Фаговый вектор @ К9 для конструирования геномных библиотек Советский патент 1991 года по МПК C12N15/63 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.

Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектораАЗКЭ.

Вектор ASK9 получен на основе AEMBL3 и фазмиды SK2 ASR. Он характеризуется следующими признаками: размер 48 т.п.н., емкость встраиваемой ДНК 4,5 - 19,0 т.п.н. Состоит из AEMBL3, соединенного с фазми- дой SK2 ASR. Фазмида SK2 ASR представляет собой фазмиду SK2A, в которой удалены Salf и EcoRI участки. Спектр хозяев для ASK9: LE392 F hsd R 514 (п. mk), sup Е 44. sup F 58, lac Y 1/OZ (lac I 2Y)6, gal K2, gal Т 22, met B1, trp R 55; J M 109 rec A1, Alacpro.end A1,gyrA96, thi-1, hsd R 17, sup E 44, rel A1. F1; tra D36,pro AS, lac lqZ ДМ15. Q359 hsd Rki hsd Mk , sup ф 80, p 2.

Полученный вектор позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с

использованием рестриктаэ Bam, Sau 3AI, MbOl и других, имеющих такие же липкие концы. ASK9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используется способ, принципиально отличный от запатентованного фирмой Stratagene.

Применение этого метода позволяет быстро, эффективно и стабильно осуществить перевод вставки в плазмидную форму. Для библиотек вА5К9 гарантированы невозможность суперинфекции фагом М13 и неконтролируемый перевод вставки ДНК в фаге А е одноцепочечную форму. ASK9 дает возможность, используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5- и 3-концы вставки, что удобно для целей прогулки по хромосоме.

Таким образом, применение ASK9 для конструирования геномных библиотек дает значительный выигрыш во времени.

О

ел о о ю

00

Пример 1. Способ заключается во введении в фаг AEMBL3 фазмиды SK2 ASR.

Стадия 1. ДНКфазмиды SK2A, гидроли- зуют рестриктазой Sal и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65°С. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полиме- разы 1 из E.coli в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов затупляют липкие концы. Затем раствор ДНК разводят в три раза и проводят самолиги- рование. Лигированную ДНК вводят в клетки E.coli штамм I.M.109, Рассев бактерий производят на чашки Петри с 2%-ным L-ara- ром, содержащим 25 мкг/мл ампициллина, 0,1% IPTG и 0,1% X-gal. Из десяти белых колоний по стандартным методикам выделяют ДНК и анализируют рестриктазами EcoRI, Baml, Sail. Фазмиду, содержащую EcoRI, Baml, но не содержащую SaM-участ- ков узнавания рестриктазами и названную SK2 AS, используют на следующей стадии.

Стадия 2. Удаление участка узнавания рестриктазы EcoRI в фазмиде SK2 AS. ДНК фазмиды SK2 AS гидролизуют рестриктазой EcoRI и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65°С. С помощью фрагмента Кленова в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов затупляют липкие концы. Затем ДНК разводят в три раза и проводят самолигирование. Лигированную ДНК расщепляют рестриктазой EcoRI и вводят в клетки E.coli штамм J.M.109. Рассев бактерий производят на L- агар с 25 мкг/мл ампициллином. Из десяти колоний по стандартным методикам выделяют ДНК и анализируют рестриктазами EcoRI, Baml и Sail. Фазмиду, содержащую Baml, но не содержащую EcoRI и Sail участков (названа SK2 ASR), используют на следующей стадии.

Стадия 3. Конструирование рекомби- нантной фазмиды gSR. ДНК фага Agt II гидролизуют рестриктазой Baml и фермент инактивируют прогреванием. Затем проводят отжиг липких концов фага А инкубацией раствора ДНК при 42°С в течение 1 ч, и центральный Baml - фрагмент размером около 6,5 тыс. пар нукл. очищают гель-электрофорезом в 0.7%-ной легкоплавкой агаро- зе (препарат А), ДНК фазмиды SK2 ASR гридролизуют рестриктазой Baml и после инактивации фермента прогреванием лиги- руют с препаратом А. Лигированную ДНК вводят в клетки E.coli штамм J.M. 109 и рассевают на L-arap с ампициллином (25 мкг/мл). С выросших колоний снимают отпечатки на нитроцеллюлозные фильтры и проводят гибридизацию с препаратом А, ДНК которого метят Р с помощью никтрансляции. Клетки из пяти колоний, гибри- дизующихся с препаратом А, наращивают в 10 мл L-среды с ампициллином (100 мкг/мл) и выделяют плазмидную ДНК стандартным

методом. Анализ полученной ДНК рестриктазами EcoRI, Baml, Sail подтверждает клонирование в фазмиде SK2 ASR участка Agtll. Эту фазмиду, названную gSR, используют в следующей стадии.

