Способ идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в астности к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано в клинической и лабораторной практике для идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем. что пробы лимфоцитов параллельно обрабатывают теофиллином и колхицином в конечной концентрации 3 мкг/мл - 7 мкг/мл, после инкубации и отмывания к пробам приливают раствор акридинового оранжевого в разведении 1:30000 и учетом количества Т-хелперов

и Т-супрессоров ведут по интенсивности флюоресценции проб и при активации лимфоцитов колхицином определяют Тхелперы. а при активации лимфоцитов теофиллином -Т-супрессоры.

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты в равных количествах перед инкубацией с акридиновым оранжевым обрабатывают следующим образом. Одна проба лимфоцитов служит контролем, другую пробу обрабатывают теофиллином. а третью пробу колхицином в конечной концентрации 3 мкг/мл-7 мхг/мл, После инкубации при 37°С и 45 мин пробы отмывают. добавляют акридиновый оранжевый, инкубируют при 4°С 30 мин, после чего центрифугируют и на спектрофлюориметре при Я 530 нм (А возбуждения 460 нм) измеряют интенсивность флюоресценции надосадочной жидкости. Количество Т-хелперов и Т-супрессоров определяют по формуле

Ал

100%.

Ак

AK:I.AX

е А 400%W

где Ак - количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами, контроль;

АС - количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами после обработки их теофиллином;

Ах - количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами после обработки их колхицином.

Конкретные примеры осуществления способа.

П р,и м е р 1. Из исследуемой крови донора № 1 выделяют на фиколл-уротрасте лимфоциты, которые в равных количествах вносят В 3 пробирки. Лимфоциты первой пробы служат контролем, к ним приливают 2 мл физиологического раствора. Лимфоциты второй пробы обрабатывают теофиллином, лимфоциты третьей пробы - колхицином, в конечной концентрации 3 мкг/мл - 7 мкг/мл. Оптимальной дозой колхицина является концентрация А мкг/мл. Общий объем каждой пробы доводят до 2 мл фидиологическим раствором. После инкубации проб при 37°С в течение 45 мин лимфоциты отмывают от реагентов при 1500 об/мин в течение 10 мин и к лимфоцитам в первоначальном объеме 2 мл приливают 2 мл раствора акридинового оранжевого. Пробы инкубируют 30 мин при 4°С, затем центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют интенсивность флюоресценции в контрольной и опытных пробах. Разность величин флюоресценции раствора акридинового оранжевого и контрольной пробы, а также опытных проб дает представление о количестве связавшегося акридинового оранжевого.

По формуле вычисляют количество Т-хелперов и Т-супрессоров

Тх g -100% 30%;

Тс ™ -100%-20%.

Пример 2. Все операции с лимфоцитами донора Ыг 2 осуществляют аналогично примеру 1.

По формуле вычисляют Т-хелперов и Т-супрессоров

7 - 4 ц

Т . .

100%-35.7%;

Тс -1-А . 100%-14,4%.

В работе было обследовано 14 доноров.

Результаты, полученные предлагаемым

способом, сравнивали с результатами, полученными методами теофиллиновых розеток и с помощью моноклональных антител (фирма Couetcr, США).

Результаты представлены в табл.3. Таким образом, результаты, полученные предлагаемым методом, приближаются к результатам, которые были получены методом моноклональных антител, так как между ними не было достоверных различий. Не было достоверных различий и в количестве Т-супрессоров, определенных методом теофиллиновых РОК. Однако в количестве Т-хелпероа такие различия имели место (р 0,01), что указывает на повышение точности результатов.

Формула изобретения

Способ идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров, включающий обработку лимфоцитов теофиллином путем инкубации, отмывания с последующим учетом количества Т-хелперов и Т-супрессоров. отличающийся тем. что. с целью ускорения и повышения точности способа, параллельно пробу лимфоцитов обрабатывают колхицином 8 конечной концентрации

3 мкг/мл - 7 мкг/мл. затем раствором акридинового оранжевого в разведении 1;30000 и учет количества Т-хелперов и Т-супрессоров ведут по интенсивности флюоресценции;, и при аюмвации Л1«4фоцитов колхицином определяют Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллином - Т-супрессоры.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано дляидентификации Т-хелперов и Т-супрессоров при оценке имунного статуса организма в норме и при патологии. Целью изобретения является ускорение и повышение точности. Способ осуществляется путем обработки лимфоцитов параллельно теофиллином и колхицином в конечной концентрации 3-7 мкг/мл. инкубац.ии, отмывания с последующей обработкой проб раствором акридинового оранжевого в разведении 1:30000. Учет количества Т-хелперов и Т-супрессоров ведут по интенсивности флюоресценции и при активации лимфоцитов колхи1|;ином определяют Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллионом - Т-супрессоры. Способ позволяет оценить физиологическую активность субпопуляций Т-лимфоцитов хелперов. супрессоров по активности дезоксирибонуклеопротеид- ного комплекса. 3 табл.с/>& С

Различия достоверные (р 0,01).

Таблица 2

Таблица 3