Способ определения серотонина в клетках нервной ткани на гистологическом препарате Советский патент 1985 года по МПК G01N1/30 A61B10/00 

;о

00 4ib

Изобретение относится к медицине.

Целью изобретения является повышение точности способа о

Способ осуществляют следующим образом,

ткань замораживают в криостате и готовят из нее срезы толщиной до 25 мкм. Срезы помещают на предметные стекла, высушивают в стру теплого воздуха при 40-60°С в течение 10-15 МИН; и помещают под люминесцентный микроскоп, где облучают световым потоком мощностью в . Сравнивают флуоресценцию исследуемых клеток с контролемS.и по соотношению судят об изменении в них содержания серотонина. При этом серотонин испускает собственную флуоресценцию , достаточную для визуального наблюдения 5 регистрации и фотографирования. Соотнощение флуоресценции различных клеток между собой и с контролем является мерой сравнительной количественной оценки изменения содержания в них серотонина То обстоятельство , что при этом регистрируется свечение самого искомого вещества (серотонина), а не продукта его химической реакции с параформальдегидом, обеспечивает достоверность результатов и правомерность сравнения данных, полученных в различных опытах и с контролем. При использовании в качестве эталонов различных концентраций серотонина возможен перевод условных единиц .флоуресценции в абсолютные единицы массы вещества.

Пример i.lO интактных крыс весом 130-150 г обезглавили в состоянии эфирного наркоза. Для исследования отобрали область четверохолмия среднего мозга, которую заморозили в криостате при - 10 С, Из нее приготовили серийные срезы толщиной 15 мкм, которые установили на предметные стекла и высушили в струе теплого воздуха при 50°С в течение 15 мин.

Для выявления серотонина срезы .мозга облучили светом в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-И-3. Источником света служила лампа ДРШ, при этом мощность светового потока, падающего на срез мозга, при мощности светофильтров возбуждения разной толщины и апертурной диафрагмой микроскопа устанонили

972

равным 310. Изучение спектральных характеристик свечения нервных клеток проводили при помощи фотометрической приставки ФМЭЛ-1А. Ею же из-

меряли интенсивность свечения

нервных клеток. Для этого в качестве зонда использовали полевую диафрагму микроскопа. Из общего значения флоуресценции нервных клеток вычи-

тали значение неспецифической флуо-. ресценции нервной ткани. Таким образом, в расчет бргши только свечение, вызванное серотонином клеток (так как исследовались группы однородных клеток, то их размер не влиял на содержание серотонина в них).

В срезах среднего мозга, в вентральных и дорзальных областях, выявили клетки, содержащие флуорес-

цирующую зерностость, которая занимает все тело клетки, преимущественно в местах отхождения аксона и ден- дритов. Ядро клетки не флуоресцирует. Зерна светятся желтым или желто-

оранжевым светом, а их количество и интенсивность свечения неодинаковы в различных клетках. В частности, в среднем мозге выявляются две группы клеток - ярко и слабо

флуоресцирующие. Доказательством

того, что обнаруживаемое свечение гранул нервных клеток обусловлено именно содержащимся в них серотони- ном, является видимый желтый свет флуоресценции, максимум которой ле-

жит в области 520-550 мкм. Специфическим для серотонина является также увеличение интенсивности после применения ниаламида и- уменьшение после дачи животным резерпина. Другие амины, например катехоламины, гистамин, не обладают собственной флуоресценцией и не мешают определению серотонина.

Облученные световым потоком мощностью в 310 клетки вентральных областей среднего мозга (ярко флуоресцирующие) показывают среднее свечение, равное 7,,3 усл. ед./ клетку, а нейроны дорзальных областей.

среднего мозга (слабо флуоресцирующие) - 2,,2 усл. ед./клетку, отношение яркости свечения обеих групп клеток составляет 2,6.

Пример2. 10 интактных белых лабораторных крыс обезглавили под эфирным наркозом, быстро извлекли мозг, который заморозили в криостате при температуре -10°С. Из

тех же областей среднего мозга готовили серийные срезы толщиной 15 мкм, которые устанавливались на предметные стекла и высушивались в струе теплого воздуха с температурой в течение 15 мин. Срезы изучались в люминесцентном микроскопе при условиях, описанных вьше, за исключением того, что мощность светового потока устанавливалась равной .

