Способ определения антител к лептоспирам Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности, к серологической диагностике инфекционных болезней.

Цель изобретения - повышение чувствительности иммуноферментного метода при определении лептоспирозных антител. .

Указанная цель достигается тем, что гипериммунная лептоспирозная сыворотка предварительно адсорбируется на взвесь инактивированных клеток стафилококка штамма Кован 1 и весь комплекс метится гферментом каталазой.

Заявляемый способ отличается от прототипа сочетанием новых условий: использование взвести стафилококка для ориентации антител к лептоспирам и мечение комплекса , стафилококк-антитела к лептоспирам ферментом каталазой.

Эти особенности позволяют улучшить условия связывания антител с антигеном на планшете, что повышает чувствительность метода, повысить содержание каталазы на комплексе, что также повышает чувствительность метода, проводить определение антител к лептоспирам в сыворотках, независимо от их видового происхождения.

При изучении патентной литературы по постановке иммуноферментного метода при определении антител к лептоспирам сходных признаков по существу заявляемого способа авторами не обнаружено.

Пример. Приготовление конъюгата по предлагаемому способу. К 1 мл 20 млрд взвеси инактивированного прогреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин стафилококка штамма Кован 1 добавляют 1 мл лептоспирозной сыворотки в разведении 1:20. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 60 мин при 40°С после чего трижды отмывают 0.9%-ным раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение ТО мин. Осадок нагруженного антителами стафилококка ресуспенди- руют до 1 мл и добавляют каталазу в объеме 1 мл из расчета 5 мг/мл, перемешивают и вносят 0.1 мл 1%-ного водного раствора глу- тарового альдегида. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3 ч и трижды отмывают 0.9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0.05% твина-20. Осадок суспендируют в 5 мл 0.9% раствора хлорида натрия, содержащего 0,05% твина-20.

ел

с

со hO

о со

Ю

ел

Для мечения комплекса стафилококк- антитела к лептоспирэм нами использована каталаза. производства США Calbiochem активностью 8512 IU/mg.

Параллельно готовили коныогаты пе- роксидазы хрена с натиглобулинрвыми сыворотками (Горьковский НИИЭМ) по известному способу и кроме того, использовали коммерческую тест-систему (Ставропольский НПО Аллерген) для определения антител к лептоспирам.

На планшеты Ленинградского завода полимеров наносили лептоспирозный родо- специфический антиген в дозе 10 мкг /мл. Планшеты выдерживали не менее 24 ч при комнатной температуре и трижды промывали 0.9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% твина-20. Кроме того, применяли планшеты, сенсибилизированные лептоспирозным родоспецифическим антигеном, производства НПО Аллерген.

Рабочие разведения полученных конь- югатов определяли путем прямой постановки ИФА (планшет с адсорбированным антитегн ом + коныогат в разведениях от 1:50 до 1:3200). Результат ИФА регистрировали визуально.

При постановке основных опытов на планшеты с адсорбированным антигеном наслаивали гомологические и гетерологические сыворотки от больных с диагнозом лептоспи- роз. шигеллез, эшерихиоз. подтвержденными бактериологически, и гипериммунные сыворотки лептоспирозные, шигеллезные и эшерихиозные. Сыворотки наслаивали в объеме 0.1 мл в разведенных от 1:25 до 1:51200. После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% твина- 20.

Далее в планшеты вносили коныогаты в рабочем разведении: собственного приготовления - 1: 800, а коммерческие -согласно инструкции, прилагаемой к тест-системе. После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0.9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% твина-20.

Для проявления каталазы в планшеты вносили по 0,025 мл 0,3% раствора перман- ганата, а перед этим за 30 мин - 0,0015%- ный раствор перекиси водорода. В случае

присутствия каталазы происходит разложение перекиси водорода и пермэнгандт калия не теряет своей фиолетовой окраски. В присутствии перекиси водорода перманганат калия за несколько секунд меняет цвет на ярко желтый. Проявление перокси- дазы проводили хромогенной смесью, состоящей из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. В случае присутствия

пероксидазы цвет в лунках - коричневый или коричнево-розовый. При отсутствии - цвет слабо розовый или бесцветный. Проявление фермента в тест-системе проводили согласно инструкции.

. Сравнительная чувствительность определения антител и специфичность предлагаемого метода приведены в таблице.

Сравнительная чувствительность методов показала преимущества предлагаемого

способа в 2-4 раза по сравнению с известным методом определения антител к лептоспирам. Результаты реакции после внесения перманганата калия четкие, появляются через несколько секунд и сохраняются в течение нескольких дней.

Специфичность предлагаемого метода проверена при внесении в планшеты с адсорбированным лептоспирозным антигеном гомологичных и гетерологичных

антисывороток (таблица). Как показанб, специфичность всех изучаемых методов оказалось достаточно высокой и аналогичной.

Таким образом, нами разработано новое техническое решение постановки иммуноферментного метода на основе каталэзы, имунной лептоспирозной сыворотки и взвеси стафилококка штамма Кован 1, с более высокой чувствительностью определения антител к лептоспирам.

Формула изобретения

Способ определения антител к лептоспирам, включающий адсорбцию антигена на твердофазном носителе, инкубацию с иммунной сывороткой и визуализирующим

агентом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве антигена используют комплекс гипериммунной лептоспирозной сыворотки, адсорбированной на инактивированные клетки стафилококка штамма Кован и коньюгированный с каталазой.

Чувствительность и специфичность метопов на примере нескольких сывороток

Использование: медицинская биохимия, серологические способы диагностики инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: в качестве антигена используют комплекс стафилококка Кован 1, с гипер- имунной лептоспирозной сывороткой, конь- югированный с каталазой. 1 табл.