере 1, но в качестве рас(ворятеля вместо- дихлормзтана терут не примеск спирта хло х форм/дихлорзган или ацатон,,. Выход 40- 50% (в зависимости от природы исполь-- зуемого растворитэля). Фяз::ческие кон станты получае клго продукта такие же, t как и в случае продукта в соответствий с примером 1„

П р и м е р 9 . Ы --aeaMeTHn iH-(метоксинетил-2,0 -Ц,-зоксилейрозидин,

с 60 мг (0,067 ммоль) сульфата 20 «цезоксИ Лейрозицина (палученлого путем каталит51;ческого гидрирования 3 ,

4 -ангицро-винбластина с использование палладия на угле в качестве катализатора, в среце метанола и по :леауюшего перевоца продукта .восстановления в сульфат) растворяют в смеси 2О мл абсолютного дихлорметана, 1,5 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл метанола. Полученный раствор охлаждают до -65 С и смешивают его с охлажденным цо раствором 30 мг (0,3 ммоль) трехокиси хрома в 3,5 мл уксусного ангидрида. Реакция заканчивается через 6О мин, после чего реакциоонную смесь вливают в смесь 12 мл концентрированного раствора аммиака и 12 г льда. После разделения фаз вод- ную фазу трижды встряхивают в делительной воронке с 10 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы дважды промывают разбавленным (1:1) раствором аммиака, порциями по 10 мл, а затем дважды - водой, порциями по 5 мл. После высушивания органическую фазу упаривают, В результате получают 48 мг сырого продукта, который подвергают очистке с помощью хроматографии на колонке (адсорбент: силикагель с размером частиц 0,О4О-О,063 м фирмы Мегск, Art. 9385; pacTBOpitтель: дихлорметан и цихлорметан, содержащий 3% метанола). В результате получают 18 мг (выход 32%) продукта, плавящегося при 185-190°С (с разложением), (d.}n- 50 (с 1, хлороформ). ИК (КВч): 3400 (NH), 172О (,) 161О, 1230 см (ОАр). В качестве

побочного продукта при хроматографнческой очистке можно получить 46 мг (22% от теоретич, выхода) N -аезметил

N-формил-2О -дезокси-лейрозицина, т.пл. 205-210 0 (с разложением), (ci) jP +54 (, хлороформ).

0

Предлагаемые соединения проявляют цитостатическое действие. Они однако менее токсичны, чем исходные вещества.

5

Острая токсичность соединений испытывалась на самцах швейцарских мышей весом 27-31 г. Каждая группа подопытных животных состояла из шестимыщей. Из испытуемых соединений го0товили путем добавки .к ним физиологического раствора поваренной соли ипря необходимости нескольких капель Т х/ееп 80 раствором для иньекций. Пол енные растворы вводили животным внутрибрю-

5 шинно в постепенно возрастающих дозах, от не вызывающих смертность до вызывакших 100%-ную смертность. Результаты испытаний, оценивавшиеся по методу Licfifie clM WfPcoxon приве0дены в табл. 1 Ж(для сравнения с ней примеры также данные, полученные при использовании известных соединений, винбластина,виндецина и винкристина). Таблица 1

СПССОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ВИНБЛАСТИНА общей формулы гце R - метоксигруппа; ацетил; 3- of -этщ, или -грШ1зрксил; g4. , эгнл, , -воцороц; Р - метйп, линейный алкил, исзобутип или бензил, С q-C -, , отличающийся тем, что сое двшение общей формулы -R ДЭ Г-Н

