Способ получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков Советский патент 1988 года по МПК B01J20/26 C08F8/02 

со ;о

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к способу получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков, и может быть использовано в биотехнологии и хроматографической технике.

Цель изобретения упрощение технологии способа.

Пример 1. Получение сорбен- га с использованием яичного фосфати- дилхолинво 2 мл водно-этанольного геля фенил-сефарозы Cl-AB обезвоживают промывкой ацетоном и переводят в сухой дихлорэтан (10 мл). Добавля- ют 0,12 ммоль природного фосфатидил- холина в 1 мл сухого дихлорэтана. Смесь перемешивают и инкубируют 1,5 ч, после чего добавляют 0,60 ммол безводного хлористого алюминия. Ка- тализатор прибавляют небольшими порциями при перемешивании. Реакцию проводят 1,5 ч при 18-20 с и интенсивном перемешивании, особенно первые 5-10 мин. Реакционную колбу защищают от света. По истечении указанного времени к реакционной массе добавляют 10 мл водного ацетона. Смесь переносят на фильтр и промывают 30 мл водного ацетона для удаления катализа- тора, затем 20 мл ацетона, 30 мл хлороформа для удаления избытка фосфоли- пида, 10 мл ацетона, 50 мл 0,25%-ног тритона Х-100 для удаления неспецифически связанного с сорбентом фосфо липида, а для удаления детергента промывают водой. Полученный сорбент анализируют на фосфоро Степень связывания яичного фосфатидилхолина с полимером составляет 1,3-1,8 мкмоль лиганда/мл геля. Скорость протекания полученного сорбента по сравнению с исходной фенил-сефарозой не изменяется, для колонок 0,5x2,0 см состЛвляет 12-15 мл/ч.

Данные по примерам 2-20, контрольным примерам 21-23 и сравнительному примеру 24 приведены в табл,1„

П р и м е р 25. Выделение фосфоли пазы А яда осы. Навеску (4мг) лио- филизи1)ованного яда осы растворяют в I мл 0,05 М трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего 0,01 М и 0,2 M NaCl

Q ,.

,

Ь

5

(буфер l), и наносят на колонку 70 х X 0,55 мм с 2 мл полученного сорбента, содержащего 1,8 мкмоль липидно- го фосфора/мл геля, уравновещенного тем же буфером I, Белок инкубируют с сорбентом 4 ч при 4 С„ Баластные белки удаляют промыванием колонки буфером I (30 мл). Фермент элюируют с колонки в отсутствие ионов Са буфером II (0,05М трис-HCl, рН 7,5, 0,05М ЭДТА, 0,02М NaCl), содержащим 0,01% тритона Х-100 (19 мл)„ При последующем увеличении содержания тритона Х-100 до 0,1% в буфере для злюирова- ния не наблюдают выхода с колонки .белка и фосфолипазной активностИоСко- рость элюирования 12-15 мл/ч, температура 4 С.

Фосфолипазную активность измеряют методом потенциометрического титрования при постоянном рН. В качестве субстрата используют яичный лецитин. Реакцию проводят в термостатированной ячейке РН-стата при З7 с и рН 7,5. Реакционная смесь состоит из 2 мл 0,01 М тритона Х-100, содержащего 0,01 М СаС,,, и 0,05-0,1 мл 0,05М этанольно1-о раствора субстрата. Добавляя к реакционной смеси 0,05 - 0,1 мл ферментного раствора, регистрируют объем титранта (0,01М NaOH), прошедшего на поддержание постоянного рН в первые 10-15 с

Белок контролируют спектрофотомет- рически по поглощению при 280 нм и по методу Лоури. Результаты по очистке фосфолипазы Aj из ядов осы и большого шершня приведены в табл„2.

Формула изобретения

Способ получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков путем ковалентного связьшания полиса- харидной матрицы с ненасыщенным фос- фолипидом, о тлич ающийс я тем, что, с целью упрощения технологии, суспензию арилсодержащего сшитого полимера обрабатьшают раствором фосфолипида, за тем избытком хлорида алюминия в течение 1,5-2,0 ч при молярном соотношении фосфолипида и хлорида алюминия 1:5-6о

Таблица I

Изобретение относится к химии полимеров и может быть использовано в хроматографической технике для выделения липид-зависимых белков.Изобретение позволяет простым и удобным способом за 1,5-2 ч получить сорбенты для выделения липид-зависимых белков, что достигается ковалентным связыванием полисахаридной арилсодер- жащей матрицы с ненасыщенным фосфоли- пидом в присутствии AlClo при молярном соотношении фосфолипида и хлорида алюминия 1:5-6 в течение 1,5-2 ч 2 табл.

Условия получения сорОектов

по npofOTvny

0,08

Прям чляпл,

загрузки я результаты в примерах 1-26 приведены для

2 МП суспенэни полимера;

- происходит.разрушение гелеврй структуры полимера; v - качестве полимера используется АН-ч:ефароза 4В, в

качестве лиганда - окислениый йичиый фосФатидилхолии, приведено су аряое время процесса иммобилизации, состоящего из стадий: окислеиие яичного фосфатидил- холина - 2 ч, связывание фосфолилида с полимером - 24 ч, Олокрровавие непрореагировавших аминогрупп полимера - . 2ч. , ,.. Таблица 2

Исходный яд осы Фракция фосфолипа400

зы АЗ после биоспецифической хроматографии

0,24 360

Исходный яд большого шершня

Фракция фосфолипа- зы Ag после биоспе- цйфической хроматографии

18 6480

2,08 3912

Продолжение табл.1

28 1,2-2.5

400

100

100

1500

90

15 3,0

360 100

1880

64

3,2 2,9