ЛИНЕЙНЫЕ ИЛИ ЦИКЛИЧЕСКИЕ ОЛИГОПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СРОДСТВОМ К ОПИАТНЫМ РЕЦЕПТОРАМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 1999 года по МПК C07K7/06 C07K7/64 A61K38/08 A61K38/12 

Изобретение относится к новым олигопептидам, обладающим сродством к опиатным рецепторам, которые могут быть линейными или циклическими пентапептидами с первичной последовательностью аминокислот в скелете Тир-Х-Фен-Лей-Z, где X и Z обозначают аминокислоты или производные аминокислот и/или аналоги и где X и Z могут быть ковалентно связаны, образуя гетероциклическую структуру, в которой Z выбирают из Цис, Глу, Глн или производных Глу и Глн; X выбирают из аминокислот или аминокислотных аналогов, таких как Сер, Глу, D-Ала, D- или Z-2,4-диаминомасляная кислота, АМЦК, Цис или их производные.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим препаратам, содержащим новые олигопептиды, которые являются потенциально полезными в качестве анальгетиков для облегчения боли и повышения комфорта индивидуумов, страдающих от экстраординарного стресса или шока, а также для уменьшения депрессий и для возможного лечения лиц, страдающих опийной наркоманией.

Врачи, занимающиеся лечением пациентов с нехваткой гормона роста с помощью гормона роста человека, часто сообщают о том, что их пациенты обладают заметным улучшением состояния по сравнению с контрольной группой, не проходящей лечение. Была обнаружена статистически достоверная разница между этими группами, в том что касается социальной изоляции, физической активности, сна и эмоционального статуса /смотри Acta Paed. Scand. (приложение), т. 356, стр. 55-59, S. Bjork и др., и Acta Paed. Scand (приложение), т. 356, стр. 70-72, 1989, GA Mc Cauley/.

В клинике наблюдали также некоторые вторичные эффекты, касающиеся центральной нервной системы /ЦНС/, при лечении гормоном роста человека. Было высказано предположение, что опиоидно активные пептидные фрагменты, высвобождающиеся из гормона роста, могут достигать ЦНС, если плазма крови человека обладает протеолитической активностью, способной их высвободить. Если такие фрагменты проходят через гематоэнцефалический барьер, они могут воздействовать на ЦНС. Эти исследования свидетельствуют, что гормон роста человека воздействует на ЦНС и что ферментативно высвобожденные фрагменты могут взаимодействовать с опиоидными рецепторами.

Ряд исследований показал, что ферментативно обработанные препараты белков могут включать пептиды с опиодной активностью, такие как β-казоморфин, цитохрофины и гемоморфины. β-Казоморфин происходит из пептона, полученного при распаде бета-казеина, и был раскрыт ранее в Physiol. Chem., т.360, стр. 1211-16, 1979, V.Brantl и др., Pharmacol. Sci., т.4, стр. 193, 1979, V.Brantl и др., Eur. J. Pharmacol., т.106, стр. 213-214, 1884, V. Brantl и др., и J. Chin. Endocrinol. Metab., т.68, стр. 289-9, 1989, F. Nyberg и др.

Было показано также, что полученные ферментативной обработкой фрагменты митохондриального цитохрома B содержат цитохрофины, другие опиоидные пептиды /смотри Eur. J. Pharmacol., т. 111 стр. 293, 1985, V. Brantl и др./. Ссылку на гемоморфины смотри в Eur. J. Pharmacol., 125, стр. 309-10, 1986, V. Brantl и др. Опиоидная активность этих пептидов была подтверждена путем испытания их способности ингибировать электрически индуцированные сокращения препарата продольной мускулатуры и нервного сплетения мышечной оболочки подвздошной кишки морской свинки, а также при исследованиях с рецепторами.

Некоторые циклические олигопептиды, обладающие активностью в отношении опиатных рецепторов, ранее были раскрыты J. De Maio и др., в Proc. Natl. Acad. Sci. , том 77(12), 1980, стр. 7162-6; в этой статье обсуждался и приготавливался ряд циклических аналогов энкефалинов. Циклические олигопептиды, обладающие сродством к опиоидным рецепторам, раскрываются также в J. Med. Chem., т. 35, 1992, стр. 3956-3961, P. Schiller и др. Патент США 4254024 (J. Stewart и др.) раскрывает класс тетрапептидов, обладающих опиоидной активностью, что было доказано на препарате подвздошной кишки морской свинки общей формулы H-Тир-X-Y-Z. Еще одна ссылка на линейные тетрапептиды, связывающие опиатные рецепторы, находится в Европейской патентной публикации EP 350221.