Стадия 4. Конструирование фага-вектора AgEs7. ДНК фазмиды gSR гидролизуют рестриктазой BgllJ и фермент инактивируют прогреванием. ДНК фага AEMBL3 гидролизуют рестриктазой Baml и фермент

инактивируют. Оба препарата ДНК в экви- молярных соотношениях смешивают и лиги- руют. Лигированную ДНК упаковывают в белки фага A in vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток E.coli

штамм LE392, содержащий 0,1% Х-ga,. Из десяти голубых бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Baml, Sail. Один из фагов, названный A gES7, имеет ожидаемую структуру. Его используют на следующей стадии. Стадия 5. Конструирование фага-вектора ASK9. ДНК фага EMBL3 гидролизуют рестриктазой Baml и вставочный фрагмент размером около 13,7 тыс.пар нуклеотидов

очищают гель-электрофорезом в 0,7%-ной легкоплавкой агарозе (препарат А). ДНК фага AgES7 гидролизуют рестриктазой Baml и плечи очищают гель-электрофорезом в легкоплавкой агарозе (препарат Б). Препараты А и Б в эквимолярных соотношениях смешивают и лигируют. Лигированную ДН К упаковывают в белки фага A In vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток E.coli, штамм LE392. Из шести

бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Baml и Sail. Один из фагов, названный ASK9, имеет ожидаемую структуру и используется для конструирования репрезентативных геномных библиотек.

Применение ASK9. Фаг ASK9 удобен для получения репрезентативных геномных библиотек по классической методике. ДНК фага ASK9 гидролизуют 10-кратными избытками рестриктаз EcoRI и Baml. Затем ДНК осаждают изопропанолом, причем значительная часть олигонуклеотидных фрагментов EcoRI - Baml остается в супер- натанте и после растворения осадка ДНК

получают концевые фрагменты (плечи ASK9 с липкими концами Baml и внутренний фрагмент с липкими концами EcoRI.

Геномную ДНК не полностью гидроли- эуют рестриктазой sau 3A1 (или МВО I) и

выделяют фрагменты размером 15-20 т.п.н. (с помощью гель-электрофореза или центрифугирования). Эти фрагменты лигируют с фаговой ДНК, обработанной, как описано выше, лигированную ДНК упаковывают в белки фага Я in vitro и образовавшимися фаговыми частицами заражают клетки E.colt. При этом обычно около 70% выросших фагов - рекомбинанты.

Следует отметить, что в ASK9 сохранена селекция в пользу рекомбинантных фагов и исходные, не рекомбинантные ASK9 не способны размножаться на клетках E.coli, лизо- генных по фагу Р2 (spl-фенотип) - штаммы Q 359, NM 539.

Вставка ДНК в ASK9 может быть легко переведена в плазмидную форму. При этом используют другой принцип, чем в AZAP. ДНК рекомбинанта ASK9 гидролизуют ре- стриктазой Sail (можно применять также Ctat) и инактивируют фермент 3-кратным замораживанием/оттаиванием. Обе ре- стриктазы достаточно редко расщепляют эукариотическую ДНК (5а1Тимеет в среднем один участок узнавания на примерно 50 тыс, пар нуклеотидов, a Clal - около 20 тыс, пар нуклеотидов). Затем ДНК разбавляют и са- молигируют. Лигированную ДНК вводят в компетентные клетки E.coli, которые высевают на L-arap с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку ДНК в плазмид- ной форме, причем плазмида либо вовсе не содержит нуклеотидных последовательностей фага Я (в случае Sail), либо небольшую их часть (в случае Clal). Процесс перевода в плазмидную форму быстр (3-4 ч) и эффективен (0.1 мкг/мл ДНК рекомбинанта дает много сотен колоний). Также какдля ASK12, для Я5К9 и его рекомбинантов существует и другой путь перевода в плазмидную форму - путь прямой инфекции фагом клеток E.coli, резистентных к литическому размножению фага Я, однако этот путь менее удобен и может быть полезен только для специальных опытов.

При суперинфекции клеток E.coli, содержащих плазмиду, фагом М13 ДНК плаз- миды упаковываются в белки фага в одноцепочечной форме, удобной для секве- нирования ДНК вставки по известному методу Сэнгера,

Емкость Я5К9 до 19 тыс. пар нуклеотидов, что вполне достаточно для получения репрезентативных геномных библиотек, поскольку при расчетах репрезентативности, библиотеки обычно исходят из средней вставки в 15 тыс. нуклеотидов.