Среднее свечение ярко флуоресцирующих клеток составляет 11,6 + ,8 усл. ед./клетку, слабо флуоресцирукяцих - 6,,6 уел.ед./клетку, а отнощение яркости свечения обеих групп клеток равняется 2,07,

Пример 3. У 10 интактных белых лабораторных крыс получали срезы среднего мозга описанным способом, которые обрабатьтали и изучали -в люминесцентном микроскопе при условиях, приведенных в примере 1, за исключением того, что мощность светового потока устанавливалась равной 9 . При таком освещении сильно флуоресцируюпще клетки среднего мозга показывали свечение, равное 6,16+1,6 усл. ед./клетку, слабо флуоресцирующие - 8,2+1 ,6 усл.ед./ клетку, а отнощение свечения обеих групп клеток равнялось 1,92.

Пример 4. У 10 интактных лабораторных крыс получали описан93А97

ным способом срезы среднего мозга, которые обрабатывали и изучали в люминесцентном микроскопе при условиях, приведенных в примере 1, за

5 исключением того, что мощность облу- чающего светового потока устанавливалась равной 12° При такой мощности светового потока сильно флуоресцирующие клетки показывают

fO среднее свечение, равное 22,3+ ,2 усл. ед./клетку,- слабо флуоресцирукицие - 1 1,0+; ,2 уел .ед/клетку, а отношение свечения обеих групп клеток равно 2,02.

15 Пример 5. Срезы среднего мозга 10 интактных белых лабораторных крыс получали, обрабатывали и изучали в люминесцентном микроскопе при условиях, описанных в примере 1, за исключением того, что мощность облучанадего светового потока устанавливалась равной 14. , В таком световом потоке сильно флуоресцирующие клетки показывали свечение 15,,1 уел .ед./клетку, слабо флуоресцирующие - 10,3+0,9 усл.едУ клетку, соотнощение между свечением обеих групп клеток составляло 1,5.

Интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток среднего мозга при облучении их светом различной силы приведена в табл. 1.

Таблица 1.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНША В КЛЕТКАХ НЕРВНОЙ ТКАНИ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ путем ее замораживания, приготовления срезов, высушивания к облучения световым потоком с последующим определением серотонина по интенсивности свечения, отличающийся тем, что, с целью повышения, точности способа, высушивание проводят при 40-60С в течение 10-15 мин, а для облучения используют мощность светового потока 6 -103 - 12-10.