В предыдущем исследовании изучались две различные пептидазы на предмет их способности высвобождать фрагменты гормона роста человека, которые могут взаимодействовать с опиоидными рецепторами. Этими ферментами были коммерчески доступный трипсин и эндопептидаза, выделенная из плазмы крови человека. Фрагменты разделяли посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой и затем изучали анализом с опиоидными рецепторами, выполненными с синаптическими плазматическими мембранами из мозга крысы /без мозжечка/. Результаты показали, что активные в отношении рецепторов фрагменты высвобождались как трипсином, так и эндопептидазой. Однако при исследовании на препарате продольной мускулатуры и нервного сплетения подвздошной кишки морской свинки было обнаружено, что эти фрагменты менее активны по сравнению с бета-казоморфинами /фрагментами казеинового пептона/. Эти открытия были обнародованы на 4-м конгрессе Европейской нейроэндокринологической ассоциации (Santiago de Compostela, 28-30 июня 1989 г.).

Когда изучалась аминокислотная последовательность пептидов, полученных триптическим расщеплением гормона роста человека, было отмечено, что некоторые последовательности напоминали таковые бета-казоморфина. Эти новые олигопептиды с предполагаемой опиоидной активностью представляли собой тетра- или пентапептиды с последовательностью Тир-Глу-Лей-Лей и Тир-Сер-Фен-Лей-Глн. Эти олигопептиды были синтезированы и несколько модифицированы в пентапептиде, глутамин был заменен на глутаминовую кислоту. Эти пептиды затем испытывали на сродство к опиатным рецепторам сравнительно с β-казоморфином /смотри табл. 1/. Испытания неожиданно показали, что новый олигопептид Тир-Сер-Фен-Лей-Глу обладал почти таким же сродством к опиатным рецепторам, как у β-казоморфина.

Как следствие, этот результат привел нас к более многочисленному ряду новых олигопептидов, которые являлись линейными или циклическими аналогами Тир-Сер-Фен-Лей-Глу. Эти новые пептиды показали высокое сродство к опиатным рецепторам при сравнении со структурно родственными тетрапептидами, раскрытыми в вышеупомянутом патенте США 4254024 /см. табл. 2/.

Настоящее изобретение относится к новым олигопептидам, обладающим сродством к опиоидным рецепторам, которые получены из последовательностей, существующих в природном гормоне роста человека. Эти новые олигопептиды описываются общей формулой Тир-X-Фен-Лей-Z, где X и Z обозначают аминокислоты, их производные или аналоги, в которых X и Z могут быть ковалентно связаны, образуя циклические соединения

Если олигопептид является линейным, X представляет Сер, Глу, Про, АМЦК /транс-(4-аминометил)-циклогексан карбоновая кислота) или D-Ала, а Z представляет Глу или Глн или их аминопроизводные.

Некоторыми предпочтительными линейными олигопептидами согласно настоящему изобретению являются Тир-Сер-Фен-Лей-Глу, Тир-Сер-Фен-Лей-Глу-NH₂, Тир-D-Ала-Фен-Лей-Глу, Тир-Про-Фен-Лей-Глу. Эти линейные олигопептиды можно легко приготовить, следуя нижеприведенным примерам.

Циклические олигопептиды настоящего изобретения можно циклизировать с помощью боковой цепи аминокислоты или окислением двух цистеиновых групп.

Для получения аналогов Тир-Сер-Фен-Лей-Глу с циклической структурой аминокислоту номер два, серин, необходимо заменить на D- или L-2,4-диаминомасляную кислоту (D- или L-Дам), D- или L-лизин или D- или L-цистеин. Аминокислота номер пять может быть заменена на глутамин, глутаминовую кислоту или их аминопроизводные или цистеин.

В общей циклической формуле

согласно настоящему изобретению могут быть использованы следующие аминокислоты: X = D- или L-2,4-диаминомасляная кислота (D- или L-Дам), D-Орн, D- или L-Лиз или D- или L-Цис, а Z = Глу или его аминопроизводные или Цис, с тем условием, что если X = D- или L-Цис, то Z=Цис.

