Способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

(Л

С

СПОСОБ йоЗ УЧЕИИЯ АУКСОТРОФНЫХ ШТАНТОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ путем вырсшщвания исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обработанной культуры на плотных питательных средгис и отбором мутантов,, отличающийся тем, что, с целью повьшения частоты выделения Актантов, исходную культуру выращивают в жидкой питательной среде, в качестве | 4утагена используют у)ренный холерный фаг и обработку проводят в полужидком агаре.

:о X о :о У1 Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии. Известен способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов путем выращивания исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мута геном, пассированием обратанной кул туры на плотных питательных средах отбором мутантов l . Однако известный способ сложен и имеет низкую частоту выделения му тантов при проведении генетических исследований. Целью изобретения является повышение частоты выделения мутантов., Эта цель достигается тем, что пр осуществлении способа получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов путем выращивания исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обработанной культуры на плотных питательных средах и отбором мутантов, отличительной особенностью является то, что исходную культуру выращивают я жидкой питательной среде, в качестве мутагена используют умеренный холерный фаг и обработку проводят в полужидком агаре. Способ осуществляют следующим об разом. Засевают петлю суточной агаровой культуры холерного вибриона в S МП бульона Мартена (рН 7,6-7,8) инкубируют при 37°С 4 ч. Затем 0,3 мл молодой культуры переносят в пробирку с 4 мл 0,7%-ного агара, растопленного и остуженного до 45 и высевают двухслойным методом на поверхности 1,5% агара Мартена в чашке Петри. После застывания верхнего слоя на газон культуры наносят 2 капли умеренного холерного фага в виде дорожки. Посев ставят в те мостат на сутки при температуре выращивания 37°С . На следуквдий день вырезают участки вторичного роста по дорожке фагового лизиса и помеща ют в пробирку с 5 мл физиологическо раствора. Центрифугируют содержилюе пробирки 20 мин при 3000 об/мин. На садочную жидкость удаляют, затем до бавляют к осадку физиологический раствор до первоначального объема и пробирку помещают в термостат до следующего дня. Через сутки содержи мое пробирки центрифугиру1дт при те же условиях, удаляют надосадочную жидкость, добавляют физиологический раствор. Пбхпученную суспензию титру ют до 10 И высевают из разведений 10 , 10 , по 0,1 мл на агаровые пластинки, чтобы получить рос изолированных колоний (основной посев,исходная чашка).Выращивают 1824 ч при 37 С .Выросшие колонии методом реплик переносят на минимальную среду.После 4а ч инкубации при 37 С с исходной чашки петлей отбирают колонии, не выросшие на минимальном агаре , и готовят взвесь в 1 мл физиологического раствора.По 1 капле взвеси наносят на минимальный агар,агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки. Устанавливают зависимость от тех или иных факторов роста по общепринятой схеме Холлидея. Минимальную ере: ду готовят на забуферном агаре с добавлением сульфата аммония (0,5мл 20%-ного раствора на 100 мп), глю. козы (0,5 мл 40%-ного раствора на 100 мл). Аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания добавляют после предварительной стерилизации в концентрации 100,мкг/мл среды, витамины после дробной стерилизации в концентрации от 0,001 до 0,1 мкг/мл. Изученные колонии ауксотрофов пересевают с основного посева в столбик 0,3% агара и сохраняют прикомнатной температуре. Пример. Засевают петлю суточ ной агаровой культуры штамма холерных вибрионов Эль Тор 75 в 5 мл буль она Мартена (рН 7,6 - 7,8) и выращивают -при 37°С 4 ч. Затем 0,3 мл молодой растущей культуры вносят в 4 мл 0,7%-ного агара, растопленного и остуженного до 45С, и высевают двухслойным методом на поверхность 1,5%-ного агара Мартена. Через 20 мин на газон культуры наносят 2 капли умеренного холерного фага 8556 в виде дорожки. Умеренный фаг 8556 получают из одноименного штамма холер ных вибрионов Эль Тор. Штамм - продуцент фага 8556 (инаба) хранится в стобике 0,3% агара Мартена под слоем вазелинового масла. Фаг получают общеприятным методом. Умеренный фаг образует мутные негативные колонии с прозрачным ободком, в диаметре 1-2 мм. Относится по П серологичемкому типу фага. Титр фага, используемого в предлагаемом способе, может варьировать от п. 10 - п.10 фагочастиц в 1 мл. После нанесения . фага на газон культуры посев ставят в термостат на сутки при . На следующий день скальпелем вырезают участки лизиса с вторичным ростом фагоустойчивости культуры и помещают в пробирку с 5 мл физиологического раствора. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема, и культуру помещают в термостат при 37°С . Через 24 ч выращивания пробирку со взвесью центрифугируют при тех же условиях, как описано выше, удаляют надосадочную жидкость, добавляет физиологический раствор к осадку. Полученную микробную суспензию титруют до 10 и высевают 10 по из разведений Ю , 10 0,1 МП на агаровые пластинки, чтобы получить рост изолированных колоний (основной посев, исходная чашка). Выросшие колонии переносят на минимальную среду методом реплик. Отбор ауксотрофных мутантов, не выросших на минимальной среде, ведут через 2 суток наблюдения с основного посе ва. Петлей отбирают часть колонии с исходной чашки в 1 мл физиологического раствора в пробирке. По 1 капле взвеси наносят на минимальный агар, агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки, по ойцепринятой схеме Холлидея. Учитывают результат. Через 1-3 суток выращивания при 37° отмечают рост на ага ре Мартена и средах, содержащих те или иные дополнительные факторы роста. На минимальной среде рост ауксотрофных мутантов отсутствует. Колонию ауксотрофного кутанта сни-. мают петлей ц исходной чашки в столбик О,3% агара и сохраняют при комнатной температуре. Предложенный способ применен на 7 штаммсис вибрионов Эль Тор; 75, 6216, 3639, 5879, 1861-34, 757, 8860, нелизогенных, с прототрофным типом питания. Установлено,что предложенный способ прост по технике выполнения, легко осуществим, сокращение числа переносов ауксотрофов позволяет повысить частоту выделения мутантов при проведении генетических исследований.