Как видно из табл. 1, слабо флуоресцирующие клетки среднего мозга могут быть выявлены только при применении мощности светового пото55 ка не слабее . Световой поток: мощностью менее 3 не выявляет все серотонинсодержащие клетки мозга и не может применяться для их ана5лиза. С увеличением мощности светового потока интенсивность флуоресценции обеих групп клеток мозга воз растает, однако только в интервале от 6 до -12 интенсивность флуоресценции возрастает линейно в зависимости от мощности светового потока. В этом интервале соотношение флуоресценции двух групп клеток, содержащих различное количество серотонина, сохраняется равным приблизительно двум. Поток света мощностью более 12 например 4,, уменьшает флуоресценцию из-за усиленного разрушения серо тонина светом, и не может применять ся для его анализа. Следовательно, для анализа серотонинсодержащих клеток может применяться световой 10 „ nWпоток мощностью от 12 Пример 6. Срезы среднего мозга получали от 10 белых интактных крыс способом, описанным в примере I. Срезы устанавливались,на предметные стекла и высушивались в струе воздуха с. температурой 20, 40, 50, 60 и 80°С. Исследования показали, что высушивание срезов при требует больше времени, чем при использовании воздуха с тем пературой 50 С. Изменение сроков высушивания является нежелательным, так как при этом в нервных клетках происходят определенные химические превращения влияющие на содержание в них серото . Поэтому такая температура не может применяться для анализа серот Нина, Температура 80°С вызывает денатурацию нервных клеток, искажение и структуры, и поэтому такое значение температуры также не может применяться для анализа серотонина. Следовательно, оптимальным является высушиванием срезов воздухом с температурой 40-60 С. Пример. Срезы среднего мозга 10 интактных белых крыс получали, как описано в примере 1. Срезы устанавливались на предметное стекло и высушивались в струе возду ха с температурой в течение 5,10,15 и 25 мин. Исследования пока зали, что полное высушивание срезов наступает через 15 мин. Высушивание в течение 5 мин не обеспечивает пол ного обезвоживания срезов, а 25 мий являются избыточными. 976 Пример 8. Сравнение точности известного и предлагаемого способа исследования серотонина. Мозг 10 белых лабораторных интактных крыс замораживали в криостате при температуре и из области дорзального ядра шва среднего мозга готовили Ьерийные срезы толщиной 20 мкм. Срезы нумеровались от 1 до 20 и наклеивались на отдельные предметные стекла. Таким образом, каждый срез содержал клетки одной популяции дорзального ядра шва с одинаковым содержанием в них серотонина, В дальнейшем 10 срезов обрабатывали существующим гистохимическим методом выявления серотонина, а 10 срезов предлагаемым способом. Это дает возможность выявить влияние условий реакции на результаты определения серотонина. На конечном этапе во всех срезах определяли интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток, как описано в примере 3. Полученные результаты обрабатывали статистически с вычислением средней арифметической (М), среднеквадратического отклонения (ё), дисперсионного отношения (F) и критических значений параметра для уровней значимости Q 0,01 и О 0,05 по таблицам Фишера. Интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток в срезах мозга, обработанных предлагаемым способом (нечетные номера) и известным (четные номера) приведена в табл. 2. Таблица2

7

Продолжение табл.2

Примечание. Приведенные в табл.2 значения интенсивности флуоресценции серотонинсодержащих клеток представляют собой среднийрезультат измерения 15 клеток в каж дом срезе.

Так как дисперсионное отношение (,1)больше критических значений параметра по таблице Фишера 5, 37 и 2,7), то различие в дисперсии рядов является существенным и определяется недостаточной точностью известного метода определения серотонина по сравнению с пред лагаемым.

Приме р 9. Возможность применения данного способа для срав22,,2 13,994.0,76 50,,3

0,01

Полученные данные показывают, что предлагаемый способ пригоден для сравнительного количества опреде934978

нительного количества определения серотонина в клетках и оценки изменения его содержания при различных болезнях по сравнению с контрольными, здоровыми животными, изучена на крысах с различным уровнем серотонина в клетках, вызыванным резерпином и ниаламидом. В качестве контроля использованы здоровые ин0 тактные крысы с нормальным содержанием серотонина в клетках мозга. Так как резерпин приводит к исчезновению серотонина в слабо флуоресцирующих клетках, то в этих опытах . 5 изучались только ярко флуоресцирующие серотонинсодержащие клетки, уровень амина в которых лишь значительно снижается резерпином.

Мозг интактныхкрыс, а также животных, получивших резерпин и ниаламид, извлекался после декапиляции животных, замораживался в криостате при тe mepaтype -10 С, и изготавливали срезы толщиной 15 мкм.. Последние устанавливали на предметные

стекла и высушивали в струе воздуха ,с температурой 50С в течение 15 мин. Содержание серотонина в нейронах исследовали в люминесцентном микроскопе, как описано в примере 1, при мощности светового потока 9 .

Интенсивность флуоресценции серотонинсодержащих клеток в зависимости от содержания серотонина представлена в табл . 3

Таблица 3

228,1

62,7 0,0 0,01

ления серотонинав клетках,так как улавливают сдвиги в содержании вещества,вызванные фармакологическимипрепаратами. 9 Использование данного способа обеспечивает по сравнению с известными большую точность определения сдвигов в содержании серотонина в клетке,. так как за основу берется 1193497О собственная флуоресценция серотонина, а не продукта его химической конденсации с параформальдегидом, при эТом точность определения повыj шается на 10-15%.