Предпочтительными циклическими олигопептидами согласно настоящему изобретению являются Тир-цикло (D-Лиз-Фен-Лей-Гли) с пептидной связью между альфа-карбоксильной группой глутаминовой кислоты и эпсилон-аминогруппой лизина, Тир-цикло (D-диаминомасляная кислота-Фен-Лей-Глу) и циклические пептиды

которые циклизируются окислением двух цистеиновых групп.

Эти циклические олигопептиды имеют гетероциклическую структуру, родственную энкефалинам, и описаны J. De Maio и др. в вышеупомянутой статье.

В исследованиях, описанных в примере 3 и табл. 1 и 2, ясно показано, что олигопептиды настоящего изобретения обладают высоким сродством к опиоидным рецепторам и особенно к μ- и δ-рецепторам. Было также показано, что циклические олигопептиды являются функциональными агонистами и обладают высокой биологической активностью как опиоиды, что измерено на стимулированных срезах подвздошной кишки морской свинки в сравнении с норморфином /табл. 2/.

Линейные пептиды показали по сравнению с циклическими пептидами значительно более низкую биологическую активность, что может наделять их свойствами действовать как частичные агонисты опиатных рецепторов или, при определенных обстоятельствах, как антагонисты.

Следует отметить, что биологическая активность линейных пептидов значительно снижена, даже у тех из них, которые обладают высоким связывающим сродством к μ-рецепторам. Предполагаемые частичные агонисты ингибировали агонистические реакции норморфина и названных циклических пептидов в равной степени с функциональными антагонистами.

Линейные и циклические олигопептиды настоящего изобретения предоставляют новую возможность приготовления лекарственных средств для облегчения боли, для повышения комфорта пациентов, страдающих от шока или стресса, или для лечения депрессий, для введения лицам, страдающим нарушением уровней, эндогенного морфина и опиатных аналогов или, потенциально, для лечения опиоманий. Специалист легко найдет дополнительные фармакологические способы использования отдельных олигопептидов настоящего изобретения, которые обусловливаются их свойствами агонистов, частичных агонистов или антагонистов опиоидных рецепторов.

Приемлемыми являются несколько лекарственных форм новых олигопептидов. Можно изготавливать пероральные, чрескожные и/или парентеральные лекарственные формы с подходящими носителями и/или растворителями и стандартными стабилизаторами и активаторами.

Новые олигопептиды легко могут быть приготовлены в форме лекарственных средств для разных способов введения, таких как пероральный, назальный, парентеральный, энтеральный или трансбуккальный.

Различные модификации и эквиваленты настоящего изобретения, такие как соли и производные олигопептидов настоящего изобретения, очевидны для специалистов и находятся в пределах рамок настоящего изобретения. Настоящее изобретение также не ограничивается специфическими примерами и вариантами осуществления, приведенными в настоящем документе.

Фиг. 1 показывает типичную диаграмму жидкостной хроматографии высокого разрешения продуктов триптического расщепления гормона роста человека (Crescormon^®). Распределение активности в отношении опиатных рецепторов представлено темными столбиками.

Фиг. 2 показывает образец жидкостной хроматографии высокого разрешения рецепторной активности при использовании Genotropin^® в качестве субстрата триптического расщепления. Распределение активности в отношении опиатных рецепторов представлено темными столбиками.

Фиг. 3 и 4 показывают изучение связывания изобретенных олигопептидов. Рисунки показывают кривые распределения связывания Тир-Сер-Фен-Лей-Глу и Тир-Гли-Лей-Лей с мембранами крысы, с использованием в качестве меток (³H)D-АГО /фиг. 3/ и (³H)D-AD-Л /фиг. 4/.

Табл. 1 представляет начальные данные связывания для олигопептидов настоящего изобретения по сравнению с β-казоморфином; табл. 2 представляет результаты изучения сродства к опиоидным рецепторам и активности олигопептидов настоящего изобретения по сравнению с имевшимися данными для тетрапептидов.

Пример 1. Ферментативное расщепление гормона роста.