N-Д езме тил-М- (метокси- метил)-винбластин

| -ДезметиЛ-М-.(пропокси- метил)-винбластин

Н-Дезметил- 4-(изобутоксметил)-винбластин

N-Д еэме тил-Г(-(геп токси- метил)-винбластин

|4-Дезметил-Н-(бвнзилоксиметил)-винбластин

Винкристин

Винбластин

Винцецин Токсичность новых соединений таким образом в раз шсже токсишости винкрисгина и BUHaeupma и в раз ниже TOKcifiHocTH винбластина. В отличи от вш Кристина и винцецина в случае новых соецинений вплоть ао цостижения срецней смертельной дозы не наблюпает ся побочного, парализующего действия, Цитостатическое действие новых сеюдинений испытывалось на тканевых купь турах и разл тчных вицах трансплантиртванных опухолей. Испытуемые соединения растворя лИсь в различных количествах (от по- ррговой позы IxlO мкг/мл цо верхнег предела 100 мкг/мл в тканевой культуре (.«культура) и через 24 ч кул туры invivo исслецовапись поц микрос копом. С учетом зафиксированных в мет фазе клеток были получены следующие результаты, прецставпенные в табл. 2. Таблица 2. Доза, вызывающая силь кое блокиро Соединение вание, мкг/мл Й-Д езме (ме токсИ 0,001 NflB тил)винбластин езме (пропокс иО,ОО1 -метил)-винбластин К|--Дезме тил-N- (изобу токси ме тил)-винбластин )У|-Дезметил-М- (бензил0,001 оксиметил)-винбластин езме тил.- (бензил- оксиметил)винбластин 0,01 В аналоги чньж условиях бьши прове дены опыты с окрашенньыи тканевыми культурами, что дало возможность фик ровать более тонкие различия. При это обнаруженное цействие можно разаеллгг на пять стаций. Первая стация характеризует дозу, вызывающую минимгшьное действие возрастание количества блокированных митоз. Часть этих митоз, например тр иые митозы, вырождается апи на полю сах появляется несколько отаелившнхся хромосом, анафазы в болынилстве случ 71-О ев пропадают. На второй ствг.ни проис хоцит сильное блокирование метафаз, и нормальные мнтозы првкт -тскп не на- блюааются. Хромосомы рэсполагак тся Б более ртлхлом клубке. Лоля клеток, находящихся в ннтерсЬазе, неэначител :)На. На третьей стации хромосомы скучива ются (коалестфуют) в впа-э плогпой массыв центре клетки. Это состояние мож™ 1Ю охарлкт ;ризоБять квк- цкккомитоз или стации пейсгвие спештиетшй ья находялие- ся в иктерфазеклетки проявляется D том, что уже имеется сравнительно небольшое количество блскитОванкых .клеток, поскольку они уже не в состоянии входить 3 митозу. Цитоплазма клеток Б иисерфазе :асширяется, кра.я ее становятся неоп- реаеленпыми, бахромчатыми, клетки часто принимают вытянутую, фибрчобласттоБую форму, 13, наконец, на пятой стапии цитоплазма заполняется тонкой сетчатой структурой, и на7:.г,-,п1циеся в ф8.зе клеткп явно погибают в результате обработки, Указа.н.ныо ПЯТЕ, стаций ; . можно легко отличить цруг от цруга. Результаты испытаний иозволятот сае- дать БЫвоП; что гспгболее активным ЯБ яяется :(т-;птокси-произ.ооц1Т1)о, Уже прн концентрации его 0.001 мяг-мл проис- хоцит сильное блокирование MeTatfiaabi, цшсономитоз наблк цается прк концентрЭ цин 0,1 мкг/мл, а действие на клетки, накоцящиеся а ннтер4)азе5 - lypn рации 1-10 , Лействие бутокси™ произвоцного на поряцод н-пке: даже гфи микимапьной концентрации OpOl мкг/мл епде присутствую нормальньге митозы. Наиболее слабое аейсчъие оказывает бензилокс}1--произБоа}юе. При самой низкой концентрации блокирующее щпктвяе минимально; наблюаается кекотогоэ ко- лйчество Еырожпенных митоз, но агшфазь, уже отсутс:твую . При .концентрации 0.01 мкг/мл блокиро.Еанкв умеренное, сильное блокиро.вание и пикномитоз имеюи место .iipn конце11трэ.ц.ии 1 мкг/мл. Действие . на .энутрибрюшинно-™ Tpa.HcHJiaHTHpyeMbJff оп со7П (лейкемия мышей Р 388 ийЗсНег i,/rnphornd Nlylj) опртцелялось следующим образом, Лейкемия Р 388 поццерживалась у (ВРР-гибриаы). Подопытным жи.воткым (по 6 мышей в группе) илактировалк внутрибрюшшшо по 10 ° .холевь х .клаток. Через 24 ч после трансплантации начинали лечение (ежед- 111 невная внутрибрюшинная инъекция новых соеаинений). При этом ежеаневно контролировались вес и состояние поцопытных животных. Эффективность действия соеаинений выражали в процентах от

N-Д езме тил-М- (гептокси- ме тил)-винбластин

N-flesMe тил-М-. (бензилоксиме тил) -винблас тин

IVJ-Д езме (изобу токсиметил )-в шбластин

езме тил-lv -(метоксиметил)-винбластин

N-Д езме тил-( (пропокс иметил)-винбластин 7 прополжительности жизни животных из .контрюльной группы. С- К&к вишю ил табл. 3, зараженные лейкемией Р 388 я подвергнутые лечению животные жили значительно аольше контрюльных. ,ТаблицаЗ

1О53757

13

)1-Дезметил-К}(пропоксиметип)-винбластин при дозировке его 8-1О мг/кг

оказывал токсичное действие, так как при введении его погибли и животные, не зараженные опухолевыми клетками.

Аналогичные опыты были провецены с нспользовацием N аезмегил-фи(метокси Мвтил)-20 -аезокси-лейрозидина, езме тил-| - (ме токси- ме тил) -20 -цезоксилей- Подопытным мышам (Swiss- , неродстаенное разведение) транспланти-ч.-д ройапи внутрибркяаинно по 5х1О опухо« пееьа клеток: ascitex-Каждая из групп .включала по 10 подопытных животных. Лечение начинали через 24 ч после .трансплантации. Соединения вводили

14

Продолжение табл. 3

веденные в табл. 4. При этом помимо дозировки варьировались также п юдолжительность лечения.

Таблица 4 :ежеаневно в течение 5 дней. Средний icpoK жизни животных контрольной группы составлял 15,7 дней. Эффективность соединеный проявляется в существенном увеличении, как это видно из табл, 5, j срока жизни.

15

W-iDe3Me ти л-(Ч- (геп то- тил) вин блас тин 5 У6,0 мг/кг, (внутрибрюшинйо)

1 -Дезме тил-М (язобутокеиметил)-винбластин 54,0 мг/кг

Тормозящее действие новых соединенийна развитие опухолевой (Р 388 |HNlf/l.v) проявляется в дозах 4-8 мг/кг в аень и такое же по вё тичине, как, и в случае известных циинцоловых алкалои16

1О53757 Таблица 3

10/10

3/10

7/10

10/1О 1О/10

7/10

дов. Однако новые соединения менее Токсичны, чем соепнненяя с анало.гичн.ой структурой и таким образом обпапают преимуществами перед ними.