Таким образом, фагА5К9 можно использовать для конструирования репрезентативных геномных библиотек по классическому методу. Основные преимущества предлагаемого вектора по сравнению с известным заключается в возможности

5 получения библиотеки генов без предварительной очистки плечей фага А, отбора против нерекомбинантных фагов, быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму, свободную от пле0 чей фага Я, а также возможности перевода в одноцепочечную форму для определения первичной структуры ДНК по методу Сэнгера, в гарантированное™ от возможности суперинфекции библиотеки в ASK9 фагом М13,

5 возможности специфического меченая 5л 3- и других участков вставки с использованием стандартных, доступных препаратов затравок.

0 П р и м е р 2. Клонирование в Я5К9 фрагментов геномной ДНК человека.

3 мкг ДНК человека расщепляют ре- стриктазой Baml в стандартных условиях и

5 инактивируют фермент прогреванием 15 мин при 65°С. 3 мкг ДНК ASK9 гидролизуют рестриктазами Baml и Eco RI и инактивируют ферменты прогреванием. Оба препарата смешивают (весовое соотношение ДНК век0 тора и геномной ДНК 1:1) и проводят лигирование при суммарной концентрации ДНК

250мкг/мп 1 10 мкг лигированной ДНК

упаковывают в белки фага Я In vitro л 1/500

полученных Фаговых частиц рассевают на

5 газон E.co iv штамм Q 359. Из шести случайно отобранных бляшек в 10 мл L-среды с LE492 выращивают фаги и выделяют из них ДНК. Электрофоретический анализ ДНК показывает, что все они рекомбинанты и со0 держат вставку ДНК 10 - 15 тыс. пар нуклеотидов, 0,5 мкг ДН К одного из них (№1) гидролизуют в течение 30 мин 1 ед. рестрик- тазы ЗаИ. Фермент инактивируют 3-кратным замораживанием/оттаиванием. ДНК

5 разводят и лигируют при комнатной температуре в течение 1 ч 0,1 мхг лигированной ДНК добавляют к компентентным клеткам E.coli штамм J.M. 109, инкубируют 10 мин при 0°С, а затем 5 мин при 38°С и после

0 добавления 1 мл L-среды еще 45 мин при 37°С. Затем 0,2 мл клеток рассевают на L-arap с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл L-среды с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10мл L-среды

5 с ампициллином (50 мкг/мл) наращивают клетки и выделяют ДНК щелочным лизисом. Электрофоретический анализ ДНК показывает, что плазмиды содержат ту же вставку ДНК, что и исходный фаг № 1.

Формула изобретения Фаговый вектор ASK9 для конструирования геномных библиотек размером 47,7 т.п.н., содержащий Cos - Salf - фрагмент ДНК фагаЛЕМВ1-3 - левое плечо размером 20,3 т.п.н.; Sal - BgllJ - фрагмент ДНК фаз- миды SK2A размером 3,8 т.п.н., в котором методом достройки уничтожен EpoRI-уча- сток; Baml - Baml фрагмент ДНК фага AEMBL3 размером 13,7 т.п.н.; Baml - Bamll - фрагмент ДНК фазмиды SK2A размером 0,7 т.п.н., в котором методом до

стройки уничтожен Sail-участок; Sal| - Cos - фрагмент ДНК фаraAEMBL.3- правое плечо, размером 9,2 т.п.н.; места возможной вставки чужеродной ДНК по участкам узнавания рестриктаз Baml и EcoRI; емкость вектора 4,4 - 19,0 т.п.н.; спектр хозяйств: штаммы Escherlchla coll: LE 392 F hsd R 514 (n/, miO, sup 44, sup F 58, lac Y 10Z (lac IZY)6. galK 2, gal T22, met B1. trp R 55; JM109 rec A1, Лас pro, end A1,gyrA96, thl-1, hsd R 17, sup E44, rel A1, F1; Q359 hsdRk, hsdMk+, supF, ф 80, P2.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является упрощение способа конструирования геномных библиотек при использовании вектора ASK9. Вектор ASK9 получен на основе фага AEMBL3 и фазмиды. Он позволяет получать репрезентативные геномные библиотеки с использованием рестриктаз BamHI, SauSAI. MBOI и других, имеющих такие же липкие концы. ASK9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную форму, а также используя коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5 и Звонцы вставки, что удобно для целей прогулки по хромосоме.