Препараты гормона роста человека (Crescormon^® и Genotropin^®, м22000 ед.) поставила фирма Kabi Pharmacia AB /Стокгольм, Швеция/. Crescormon^® был выделен из свежезамороженных гипофизов человека, в то время как Genotropin^® был приготовлен с помощью генной технологии. Трипсин, обработанный ТРСК, из поджелудочной железы крупного рогатого скота был получен от фирмы Sigma /Сент-Луис, Миссури, США/. Хроматографические материалы Сефадекс G-100 и Сефадекс G-25 /PD-10/ поставила фирма Pharmacia /Уппсала, Швеция/. Все остальные химические реактивы и растворители были стандартными коммерческими препаратами.

Приготовление эндопептидазы плазмы.

20 мл плазмы, взятой у небеременной и не находящейся в послеродовом периоде женщины детородного возраста, фракционировали на колонке с Сефадексом G-100 /5 • 90 см/. Колонку элюировали 20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, и собирали 20 мл фракции при скорости элюирования 80 мл/ч. Аликвоты /1 мл/ фракций обессоливали на колонках с Сефадексом G-25 /PD-10/ и лиофилизировали перед анализом на ферменты. Активные фракции собирали, объединяли и сохраняли в замороженном виде до начала дальнейших исследований. Дальнейшая очистка производилась посредством хроматографии с ДЭАЭ-Сефарозой CZ-6B. Колонку /2 • 12 см/ уравновешивали 20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, и после наложения образца элюировали линейным градиентом NaCl /0 - 0,5 М/, содержащим тот же Трис-HCl буфер. Фракции по 10 мл собирали при скорости элюирования 100 мл/ч и обрабатывали как описано выше перед исследованием на ферменты.

Жидкостная хроматография высокого разрешения.

Жидкостная хроматография высокого разрешения с обращенной фазой осуществлялась с использованием инструмента Pharmacia /LKB (см. F. Nyberg и др., J. Chromatogr. т. 359, 1986, стр. 541-551), снабженного колонкой Spherisorb TSK-ODS-120 DT /4,6 • 250 мм, размер частиц 5 мкм/. Колонку элюировали линейным градиентом ацетонитрила /15 - 60%/, содержащим 0,04% трифторуксусной кислоты /ТФУ/. Образец растворяли в 200 мкл исходного буфера. Фракции по 0,5 мл собирали при скорости элюирования 0,5 мл/мин и выпаривали перед исследованием с рецепторами.

Ферментативное расщепление.

Лиофилизированный трипсин или ферментативные фракции плазмы растворяли в 100 - 200 мкл 0,4 М раствора бикарбоната аммония /pH 7,8/ и инкубировали с 0,2 - 1,5 мг гормона роста человека при 37^oC в течение 5 - 8 ч в конечном объеме 250 мкл. Реакцию прекращали добавлением 1 мл ледяного метанола. Образец выпаривали в концентраторе Savant Vac /Хиксвилл, Нью-Йорк, США/ перед дальнейшим исследованием с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой.

Результаты.

Фиг. 1 показывает типичную ЖХВР-хроматограмму триптического расщепления гормона человека (Crescormon^®). Как можно видеть, отмечено два пика с рецепторной активностью. Когда в качестве субстрата использовали Genotropin^®, образец распределения рецепторной активности демонстрировал некоторые отличия /фиг. 2/. Большой пик, элюированный в 31 фракции, продолжал доминировать. Однако пик, наблюдавшийся в 18 фракции расщепления препарата Crescormon^® /фиг. 1/, почти выпал, как показано на фиг. 2. Единственным объяснением может служить тот факт, что препарат Crescormon^® содержит больше дезамидированных форм гормона и такие формы могут быть более чувствительными в отношении ферментативного расщепления, что обсуждалось в других источниках (Biochem. Biophys. Acta., т. 625, 1980, стр. 255-260, F. Nyberg и др./. Фермент плазмы дал несколько рецепторно-активных фрагментов, отмеченных с помощью радиорецепторного исследования ЖВХР.

После разделения на колонке с Сефадексом G-100 было обнаружено, что этот фермент элюировался в позиции, соответствующей белку с молекулярной массой 100-110 кед. Дальнейшая очистка фермента плазмы достигалась посредством ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе, при которой фермент элюировался при концентрации NaCl около 0,1 М. Рецепторно-активные ферменты, высвобожденные ферментом плазмы, отличались от активных фрагментов, полученных триптическим расщеплением, в отношении их поведения при ЖВХР хроматографии.

Было отмечено, что некоторые части фрагментов гормона роста, полученных триптическим расщеплением, были сходны с аминокислотной последовательностью β-казоморфина. Частичное аминокислотное секвенирование фрагментов гормона роста, полученных триптическим расщеплением, обнаружило, что один пептид содержал последовательность Тир-Сер-Фен-Лей-Глн.

Пример 2. Приготовление олигопептида настоящего изобретения.

Олигопептиды настоящего изобретения первоначально происходили от последовательности Тир-Сер-Фен-Лей-Глн, как отмечалось в примере 1. Было получено некоторое количество линейных и циклических пентапептидов общей структуры Тир-Х-Фен-Лей-Z с помощью методик, описанных в примерах 2.1-2.3.

Пример 2.1. Синтез Тир-Х-Фен-Лей-Глу (Х=Сер I, D - Ала II, Про III).

Для синтеза пептидов был использован стандартный твердофазный метод с применением синтезатора Beckman 990. Аминокислоты были приобретены у фирмы Bachem. Inc. , Калифорния. Фенольную группу тирозина защищали 2,6-дихлорбензилом, гидроксильную группу серина защищали бензилом и гамма-карбоксильную группу глутаминовой кислоты этерифицировали до циклогексилового эфира.

По завершении последнего цикла пептид извлекали из смолы и полностью удаляли защиту обработкой безводным жидким HF при 0^oC в течение 60 мин в присутствии анизола /30 мл HF и 3 мл анизола на 1 г смолы/. После удаления HF и тщательного высушивания в вакууме смолу отмывали эфиром и экстрагировали уксусной кислотой /10%/ и экстракты высушивали замораживанием. Сырой пептид очищали гель-фильтрацией на колонке с Fractogel TSKHW-40 или PGM 2000 с уксусной кислотой или трифторуксусной кислотой в качестве элюента. Конечный продукт получали в лиофилизированной форме. Гомогенность пептидов испытывалась посредством ТСХ /силикагель 60F-254 Merck; I н-бутиловый спирт/уксусная кислота/EtOAc/вода: 1/1/1/1; II пиридин /EtOAc/уксусная кислота/вода: 5/5/1/3; Х = Сер R_fI 0,74; R_fII 0,73/ и посредством аналитической жидкостной хроматографии быстрого разрешения /колонка: пеп.-хроматография с обращенной фазой, градиент A 0,1% ТФУ/вода; B 0,1% ТФУ/ацетонитрил/. Идентичность устанавливали аминокислотным анализом /6M HCl, 110^o, 24 ч/ и масс-спектрометрией, положит. FAB, выполненный на масс-спектрометре с двойной фокусировкой (Jeol. Япония/.

Пример 2.2. Синтез Тир-Сер-Фен-Лей-Глу-NH₂.

Этот пептид синтезировали на 4-метилбензилгидриламиновой смоле точно таким способом, который описан в примере 2.1. МБГА-смола /0,46 ммоль/ г, 1,74 г, Nova Biochem., Швейцария/ реагировала с Вос-Глу гаммациклогексиловым эфиром. Сырой продукт очищали посредством гель-фильтрации на колонке с Fractogel TSK HW-40 с 0,1% ТФУ в качестве элюента. ТСХ: R_f (I) 0,76, R_f (II) 0,79; аминокислотный анализ: Тир 0,99; Сер 0,99; Фен 1,01; Лей 1,00; Глу 0,99; FAB-MC^M/Z 657,2 [M + H]⁺.

Пример 2.3. Синтез Тир-цикло(-Лиз-Фен-Лей-Глу-).

Cинтез выполняли твердофазным способом на смоле из 4-алкоксибензолового спирта с применением стандартного протокола Fmoc. α-Аминофункциональные группы защищали фторенилметилоксикарбонильной группой, за исключением α-аминофункциональной группы Тир, которую защищали бензилоксикарбонильной группой. γ-Карбоксил Глу, ε-аминогруппу Лиз и фенольную группу Тир защищали бензилом, трет-бутилоксикарбонилом и бензилом соответственно. Пептид извлекали из смолы 50% трифторуксусной кислотой в дихлорметане, оставляли все группы защищенными, кроме ε-аминогруппы Лиз и α-карбоксильной группы Глу. Циклизацию проводили в ДМФ при концентрации пептида 0,1 мМ бензотриазол тетраметилурония гексафторфосфатом /ГБТУ/ и N-этилдиизопропиламином. Циклический пептид лишали защитных групп каталитической гидрогенизацией при атмосферном давлении в метаноле с 10% Pd на древесном угле в качестве катализатора. Пептид охарактеризовали с помощью аминокислотного анализа, жидостной хроматографии высокого разрешения и FAB мас-спектрометрией.

Пример 3. Изучение новых олигопептидов.

В первом исследовании с помощью описанных методик были синтезированы пептид Тир-Сер-Фен-Лей-Глн с заменой Глн на Глу, а также более короткий фрагмент Тир-Сер-Фен-Лей и использованы для изучения их связывания с μ- и δ-опиатными рецепторами.

Рецепторное исследование проводили согласно Zife Sci., т.16, 1975, стр. 1979, Z. Terenius и др., и Brain Res., т.259, 1983, стр.267-274, F.Nyberg и др. , с использованием синаптических мембран крысы, взятых из цельного мозга крысы без мозжечка, и ³H-меченного дигидроморфина в качестве конкурирующего радиолиганда. Каждое измерение включало калибровочную кривую с Met-энкефалином и связывающую активность испытуемых фракций выражали в эквивалентах Met-энкефалина.

В экспериментах, приведенных на фиг. 3 и 4 и в табл.1, в качестве радиолигандов при изучении связывания по Red.Peptides, т.34, 1991, стр.169-179, E-L. Glamsta и др. , использовали (³H)-(D-Ала², МеФен⁴,Гли-ол⁵)-энкефалин (D-АГО или D-АМГО) и (³H)-(D-Ала², D-Лей⁵)-энкефалин (D-АD-Л), приобретенные у Amersham (Букингемшир, Англия). D-АГО- или D-АМГО является лигандом μ-рецепторов, в то время как D-AD-Л является типичным агонистом δ-рецепторов.

Подсчитанные константы ингибирования перечислены в табл.1. Данные показывают, что пентапептидный фрагмент обладает большим сродством как к μ-, так и к δ-рецепторам по сравнению с более коротким фрагментом гормона роста. Активность Тир-Сер-Фен-Лей-Глу в отношении μ-рецепторов была такой же, как у β-казоморфина-5 /см.табл.1/.

Константы ингибирования (K_u), в табл. 1 определены как концентрация пептида, которая ведет к 50% блокированию меченого лиганда. В публикации " β-казоморфины и родственные пептиды", изд. F. Nyberg и др., стр.65-75, "Селективные пептиды -δ-антагонисты, аналоги экзорфина α-казеина, как пробные вещества для изучения опиатных рецепторов", S.Loukas и др. раскрываются различные ингибирующие пептиды и их активность в отношении опиатных рецепторов. В "Регуляторных пептидах", т.34, 1991, стр.169-179 (E-L, Glamsta и др.) раскрываются константы ингибирования для β-казоморфинов.

Таким образом, показано, что обработка трипсином гормона роста человека приводит к образованию фрагментов, способных взаимодействовать в опиатными рецепторами. Очевидно также, что плазма крови человека обладает протеолитической активностью, способной высвобождать из этого гормона пептиды, активные в отношении опиатных рецепторов, которые, если они проходят через гематоэнцефалический барьер, могут воздействовать на центральную нервную систему /ЦНС/. На практике, при клинической терапии гормонов роста наблюдали некоторые вторичные эффекты на ЦНС /не опубликовано/. Таким образом, можно предположить, что пептидные фрагменты, активные в отношении опиатных рецепторов, высвобождающиеся из гормона роста, могут достигать ЦНС и являться причиной этих эффектов.

Для тестов, приведенных в табл.2, приготавливали ряд новых пентапептидов и пептидов согласно примеру 2. Эти пептиды использовали как для тестов с рецепторами, так и для биологических исследований на электрически стимулированных срезах подвздошной кишки морской свинки. Исследования с рецепторами выполняли так же, как описано выше, с D-АМГО в качестве радиолиганда μ-рецепторов. В исследованиях с (³H)-D-АМГО специфическое связывание вытеснялось различными испытуемыми веществами (10^-5M-10^-10M/. Вычислялись концентрация меченого лиганда при 50% вытеснении, ИК₅₀/ингибирующая концентрация/, K_и и связывающая активность C_макс. с помощью компьютерной программы /Ligand, Biosoft, Кембридж, Соединенное Королевство/. В исследованиях с препаратами подвздошной кишки морской свинки использовали методики и материалы, раскрытие в Regul. Pept., т.34, 1991, стр. 169-179 /E-L, Glamsta и др./ и в The Hemorphins, Compr. Summaries of Uppsala Dissertations факультета фармакологии 108, Acta Unisers. Ups. Uppsala, 1993, E-L.Glamsta. Сравнительная величина активности в отношении стандартного соединения, норморфина, определялась в упомянутом исследовании.

Табл. 2 показывает, что олигопептиды настоящего изобретения обладают высоким связующим сродством в отношении μ- рецепторов. Следует отметить, что циклические олигопептиды обладают высоким сродством к этим рецепторам, а также высокой опиоидной активностью, предполагающей мощную агонистическую активность.

Линейные пентапептиды настоящего изобретения также обладают высоким сродством к рецепторам, но уменьшенной биологической активностью, о чем свидетельствуют результаты теста с препаратами подвздошной кишки морской свинки. Можно высказать в связи с этим предположение о том, что эти соединения являются частичными агонистами или функциональными антагонистами.

Различия величин константы ингибирования K_и пептида Тир-Сер-Фен-Лей-Гли в табл.1 и 2 можно отнести на счет различных аналитических материалов и методик. Однако относительные величины активности различных соединений в каждом измерении являются наиболее интересными и информативными.

Исследования показали поколение новых олигопептидов, первоначально полученных из триптических фрагментов гормона роста человека, которые обладают сродством к опиатным рецепторам и опиоидной активностью высокой мощности.

Эти новые соединения, следовательно, обладают высоким фармацевтическим потенциалом и дают возможность создавать новые тканево-избирательные лекарственные средства, обладающие активностью в отношении опиатных рецепторов, потенциально с сокращенными побочными эффектами.

Данные по связыванию были получены в результате экспериментов с ингибированием /двойное определение/ для определения параметра связывания посредством компьютерной программы EBDA/Ligand. Была выбрана одна модель для сайта /Тир-Про-Фен-Вал-Гли =β-казоморфин-5-человека/.

Линейные или циклические олигопептиды, имеющие первичную аминокислотную последовательность формулы I
Tyr-Х-Phe-Ley-Z,
где X и Z - аминокислоты или их производные, или их аналоги, в которых Х и Z могут быть ковалентно связаны, образуя гетероциклическую структуру.

Когда олигопептид линейный, Х-Ser, Gly, Pro, D-Ala, Z = Glu или его аминопроизводное, когда олигопептид циклический, Х - 2,4-диаминомасляная кислота, Lys, Cys, Orn, a Z = Glu или его аминопроизводное. Олигопептиды формулы I потенциально полезны в качестве анальгетиков для облегчения боли и повышения комфорта индивидуума. 2 c. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

1. Линейные или циклические олигопептиды, обладающие сродством к опиатным рецепторам, имеющие первичную аминокислотную последовательность формулы I
Tyr - X - Phe - Leu - Z,
где X и Z - аминокислоты или их производные, или их аналоги, в которых X и Z могут быть ковалентно связаны, образуя гетероциклическую структуру в соответствии со следующими условиями:
а) когда олигопептид является линейным, X выбирают из аминокислот Ser, Gly, Pro, D-Ala, а Z = Glu или его аминопроизводные;
б) когда олигопептид является циклическим, X выбирают из 2,4-диаминомасляной кислоты, Lys, Cys, Orn, в D- или L-форме, а Z = Glu или его аминопроизводные, или Cys, с тем условием, что если X = Cys, то и Z = Cys. 2. Линейные олигопептиды формулы I по п. 1, обладающие сродством к μ- и δ-опиатным рецепторам.

3 Линейные олигопептиды формулы I по п.1, представляющие собой Tyr - Ser - Phe - Leu - Glu; Tyr - Ser - Phe - Leu - Glu NH₂; Tyr - DAla - Phe - Leu - Glu; Tyr - Pro - Phe - Leu - Glu.

4. Циклические олигопептиды формулы I по п.1, представляющие собой

5. Фармацевтическая композиция, обладающая сродством к опиатным рецепторам и включающая активный ингредиент и подходящие носители и/или растворители, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного ингредиента по крайней мере один из олигопептидов по пп.1 - 4 в эффективном количестве.